INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail

Transkript

1 INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail BEREGNET ANVENDELSE INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail er designet til kvantitativ detektion af amplifikation vha. lysmikroskopi af HER2-genet via kromogen in situ-hybridisering (ISH) med to farver i formalinfikserede, paraffinindstøbte vævsprøver af human brystcancer og gastrisk cancer, inklusive den gastro-esophageale grænsezone efter farvning på Ventanas automatiske farvningsinstrumenter til objektglas. INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail er indiceret som et hjælpemiddel ved vurderingen af patienter med brystcancer og gastrisk cancer, for hvem behandling med HERCEPTIN (trastuzumab) overvejes, og for brystcancerpatienter, for hvem behandling med KADCYLA (trastuzumab-emtansin (T-DM1)) overvejes. Dette produkt skal fortolkes af en kvalificeret patolog sammenholdt med histologisk undersøgelse, relevante kliniske oplysninger og egnede kontroller. Dette produkt er beregnet til in vitro-diagnostisk (IVD) brug. SAMMENDRAG OG FORKLARING HER2/neu (HER2) er medlem af familien af fire transmembrane receptor tyrosin-kinaser, som fremmer cellers vækst, differentiering og overlevelse. 1,2 HER2-genet afkoder HER2- proteinet, 2,3, og overudtrykkelse af HER2-proteinet, amplifikation af HER2-genet eller begge forekommer i ca. 15 til 25 procent af brystkræft og er associeret med aggressiv udvikling af tumor. 4,5 INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail indeholder en HER2 probe (mærket med hapten dinitrophenyl eller DNP) og en Chromosome 17 probe (mærket med hapten digoxigenin eller DIG) formuleret med humant placentablokerings- DNA i en formamidbaseret buffer. Proberne er beregnet til at detektere amplifikation af HER2-genet i bryst- og gastrisk karcinom. HER2 DNA-proben dækker ca basepar langs genregionen, der indeholder HER2-genet (også kendt som ERBB2 og NEU), som er placeret på det humane Chromosome 17 (17q11.2-q21). Chromosome 17 probe dækker alfa-satellitsekvenser inden for den centromere region og anvendes som reference for aneusomi. Kopiantal af begge prober optælles i tumorkerner, resultaterne rapporteres som et forhold mellem HER2/Chromosome 17 (HER2/Chr17) for at fastlægge HER2-amplifikationsstatus (forhold HER2/Chr17 2,0 er amplificeret, mens et forhold < 2,0 er ikke-amplificeret). I mange kliniske undersøgelser har amplifikation og/eller overudtrykkelse af HER2 vist sig at være associeret med et dårligt klinisk resultat for kvinder med invasiv brystkræft, og korreleret med flere negative prognostiske variabler, inklusiv negativ status for estrogen receptor (ER), høj S-fase fraktion, positiv nodal status, muteret p53 og højt udviklingsstadium af kernen. 6,7 I flere undersøgelser blev det påvist, at patienter med invasiv brystkræft (både med og uden knuder) med en amplificeret HER2-genstatus, udviste generelt nedsat overlevelse og en højere frekvens af recidiv. 1,8,9,10,11 Resultater fra kliniske undersøgelser, der målte HER2-proteinets overudtrykkelse med immunhistokemi, var lig med de resultater, der blev opnået ved HER2- genamplifikation. 9,11,12,13 Viden om HER2-gen og/eller proteinstatus i patienter med invasiv brystkræft hjælper klinikeren til at tage mere velinformerede beslutninger for at forbedre den generelle behandling af patienter med brystkræft. Trastuzumab (HERCEPTIN) er et humaniseret monoklonalt antistof mod det ekstracellulære domæne for HER2 og er blevet påvist at være til fordel for patienter med HER2-positiv brystkræft Påvisning af HER2-genamplifikation og/eller proteinoverudtrykkelse er væsentlig i forbindelse med valg af patienter til behandling med trastuzumab. Kliniske undersøgelser har vist, at patienter med brystkræft med høj overudtrykkelse af HER2-protein og/eller genamplifikation drager mest fordel af trastuzumab. 20 Påvisning af HER2-genamplifikation og/eller overudtrykkelse af protein er nødvendig for patienter med invasiv brystkræft, som det overvejes at behandle med trastuzumab, og når det er klinisk indikeret. En procentdel af gastriske patienter udviser HER2-genamplifikation og kan have fordel af behandling med HERCEPTIN. 21 Farvningsprotokollen, der anbefales i INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktailanalysen, retningslinjerne for fejlfinding og scoringsalgoritmen gælder både for bryst- og gastriske karcinompræparater. PROCEDURENS PRINCIP INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail er optimalt formuleret til brug med Ventana ultraview SISH DNP Detection Kit, Ventana ultraview Red ISH DIG Detection Kit og ekstra reagenser på Ventana-apparater til automatiseret farvning af objektglas. Under farvningsprocessen med Dual in situ-hybridisering (Dual ISH), co-hybridiseres DNP- og DIG-mærkede prober i forhold til deres respektive specifikke mål-dna-sekvenser i cellekernerne. Detektion af den DNP-mærkede HER2 probe sker først vha. ultraview SISH DNP Detection Kit, der indeholder følgende dispensere: En Rabbit anti-dnp Monoclonal Antibody, Multimer-opløsning, der indeholder et goat anti-rabbit secondary antibody, der er konjugeret til horseradish peroxidase (HRP), Silver ISH DNP Chromogen A (Silver A), Silver ISH DNP Chromogen B (Silver B) og Silver ISH DNP Chromogen C (Silver C). Efter inkubation med primært Rabbit anti-dnp Antibody og derefter sekundært goat anti-rabbit HRP-antistofkonjugat forekommer SISH-reaktionen (Silver in situhybridisering). Kort beskrevet drives denne reaktion af sekventiel tilsætning af Silver A (sølvacetat), Silver B (hydroquinon) og Silver C (H2O2). Her er sølvionerne (Ag+) reduceret af hydroquinon til metalliske sølvatomer (Ag0). Denne reaktion får næring fra substratet for HRP, hydrogenperoxid (Silver C). Sølvudfældningen aflejres i kernerne og en enkelt kopi af HER2-genet visualiseres som et sort signal. Figur 1 illustrerer SISHreaktionen. Efter SISH-detektion for HER2 detekteres den DIG-mærkede Chromosome 17 probe vha. ultraview Red ISH DIG Detection Kit. Dette kit indeholder følgende dispensere: En mouse anti-dig monoclonal antibody, Red ISH Multimer-opløsning, der indeholder et goat antimouse IgG antibody, der er konjugeret til Alkaline Phosphatase (AP), ph Enhancer, Naphthol og Fast Red. Efter udvikling af SISH-signalet inkuberes objektglasset med mouse anti-dig antibody, der binder DIG-hapten på Chromosome 17 proben. Anti-hapten primary antibody detekteres med Multimer-opløsning (goat anti-mouse IgG konjugeret til AP-enzym). Objektglasset inkuberes med ph Enhancer-opløsningen, som tilfører de rigtige saltkomponenter/-koncentrationer og buffered ph for optimal AP-enzymfunktion. Derefter tilsættes naphtholfosfat, der fungerer som substratet for AP-enzymet (AP defosforyleret naphthol). Fast Red, der derefter tilsættes til objektglasset, kombineres med det defosforylerede naphthol, så det danner en rød udfældning, der nemt visualiseres ved lysmikroskopi. Figur 2 illustrerer Red ISH-reaktionen. Præparatet kontrastfarves med Hematoxylin II for fortolkning under lysmikroskopi. Rabbit anti-dnp Antibody 17q11.2-q21 Black Signal DNP Figur 1. SISH-reaktion for HER2-detektion N H NO 2 HRP Silver A Silver B Silver C Goat anti-rabbit Antibody NO 2 HER2 DNA Probe (DNP-labeled) / DA Rev C

2 Goat anti-mouse Antibody Chromosome 17 Centromere Region Red Signal DIG AP ph Enhancer Naphthol Fast Red Mouse anti-dig Antibody Chr17 DNA Probe (DIG-labeled) 11. VENTANA EZ Prep Concentrate (10X) (REF ) 12. VENTANA Cell Conditioning Solution (CC2) (REF ) 13. VENTANA ULTRA Cell Conditioning Solution (ULTRA CC2) (REF ) 14. VENTANA LCS (Predilute) (REF ) 15. VENTANA ULTRA LCS (Predilute) (REF ) 16. VENTANA BenchMark Series-apparat til automatiseret farvning af objektglas 17. Stregkodeetiketter 18. Superfrost Plus mikroskop-objektglas (VWR REF eller tilsvarende) 19. Xylen (til histologisk brug) 20. Deioniseret eller destilleret vand 21. Permanent monteringsmedie (Permount Fisher Cat. No. SP eller lignende)** 22. Dækglas (tilstrækkeligt til at dække væv, såsom VWR Cat. No eller lignende) 23. Automatiske dækglas (såsom TissueTek SCA automatiske dækglas). 24. Farvningskar eller -bade 25. Stopur 26. Lysmikroskop 27. VENTANA HER2 Dual ISH 3-in-1 Xenograft Slides (REF ) kan bruges til fejlfindingsaktiviteter efter behov. *Kræves til bestemte anvendelser. **Se Tabel 11 for at få oplysninger om monteringsmedier, der er kompatible med denne analyse. Figur 2. Red ISH-reaktion for Chromosome 17-detektion. Hvert trin i den automatiserede farveprotokol omfatter inkubering af objektglasset med det specifikke reagens, der kræves, ved en præcis tid og temperatur. Ved slutningen af hvert inkuberingstrin bliver snittene skyllet af Ventanas automatiske farvningsinstrument til objektglas for at stoppe reaktionen og fjerne ubundet materiale. For at minimere fordampning af vandholdige reagenser fra objektglasset bliver der tilføjet en coverslipopløsning af det automatiske farvningssystem ved hvert trin. Se brugervejledningen til det relevante Ventana automatiske farvningssystem for at få yderligere oplysninger om brug af apparatet. LEVERET REAGENS INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail indeholder tilstrækkelig reagens til 50 test. Én 10 ml dispenser med INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail indeholder ca. 12 µg/ml HER2 probe, mærket med dinitrophenol (DNP), og 1 μg/ml Chromosome 17 probe, mærket med digoxigenin (DIG) og formuleret med human placentablokerings- DNA i en formamidbaseret hybridiseringsbuffer. Begge prober bruges til at fastsætte HER2-genstatus (dvs. forhold af HER2/Chr17). Se indlægssedlen til det relevante VENTANA-detektionskit vedrørende detaljerede beskrivelser af: (1) Principper for proceduren, (2) Nødvendige materialer og reagenser, som ikke medfølger, (3) Prøvetagning og forberedelse til analyse, (4) Metoder til kvalitetskontrol, (5) Fejlfinding, (6) Fortolkning af resultater og (7) Generelle begrænsninger. NØDVENDIGE MATERIALER, SOM IKKE MEDFØLGER Farvningsreagenser, f.eks. VENTANA-detektionskit og -tilbehørskomponenter medfølger ikke. Det er ikke alle produkter, der er nævnt i indlægssedlen, som kan fås i alle geografiske områder. Spørg din lokale supportrepræsentant. 1. VENTANA ultraview SISH DNP Detection Kit (REF ) 2. VENTANA ultraview Red ISH DIG Detection Kit (REF ) 3. VENTANA HybReady Solution (REF ) 4. VENTANA ultraview Silver Wash II (REF eller tilsvarende) 5. VENTANA ISH Protease 2 (REF )* 6. VENTANA ISH Protease 3 (REF )* 7. VENTANA Hematoxylin II (REF )* 8. VENTANA Bluing Reagent (REF )* 9. VENTANA Reaction Buffer Concentrate (10X) (REF ) 10. VENTANA 10X SSC (REF ) OPBEVARING Reagenserne skal opbevares ved 2-8 C efter modtagelsen, og når de ikke anvendes. Må ikke fryses. For at sikre korrekt reagenstilførsel og probens stabilitet skal kapslen sættes på dispenseren igen efter hver brug, og dispenseren skal med det samme stilles i køleskabet i oprejst position. Alle probedispensere er mærket med udløbsdato. Ved korrekt opbevaring er reagenset stabilt indtil den dato, der er angivet på etiketten. Brug ikke reagenset efter udløbsdatoen. KLARGØRING AF PRÆPARATER Rutinemæssigt behandlede, formalinfikserede og paraffinindstøbte væv er egnede til brug med denne probe, når den anvendes med BenchMark IHC/ISH-instrumenter. Hvert snit skal skæres i den passende tykkelse (ca. 4 µm) og placeres på et Superfrost Plusobjektglas (eller tilsvarende). Det anbefalede vævsfiksativ er 10 % neutral bufferformalin (NBF). 22 Se Tabel 1 for at få vist en liste over anbefalede fiksativer og fiksativer, der er inkompatible med denne probe. Hvis du har spørgsmål angående anbefalede fiksativer, bedes du kontakte din lokale supportrepræsentant. Tabel 1. Anbefalede og inkompatible fiksativer. Anbefalede fiksativer Neutral Buffered Formalin (NBF) Zinkformalin Alkohol-formalin PREFER-fiksativ Inkompatible fiksativer Bouin s Alkohol-formalin eddikesyre (AFA) Præparater, fikseret > 6 timer med AFA eller Bouin s fiksativer, resulterer i svag eller fraværende farvning. 23 Bortset fra Ventana-analyser har nyere undersøgelser vist, at størstedelen af tvetydige HER2-genresultater fra FISH relaterer til føranalytiske faktorer, herunder under- og over-fiksering, 24 såvel som forsinket fiksering. 25 Nøje implementering af fikseringsprocedurer (f.eks. en dedikeret processor for at sikre fiksering på minimum 6 timer) resulterede i en reduktion på 64 % i tvetydige tilfælde fra en fejlprocent på 10,8 % til 3,4 %. Præparater, der er fikseret < 6 timer i formalin, kan resultere i signaltab og nukleær overfordøjelse, som observeret af bleg/svag hæmatoxylin-farvning. Snit tykkere end 4 µm kan kræve kraftigere behandling af protease end under anbefalede forhold og kan fremvise mere nukleær bobledannelse end tyndere snit på grund af for meget paraffin i vævet. Nukleær bobledannelse fremgår som små eller store bobler og septum i cellekerner. Ofte, når der forekommer nukleær bobledannelse, er der en lang række effekter på SISH- og Red ISH-signaler, som er karakteriseret ved 1) cellekerner med nukleære bobler, hvori SISH- og Red ISH-signaler generelt stadig er centralt placeret i cellekernen og 2) cellekerner med nukleære bobler, der skubber SISH- og Red ISH / DA Rev C

3 signalerne til periferien. I begge tilfælde kan tilfældet ofte scores, hvis SISH- og Red ISHsignalerne er lette at skelne, ikke på anden vis er forvrængede og stadig kan tælles. Dog kan svær nukleær bobledannelse forvrænge SISH- og Red ISH-signalerne eller gøre dem umærkelige, så nøjagtig tælling ikke er mulig. Dette sker hyppigere, når SISH- og Red ISH-signaler skubbes til den nukleære periferi. Når det sker, kan man ofte finde cellekerner andre steder i prøven, som kan tælles, og tilfældet kan scores. Hvis den nukleære bobledannelse er kraftig i en sådan grad, at der ikke kan findes tilstrækkelige cellekerner, hvori SISH- og Red ISH-signaler kan tælles med sikkerhed, kan tilfældet ikke scores. Det kan være nødvendigt at afparaffinere disse præparater i alkohol- eller xylenbade inden farvning på instrumentet, eller brugeren kan vælge funktionen udvidet afparaffinering under farvningen (se Fejlfinding). Nukleær bobledannelse kan også forekomme i forbindelse med underfiksering (1-3 timer med formalin), hvilket er en mindre diskret nukleær bobledannelse. Dette kan udbedres ved 3 timers fiksering med ændret celleforbehandling/behandling af protease, med ved 1 time er det sandsynligvis for sent med udbedring. INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail-analysen er blevet udviklet med yderligere forbehandlingsmuligheder, som kan hjælpe med til at optimere analysen i forskellige laboratorier og ved efterfølgende fejlfinding af bestemte væv/objektglas, der viser underoptimal farvning. Ventana anbefaler, at hvert laboratorium foretager første kørsler på typiske cervikale vævskontrolprøver, der er blevet klargjort under samme forhold som de kliniske prøver, der skal undersøges. Dette vil hjælpe til med at optimere de specifikke farvningsforhold for de individuelle laboratorier, som kan variere i deres eksakte procedurer for klargøring af præparater. Variable resultater kan opstå med forskellige foranalytiske faktorer i forhold til de anbefalede. Præparater, der er blevet foranalytisk klargjort ved hjælp af betingelser, der ikke anbefales af Ventana, bliver muligvis aldrig farvet korrekt med undersøgelsen. ADVARSLER OG FORSIGTIGHEDSREGLER 1. Til in vitro-diagnostisk (IVD) brug. 2. Kun til professionel anvendelse. 3. Advarsel - Produktet indeholder formamid. Formamid er giftigt ved indånding og moderat giftigt ved indtagelse. Det er irriterende for hud, øjne og slimhinder, og det absorberes gennem huden. Det kan forårsage fosterskader. Tag forholdsregler ved håndtering af reagenser. Brug engangshandsker, og brug egnet beskyttelsesdragt ved håndtering af toksiske materialer eller stoffer, der er mistænkt for at være kræftfremkaldende. 4. Sørg for, at spildbeholderen er tom, inden kørslen på instrumentet begyndes. Hvis denne forholdsregel ikke tages, kan spildbeholderen flyde over, og brugeren kan risikere at glide og falde. 5. Materialer af human eller animalsk oprindelse skal håndteres som potentielt biologisk risikomateriale og bortskaffes under overholdelse af relevante forholdsregler. 6. Undgå, at reagenser kommer i berøring med øjne, hud og slimhinder. Hvis reagenserne kommer i berøring med følsomme områder, skal der skylles med rigelige mængder vand. Undgå at indånde reagenser. 7. Undgå mikrobiel forurening af reagenser, da det kan producere ukorrekte resultater. 8. Konsultér lokale og/eller statslige myndigheder angående anbefalede metoder til bortskaffelse. 9. Der findes yderligere sikkerhedsoplysninger i sikkerhedsdatabladet og vejledningen for symboler og risici på FARVNINGSPROCEDURE VENTANAs reagenser er udviklet til brug på VENTANAs automatiske farvningsinstrumenter til objektglas i forbindelse med VENTANA-detektionskit og -tilbehør. Parametrene for de automatiserede procedurer kan vises, udskrives og redigeres ifølge den fremgangsmåde, der er beskrevet i instrumentets brugervejledning. Andre driftsparametre for det automatiske farvningssystem er indstillet på forhånd fra fabrikken. Den anbefalede farvningsprotokol for hver instrumentplatform er angivet i Tabel 2. Se den relevante indlægsseddel for VENTANA-detektionskit for at få flere oplysninger om farvningsprocedurer med in situ-hybridisering (ISH). Tabel 2. Anbefalet farvningsprotokol for INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail på automatiske VENTANA BenchMark Series-farvningssystemer. Trin for procedure der kan vælges Anbefalet farvningsprotokol for BenchMark og BenchMark XT Anbefalet farvningsprotokol for BenchMark ULTRA Bagetemperatur - Vælg 63 ºC Bagetid - 20 min Afparaffinering Valgt Vælg 72 ºC Extended Depar* Ikke valgt Ikke valgt Cell Conditioning ISH-Protease 3 Valgt Cell Conditioning CC2 Mild CC2 8 min Standard CC2 12 min Forlænget CC2 8 min 16 min (væv) 8 min (Xenografts) Valgt Cell Conditioning CC2 86 ºC Mild CC2 8 min Standard CC2 12 min Forlænget CC2 8 min 16 min (væv) 8 min (Xenografts) Denaturering 20 min 20 min Hybridisering 6 timer 6 timer Stringent vask 72 C (humant væv) 76 C (Xenografts) 72 C (humant væv) 76 C (Xenografts) SISH Multimer 16 min 32 min Silver Chromogen 4 min 4 min Red ISH Multimer 24 min 24 min Red Chromogen 8 min 8 min Kontrastfarvning Hematoxylin II 8 min. Hematoxylin II 8 min. Postkontrastfarvning Bluing Reagent - 4 min. Bluing Reagent - 4 min. * Indstillingen Extended Depar er beregnet til afhjælpning af kraftig nukleær bobledannelse på grund af for meget paraffin. På grund af variationer i vævsfiksering og -behandling og generelle forhold vedr. laboratorieinstrumenter og miljø kan det være nødvendigt at øge eller mindske probehybridiseringen, celleforbehandlingen eller proteaseforbehandlingen baseret på individuelle præparater, den anvendte detektion og læserpræferencen. Sådan startes en kørsel på BenchMark Series af apparater til automatiseret farvning af objektglas 1. Påfør objektglassets stregkodeetiket, der svarer til den probeprotokol, der skal udføres. Centrér objektglasmærkat uden overhæng. Undgå dobbelt mærkning eller genpåsætning af objektglasetiket. Der skal anvendes klar overlejring med VENTANA VANTAGE-arbejdsopløsningsmærkater. 2. Sæt INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail, reagenser fra ultraview Red ISH DIG- og ultraview SISH DNP Detection Kits samt påkrævede tilbehørsreagenser i reagensbakkerne. Placér reagensbakke(r) på den automatiske objektglasfarver. Kontrollér partivæsker og affald. 3. Partiflaskerne med reaktionsbuffer skal være fulde. 4. Spildbeholderen skal være tom, før kørslen startes. 5. Sæt objektglassene i det automatiske farvningssystem. 6. Start farvningskørslen. 7. Når kørslen er afsluttet, fjernes glassene fra det automatiske farvningssystem. 8. Fortsæt med dehydreringsproceduren. Dehydreringsprocedure Bemærk: Fast Red-kromogenet er opløseligt i alkohol og acetone. Brug ikke alkohol- eller acetonebade til at dehydrere objektglas, fordi det røde signal vil blive påvirket. 1. For at fjerne den flydende coverslip-opløsning skal objektglassene vaskes i 2 sekventielle opløsninger af et mildt opvaskemiddel (der må ikke bruges opvaskemidler, som er udviklet til automatiske opvaskemaskiner) / DA Rev C

4 2. Skyl objektglassene grundigt med destilleret vand i ca. 1 minut. Ryst overskydende vand af. 3. Placér objektglassene i en ovn (45-60 C), og lad dem tørre eller lufttørre ved omgivelsestemperatur. I en ovn varer tørretiden fra 10 minutter til en time. Sørg for, at objektglassene er helt tørre, før der sættes dækglas på. 4. Overfør objektglassene til et xylen-bad i ca. 30 sekunder. 5. Sæt dækglas på objektglasset. Bemærk, at nogle monteringsmedier ikke er kompatible med analysen (se afsnittene Begrænsninger og Fejlfinding). METODER TIL KVALITETSKONTROL Positivt kontrolpræparat HER2- og Chromosome 17-sekvenser findes i hver eneste celle i den menneskelige krop. De fungerer dermed som interne positive kontroller i hver vævsprøve og skal være synlige (1 til 2 signaler pr. celle) i normale (ikke-neoplastiske) celler i og omkring målkarcinomområdet. Dog vil ikke alle celler udvise en enkelt kopi af genet på grund af biologisk heterogenicitet og fra vævsudskæring. Specifik kernefarvning kan være lokaliseret i forskellige celler, inklusiv: stromale fibroblaster, endotelceller, lymfocytter og ikke-neoplastiske celler. Hvis de positive kontroller ikke viser positiv farvning, kan dette indikere et reagens- eller instrumentproblem. Da hvert præparat har en intern positiv kontrol (dvs. passende SISH-farvning i normale celler) gælder dette som den virkelige positive kontrol. En laboratoriespecifik positiv præparatkontrol kan om ønsket køres sammen med hver farvningsprocedure, der udføres. Kontrolpræparater skal være præparater, der er klargjort på en måde, der er identisk med patientens præparater. Sådanne kontroller skal anvendes til kontrol af alle procedurens trin fra klargøring af præparat til og med farvning. Xenograft-præparat HER2 Dual ISH 3-in-1 Xenograft Slides bruges til foreløbig validering og fejlfindingsaktiviteter, der er forbundet med INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail. De indeholder tre forskellige xenograft-snit, der er formalinfikserede og indstøbte i en enkelt paraffinblok. Xenograft-snittene er blevet valgt, fordi de er udførligt beskrevet i den videnskabelige litteratur for HER2-proteinniveauer og genkopiantal. Positiv reagenskontrol En positiv reagenskontrol bør køres under analyseverifikation og fejlfinding, eftersom DNA-tilgængelighed kan variere afhængigt af fikseringsmetode og præparatforbehandling. INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail kan bruges som en positiv kontrol til denne analyse, da alle normale celler i den menneskelige krop indeholder én eller to kopier af HER2 og Chromosome 17. En negativ reagenskontrol er ikke påkrævet, fordi interne positive kontroller er tilstrækkelige. Uforklarede uoverensstemmelser Uforklarede uoverensstemmelser i kontrolresultaterne skal omgående videresendes til den lokale supportrepræsentant. Hvis resultaterne af kvalitetskontrollen ikke overholder specifikationerne, er patientresultaterne ugyldige. Se afsnittet Fejlfinding i denne indlægsseddel. Identificer og korriger problemet, og gentag derefter patientprøverne. Verifikation af analyse Inden reagenset bruges første gang i en diagnostisk procedure, skal reagensets ydeevne verificeres ved at teste den på en serie af præparater med kendte ISHydeevnekarakteristika, som for eksempel VENTANA HER2 Dual ISH 3-in-1 Xenograft Slides (se de kvalitetskontrolprocedurer, der er beskrevet ovenfor i dette afsnit af indlægssedlen). Disse kvalitetskontrolprocedurer skal gentages for hver ny lot reagenser, eller når analyseparametrene ændres. FORTOLKNING AF RESULTATER Kontrollerne skal evalueres af en kvalificeret læser med erfaring i mikroskopisk fortolkning af anatomiske patologiprøver, ISH-procedurer og påvisningen af enkelte og amplificerede HER2-kopier (hvilket kræver mikroskopisk undersøgelse med objektiver på 20X, 40X og/eller 60X), inden resultaterne fortolkes. Bemærk: Brug af 100X objektiv anbefales ikke. Al designverificering og test af gyldighed blev foretaget ved brug af 20X, 40X og/eller 60X objektiver. I de følgende afsnit beskrives, hvordan objektglas fortolkes og scores. Tabel 3 illustrerer, hvordan diskrete signaler tælles. Definitioner 1. HER2-genstatus. HER2-genstatus er en funktion af forholdet mellem gennemsnitsantallet af kopier af HER2-genet og gennemsnitsantallet af kopier af Chromosome 17 (Chr17), per celle, i et invasivt brystkarcinom eller gastrisk karcinom. HER2-genstatus klassificeres efter følgende retningslinjer: a. HER2/Chr17-forhold 2,0 er amplificeret b. HER2/Chr17-forhold < 2,0 er ikke-amplificeret 2. Krav til objektglas. Et individuelt objektglas, der er farvet med INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail, skal tilfredsstille to kriterier for at kunne skønnes tilstrækkeligt til tælling. Hvis objektglasset ikke opfylder disse kriterier, kan det ikke optælles, og resultatet er utilfredsstillende. a. Intern positiv kontrol. Normale signaler for HER2 (SISH) og Chr17 (Red ISH) (1 til 2 kopier per celle) fungerer som interne, positive kontroller og skal være synlige i prøven. Denne kernefarvning kan være lokaliseret i forskellige ikkeneoplastiske celler, inklusiv: stromale fibroblaster, endotelceller, lymfocytter og ikke-neoplastiske celler. Ikke alle celler på objektglasset vil blive farvet for begge prober, men normale celler i og/eller omkring målet skal farves korrekt. b. Karcinomceller. Karcinommålområdet skal udvise et tælleligt felt af SISH- og Red ISH-signaler med 20X, 40X og/eller 60X objektiver. 3. Målområder for signaltælling. Et acceptabelt målområde inden for det invasive karcinom udviser et tælleligt felt af SISH- og Red ISH-signaler. Der må ikke udføres signaltælling i områder der indeholder svage SISH- og/eller Red ISH-signaler, komprimerede eller overlappende kerner, eller nekrose. Cellekerner med for meget SISH- eller Red ISH-baggrund, der forstyrrer evnen til at optælle specifikke signaler, bør ikke tælles. Hvis et målområde skønnes utilstrækkeligt til optælling er det ofte muligt at finde andre målområder på samme glas, der er tilstrækkelige. Dette kan bestemmes ved tilstedeværelsen af normale celler, der udviser tilstrækkelig SISHeller Red ISH-farvning i eller i umiddelbar nærhed af målområdet. Yderligere observationer for HER2 og Chromosome 17 Andre observationer kan noteres som kommentarer i patologens rapport. 1. Heterogenicitet: I nogle tilfælde kan vævet indeholde områder af karcinom, der er genetisk heterogent for HER2-kopiantal (dvs. der kan forekomme en blanding af ikke-amplificerede og amplificerede kerner, eller en blanding af amplificerede kerner, der indeholder forskellige kopier af HER2). Dette kan observeres blandt karcinomcellerne inden for selve målområdet eller mellem to forskellige målområder. 2. Aneusomi er enhver tilstand, hvor en organisme har ekstra eller færre specifikke kromosomer end normalt, dvs. antallet af et bestemt kromosom (i dette tilfælde Chromosome 17) er ikke diploid. I polysomi kan der være tre eller flere kopier af kromosomet i modsætning til de forventede to kopier. I monosomi kan tumorcellerne kun udvise én kopi af Chromosome 17. Der er blevet rapporteret tilsyneladende amplifikationsklynger eller polysomi af Chromosome 17 (med eller uden HER2 SISH-klynger). 26 I tilfælde med klynger af HER2 og Chromosome 17, skal der sørges for ikke at overveje dem med et forhold på ~1,0. Læseren skal henvise til IHC for analyser af HER2-proteinoverudtrykkelse i disse tilfælde, da hovedparten tenderer til at være Monoallel sletning: Sletningen af HER2-genet fra Chromosome 17 i tumorcelleresultaterne i en HER2/Chr17-forhold < 1,0. Signalvisualisering og objektglasnøjagtighed SISH- og Red ISH-signaler visualiseres som: 1. Enkelt kopi. Et diskret sort (SISH) eller rødt signal (Red ISH) tælles som en enkelt kopi af hhv. HER2 eller Chr17. For SISH (sort) repræsenterer diskrete enkelte signaler, der visualiseres i de interne, fysiologiske positive kontrolkerner (ikke-neoplastiske) på samme objektglas, størrelsen af en enkelt kopi i invasive karcinomceller. For Red ISH-signaler tælles hvert diskrete signal som én kopi. Det skal bemærkes, at Red ISH-signalet fra Chromosome 17-DIG proben kan forekomme større end SISH-signalerne og nogle gange forlænget i form og kan variere i størrelse inden for et målområde og på tværs af prøver. SISH-signaler kan forekomme betydeligt mindre end Red ISH-signaler. Dog kræves ingen minimal signalstørrelse, og alle diskrete signaler skal tælles. SISH-stænk eller rød tåge kan forekomme og bør ikke forveksles med et signal. Røde signaler kan være meget lyse i farve sammenlignet med signalet i interne, positive kontrolkerner, og det overordnede farvningsmønster bør ikke optælles, da de kan være ikke-specifikke. Se afsnittet Fejlfinding for at få anbefalinger, hvis der observeres SISH-stænk / DA Rev C

5 2. Flere kopier. Diskrete enkelte SISH-signaler, der visualiseres i de interne positive kontrolkerner, repræsenterer størrelsen af en enkelt kopi af HER2 i invasive karcinomceller. De enkelte SISH-signalers størrelse bruges som reference til at fastlægge det relative antal af amplificerede kopier i cancerkernerne. For Red ISH tælles hvert diskrete signal som én kopi. 3. Klynger. En klynge er defineret som adskillige overlappende SISH-signaler i kernen, som ikke kan skelnes individuelt. Klynger af HER2 kan kun anslås af læseren. For eksempel kan en stor klynge af flere SISH-signaler anslås som 12 kopier, mens mindre klynger kan anslås som 6 kopier. Vurderingen foretages ved at bruge de enkelte SISH-kopier, der findes i de interne, positive kontrolceller som reference. Tilstedeværelsen af HER2-klynger er angivet på scoringsarket. 4. Overlappende kerner, kerner med kun én farve til stedet, og prøver med ikkespecifik farvning skal ikke optælles. Enhver kerne med overlappende Red ISH- og SISH-signaler, som ikke kan skelnes, skal visualiseres ved højere forstørrelser for at skelne de to signaler, eller skal ikke tælles. Kerner, der forekommer med bobledannelse i den udstrækning, at signalfortolkningen er kompromitteret, bør ikke tælles. Optælling af SISH- og Red ISH-signaler for at bestemme HER2-genstatus Før optælling af HER2- og Chromosome 17-signaler for at bestemme HER2-genstatus er det kritisk at bestemme, om det invasive målområde (læsionsvævet) er tilstrækkeligt farvet og opfylder de kriterier, der er beskrevet for objektglasnøjagtighed (se afsnittet Definitioner ovenfor, 2. Objektglasnøjagtighed). Ventana har udviklet en scoringsalgoritme for analysen, der optimerer præcision og effektivitet i optællingen. Tyve kerner, der hver indeholder røde (Red ISH) og sorte (SISH) signaler, skal optælles. De endelige resultater for HER2-status rapporteres på grundlag af det forhold, der dannes ved at dividere summen af HER2-signaler for alle 20 kerner, der er divideret med summen af Chromosome 17-signaler for alle 20 kerner. Amplifikationsstatus er defineret som amplificeret, hvis HER2/Chr17-forhold 2,0 og som ikke-amplificeret, hvis HER2/Chr17-forhold < 2,0. Hvis HER2/Chr17-forholdet falder til mellem 1,8 til 2,2 (inklusive), skal der optælles yderligere 20 kerner. Der skal derefter dannes et nyt forhold på grundlag af alle 40 kerner og den rapporterede amplifikationsstatus, som allerede beskrevet. Kriterier for cellevalg Tæl kun kerner med diametre, der er repræsentative for den gennemsnitlige population af invasive karcinomceller i målområdet. Tæl ikke signaler i kerner, der er: 1. Meget større i diameter end den gennemsnitlige størrelse af karcinomkerner 2. Meget mindre i diameter end den gennemsnitlige størrelse af karcinomkerner I målområder, der er genetisk heterogene for HER2-kopiantal, skal der kun tælles kerner, der er repræsentative for populationen af invasive karcinomkerner med det højeste gennemsnitlige antal signaler. Bemærk, at heterogenicitet er angivet på scoringsarket. Tabel 3. Signalvisualisering for INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail. Tæl ikke, hvis kerner overlapper. Tæl ikke, hvis der intet signal er. Tæl som 2 sorte (HER2) og 2 røde (Chr17) signaler. Tæl som 1 sort (HER2) signal og 2 røde (Chr17) signaler. Det sorte signal er en dublet. Tæl kun to tilstødende signaler af samme farve, hvis afstanden mellem signalerne er lig med eller større end diameteren af et enkelt signal. Små SISH-klynger kan kun vurderes ved at bruge størrelsen af et enkelt signal som reference og bruge stromale celler til at vurdere signalstørrelse (mindre celler til venstre). Denne klynge kunne f.eks. vurderes som 6 SISH-signaler tilføjelse af de andre 2 enkeltsignaler giver en samlet tælling på 8. Tæl som 2 røde signaler. Bemærkning på scoringsark om, at der findes klynger for HER2. Vurdér den store klynge. Her kan klyngen vurderes som 12 sorte signaler. Tilføjelse af de andre 4 enkeltsignaler giver en samlet tælling på 16. Tæl røde signaler som 2 kopier af Chromosome 17. Bemærkning på scoringsark om, at der findes klynger for HER2. Et rødt signal tæt på det sorte signal bør tælles som ét rødt signal og ét sort signal. Dette kan kræve optælling med objektiver på 60x for at skelne. Tæl derfor som 4 sorte og 2 røde signaler. Hvis der ikke kan skelnes mellem overlappende signaler, må den pågældende kerne ikke tælles. Klynge af sorte signaler tilslører rødt/røde signal(er). Højere forstørrelse (60x) kan anvendes ved forsøg på at bekræfte tilstedeværelsen eller fraværet af rødt signal/røde signaler, da de ellers ikke tæller: Tæl altid kerner med klare røde signaler. Bemærk tilstedeværelsen af SISH-klynger på scoringsarket. Kerner med synlige og højere antal røde signaler skal scores i kerner med SISHklynger. Hvis der forekommer SISH- støv i kernen, må den kun tælles, hvis specifikke SISH-signaler kan skelnes klart fra baggrunden. Rød tåge kan observeres og bør ikke forveksles med et signal. Rødt signal kan variere i intensitet, men er altid diskret. Billedet viser 2 diskrete røde (Chr17) signaler og 2 sorte (HER2) signaler. HER2-genstatus: Scoringsalgoritme for HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail Tyve kerner (hver indeholder røde (Chr17) og sorte (HER2) signaler) skal optælles. De endelige resultater for HER2-status rapporteres på grundlag af det forhold, der dannes ved at dividere summen af HER2-signaler for alle 20 kerner, der er divideret med summen af Chromosome 17-signaler for alle 20 kerner. Amplifikationsstatus er defineret som amplificeret, hvis HER2/Chr17-forhold 2,0 og som ikke-amplificeret, hvis HER2/Chr17- forhold < 2,0. Hvis HER2/Chr17-forholdet falder til mellem 1,8 til 2,2, skal der optælles yderligere 20 kerner. Der skal derefter dannes et nyt forhold på grundlag af alle 40 kerner og den rapporterede amplifikationsstatus, som allerede beskrevet. Tæl ikke, hvis der kun er signal for én farve. Tæl ikke, hvis signaler er uden for kernerne. Tæl som 1 sort (HER2) og 1 rødt (Chr17) signal / DA Rev C

6 Start HER2/Chr17 farvet objektglas Objektglas tilstrækkelig? Tæl HER2- og Chromosome 17-signaler i 20 kerner. Ja Identificér, og vælg målområde. Beregn HER2/Chr17-forholdet ved at dele det samlede antal HER2-signaler fra Målområde 1 med det samlede antal Chr17-signaler fra Målområde 1 Kontroller Tilstedeværelsen af sølv og røde signaler inden for normale cellekerner viser positiv reaktivitet. Normale cellekerner skal indeholde et gennemsnit på 1-2 diskrete SISH- og Red ISH-signaler, hvilket angiver, at HER2 DNA- og centromeriske Chromosome 17 probes har hybridiseret til hhv. genet og dets kromosom. Hvis der ikke kan påvises en enkelt genkopi i normale celler, er det tegn på unøjagtighed i objektglas, og resultaterne skal anses som ugyldige. Brug af xenograft-objektglas vil hjælpe med at fejlfinde potentielle instrument- og/eller reagensproblemer. Patientpræparat Patientens morfologiske fund og relevante kliniske data skal tolkes af en kvalificeret patolog. BEGRÆNSNINGER Generelle begrænsninger 1. ISH er en diagnostisk metode i flere trin, som kræver specialiseret uddannelse i udvælgelsen af egnede reagenser, klargøring af præparater, behandling, klargøring af ISH-objektglasset og fortolkning af resultaterne. 2. Vævsfarvningen er afhængig af håndteringen og behandlingen af vævet før farvningen. Forkert fiksering, frysning, optøning, vask, tørring, opvarmning, udskæring eller kontaminering med andet væv eller væsker kan forårsage artefakter. Inkonsekvente resultater kan være en følgevirkning af variationer i fikserings- og indstøbningsmetoder eller iboende uregelmæssigheder i vævet. 3. Overdreven eller ufuldstændig kontrastfarvning kan forhindre en korrekt fortolkning af resultaterne. 4. Den kliniske tolkning af farvning skal evalueres på baggrund af sygehistorie, morfologi og andre histopatologiske kriterier. Ansvaret herfor pålægges en kvalificeret patolog, der er fortrolig med de reagenser og metoder, der anvendes til frembringelse af det farvede præparat. Farvning skal udføres på et certificeret og godkendt laboratorium under opsyn af en patolog, der er ansvarlig for gennemsyn af de farvede objektglas og for sikring af kontrollernes nøjagtighed. 5. Ventana leverer reagenser, der er fortyndet optimalt til brug, når den medfølgende vejledning overholdes. Yderligere fortynding kan resultere i tab af passende farvning. Brugeren skal validere en sådan ændring. Enhver afvigelse fra anbefalede testmetoder kan ugyldiggøre de forventede resultater. Brugere, der afviger fra de anbefalede testmetoder, skal acceptere ansvaret for fortolkningen af patientresultater. Nej Unøjagtig Er 1,8 HER2/Chr17 2,2? Tæl yderligere 20 kerner Ja Nej Rapportresultater Ikke-amplificeret HER2/Chr17 < 2,0 Amplificeret HER2/Chr17 2,0 Beregn HER2/Chr17-forholdet ved at dividere det samlede antal HER2-signaler fra Målområde 1 og 2 med det samlede antal Chr17-signaler fra Målområde 1 og På grund af variationer i præparatbehandlingen kan det være nødvendigt at forøge eller formindske behandlingstiden af ISH-protease eller bruge en anden ISHprotease på individuelle præparater. Sådanne ændringer skal valideres af brugeren. Brugere, der afviger fra de anbefalede testmetoder, må påtage sig ansvaret for fortolkningen af patientresultater under disse forhold. 7. Reagenserne kan fremvise uventede reaktioner i tidligere utestet væv. Muligheden for uventede reaktioner, selv i undersøgte vævsgrupper, kan ikke helt udelukkes på grund af vævenes biologiske variabilitet. Kontakt din lokale supportrepræsentant med dokumenterede uventede reaktioner. Specifikke begrænsninger 1. INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail blev udviklet til at farve vævssnit, der er fikseret i 10 % NBF og skåret med en tykkelse på ~4 μm. 27 Analysen farver også prøver, der er fikseret i alkoholisk formalin, zink-formalin og PREFER-fiksativ. Fiksering i Bouin s eller AFA anbefales ikke. 2. Med henblik på at forhindre at Red ISH-signalet opløses, må farvede objektglas ikke nedsænkes i alkohol- eller acetonebaserede bade til dehydrering. Lufttørring eller tørring i ovn anbefales. 3. Det vides, at SISH-signalet bliver svagere efter eksponering for visse monteringsmedier. Under Tabel 11 i afsnittet Fejlfinding findes en liste over inkompatible monteringsmedier. KARAKTERISTIKA FOR YDEEVNE 1. INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail blev evalueret vha. HER2 Dual ISH 3-in-1 Xenograft Slides, der tidligere blev karakteriseret til HER2-genkopiantal af Abbott/Vysis PathVysion HER-2 DNA Probe Kit til fluorescerende in situhybridisering (FISH) og bestemt at have lignende HER2/Chr17-forhold. Derudover blev ca. 90 humane præparater (en blanding af amplificerede og ikke-amplificerede tilfælde) farvet med INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail og optalt af to kvalificerede læsere. Den samme kohorte blev farvet vha. PathVysion FISH og læst af én kvalificeret læser. For INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail-analysen var succesfrekvensen for førstegangsfarvning > 93 %. Resultaterne med oplysningerne om negative, positive og samlede overensstemmelsesfrekvenser for ca. 60 kliniske prøver fra denne kohorte, der blev optalt med både FISH og INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail, er vist i Tabel 4 og Tabel 5. Tabel 4. Overensstemmelse mellem INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail og FISH i en kohorte af humane brystkarcinompræparater på tværs af 2 læsere. HER2 Dual ISHlæser Aflæser A Aflæser B HER2 Dual ISHamplifikationsstatus FISH-amplifikationsstatus Amp Ikke-amp Amp 21 2 Ikke-amp 1 40 Amp 17 1 Ikke-amp 2 41 Tabel 5. Opsummering af negative, positive og samlede overensstemmelsesfrekvenser for INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail og FISH på humane brystkarcinompræparater. Negativ overensstemmelsesfrekvens HER2 Dual ISH-læser Rå Procent data/antal (95 % score CI) tilfælde 95,2 Aflæser A 40/42 (84,2-98,7) Aflæser B 41/42 97,6 (87,7-99,6) Positiv overensstemmelsesfrekvens Rå data/antal tilfælde 21/22 17/19 Procent (95 % score CI) 95,5 (78,2-99,2) 89,5 (68,6-97,1) Samlet overensstemmelsesfrekvens Rå data/antal tilfælde 61/64 58/61 Procent (95 % score CI) 95,3 (87,1-98,4) 95,1 (86,5-98,3) / DA Rev C

7 2. Den analytiske specificitet (hybridiseringseffektivitet) af INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail blev fastlagt ved at farve normale humane metafasespredninger med HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail på et BenchMark XT-instrument. Af 100 analyserede metafasespredninger udviste 100 % specifik samlokalisering af både HER2- og Chromosome 17 probes. 3. Reproducerbarheden af INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail-analysen blev testet på tværs af fem forskellige tilfælde af humant brystkarcinom (der repræsenterede det dynamiske område for HER2-genstatus) og HER2 Dual ISH 3-in-1 Xenograft Slides over fem ikke-sammenhængende dage på seks instrumenter (2 BenchMark, 2 BenchMark XT, 2 BenchMark ULTRA). Det gennemsnitlige HER2- og Chromosome 17-kopiantal blev opnået fra hvert instrument (på tværs af 3 platforme) på hver af de fem kørsler. Mere end 98 % af alle objektglas, der blev farvet og vurderet i denne undersøgelse (samlet 360), bestod objektglasnøjagtigheden og resulterede i reproducerbare HER2- og Chromosome 17-kopiantal med %CVs < 10 % på tværs af alle testdage og testede instrumenter og platforme. 4. Reproducerbarhed fra lot til lot af INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktailanalysen blev fastlagt ved at teste hver af 3 lot af INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail med 3 lot ultraview SISH DNP og ultraview Red ISH DIG Detection Kits på dublerede objektglas med 3 humane brystkarcinomtilfælde og HER2 Dual ISH 3-in-1 Xenograft Slides. Alle objektglas (100 %) opfyldt objektglasnøjagtigheden og blev optalt af én kvalificeret læser for rå HER2- og Chromosome 17-kopier i 20 kerner/præparater. Dataene blev udsat for en varianskomponentanalyse, der var baseret på en random effects-model, og resultaterne viser, at alle acceptkriterier blev opfyldt i denne undersøgelse. %CVs på tværs af probelot, detektionskitlot og inden for kørslen var alle < 11 %, hvilket angiver fremragende præcision af analysen. 5. Sammenligneligheden af analysen af brystpræparater blev fastslået af en undersøgelse, der sammenlignede INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe-analysen, hvor HER2- og Chromosome 17-kopiantallene blev fastslået på individuelle objektglas vha. enkelt SISH-detektion, med INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktailanalysen, hvor HER2- og Chromosome 17-kopiantallene blev fastslået på et enkelt objektglas vha. SISH- og Red ISH-detektion. En kohorte af 213 brystkarcinomtilfælde, der indeholdt en ~50/50 blanding af ikke-amplificeret og amplificeret genstatus, blev testet med begge analyser på BenchMark XT-instrumenter til automatisk farvning ( Tabel 6). Den samlede overensstemmelsesfrekvens mellem kliniske prøver af INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail og INFORM HER2 DNA Probe-analyse er vist i Tabel Reproducerbarheden af INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail-analysen blev testet på tværs af fire forskellige tilfælde af humant gastrisk karcinom (der repræsenterede det dynamiske område for HER2-genstatus) over fem ikkesammenhængende dage på seks instrumenter (2 BenchMark, 2 BenchMark XT, 2 BenchMark ULTRA). Det gennemsnitlige HER2- og Chromosome 17-kopiantal blev opnået fra hvert instrument (på tværs af 3 platforme) på hver af de fem kørsler. Mere end 98 % af alle objektglas, der blev farvet og vurderet i denne undersøgelse (samlet 240), bestod objektglasnøjagtigheden og resulterede i reproducerbare HER2- og Chromosome 17-kopiantal med %CVs < 10 % på tværs af alle testdage og testede instrumenter og platforme. 7. Sammenligneligheden af analysen af gastriske præparater blev fastslået ved at sammenligne farvningsresultaterne fra INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail-analysen kørt på en BenchMark XT med Dako HER2 FISH pharmdx Kit ( Tabel 8). Den samlede overensstemmelsesfrekvens mellem kliniske prøver af INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail og Dako HER2 FISH pharmdx Kit er vist i Tabel Den kliniske nytte af valget af patienter til KADCYLA er blevet demonstreret i MARIANNE-forsøget. MARIANNE er et randomiseret, tredelt, multicenter fase III- forsøg, der er designet til at vurdere effektiviteten og sikkerheden af trastuzumab-emtansin (T-DM1) kombineret med pertuzumab, og T-DM1 kombineret med placebo, i forhold til trastuzumab plus taxanakombinationsbehandling ved behandlingen af HER2-positiv (som defineret af IHC 3+ af PATHWAY HER2 (4B5)-analyse og/eller ISH amplificeret med INFORM HER2 Dual ISH-analyse), progressiv eller tilbagevendende lokal avanceret brystkræft (LABC) eller metastatisk brystkræft (MBC), hos patienter, der ikke havde modtaget forudgående kemoterapi for deres metastatiske sygdom. Der blev samlet screenet 1629 forsøgspersoner med henblik på deltagelse i MARIANNE-forsøget. Af disse blev 1563 testet med PATHWAY HER2 (4B5)- og/eller INFORM HER2 Dual ISH-analysen. I alt inkluderede fase III-forsøget 1093 HER2-positive og 2 HER2-negative patienter i henhold til inklusionskriterierne i MARIANNE-forsøget, af hvilke 983 havde en præparattest, som var HER2-positiv med INFORM HER2 Dual ISH-analysen. Det primære effektivitetsslutpunkt for MARIANNE-forsøget var progressionsfri overlevelse (PFS), baseret på en vurdering fra en uafhængig bedømmelsesgruppe (IRF) af patienter med HER2-positiv progressiv eller recidiv LABC eller tidligere ubehandlet MBC. Den mediane PFS var 13,7 måneder for trastuzumab + taxan, 14,1 måneder for T-DM1 + placebo og 15,2 måneder for T-DM1 + pertuzumab. Undersøgelsen demonstrerede, at PFS ikke var inferiør ved begge T-DM1- omfattende behandlingsmodeller i forhold til trastuzumab + taxan (stratificeret HR'er var under den forudspecificerede margen for ikke-inferioritet på HR=1,1765). Dog udviste ingen af de T-DM1-omfattende behandlingsmodeller statistisk betydeligt overlegenhed af PFS i forhold til trastuzumab + taxan. For T-DM1 + placebo: HR=0,91 (95 % CI: 0,73, 1,13); For T-DM1 + pertuzumab: HR=0,87 (95 % CI: 0,69-1,08). Desuden gav tilføjelsen af pertuzumab til T-DM1 ikke nogen statistisk betydelig forøgelse af PFS (HR=0,91, 95 % CI: 0,73-1,13). Tabel 6. Overensstemmelse mellem INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail med brug af Dual SISH og Red ISH Detektion og INFORM HER2 DNA Probe vha. enkelt SISHdetektion på en kohorte af præparater med invasiv brystkarcinom. HER2 Dual ISHamplifikationsstatus FISH-amplifikationsstatus Amplificeret Ikke-amplificeret I alt Amplificeret Ikke-amplificeret I alt Tabel 7. Opsummering af den samlede overensstemmelsesfrekvens for INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail med brug af Dual SISH og Red ISH Detektion til sammenligning med INFORM HER2 DNA Probe vha. enkelt SISH-detektion på præparater med invasiv brystkarcinom. Sikkerhedsintervallet på 95 % er også præsenteret. Rå data/ antal tilfælde Samlet overensstemmelsesfrekvens Procent (95 % score CI) 193/213 90,6 (85,9-93,8) Tabel 8. Overensstemmelse mellem INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktailanalysen og Dako FISH pharmdx-testen i gastriske karcinompræparater. HER2 Dual ISHamplifikationsstatus Dako FISH-amplifikationsstatus Amplificeret Ikke-amplificeret I alt Amplificeret Ikke-amplificeret I alt Tabel 9. Opsummering af den samlede overensstemmelsesfrekvens mellem INFORM HER2 Dual ISH DNA Probe Cocktail-analysen og Dako FISH for HER2-genstatus i gastriske karcinompræparater. Sikkerhedsintervallet på 95 % er også præsenteret. Rå data/ antal tilfælde Samlet overensstemmelsesfrekvens Procent (95 % score CI) 138/146 94,5 (89,6-97,2) / DA Rev C

8 Tabel 10. Varighed af PFS i forhold til IRF-vurdering. Trastuzumab + taxan (N=365) T-DM1 + placebo (N=367) T-DM1 + pertuzumab (N=363) Patienter med hændelse (%) 231 (63,3 %) 236 (64,3 %) 217 (59,8 %) Patienter uden hændelse (%) 134 (36,7 %) 131 (35,7 %) 146 (40,2 %) Varighed af PFS (måneder) Median (95 % CI) 13,7 (12,4, 14,9) 14,1 (10,9, 16,8) T-DM1 + pertuzumab og T-DM1 + placebo i forhold til trastuzumab + taxan Stratificeret analyse* 15,2 (12,5, 18,8) p-værdi (log-klassificering) - 0,3125 0,1407 Fareforhold (95 % CI) - Ikke-stratificeret analyse 0,91 (0,73, 1,13) 0,87 (0,69, 1,08) p-værdi (log-klassificering) - 0,5142 0,0972 Fareforhold (95 % CI) - Stratificeret analyse* 0,94 (0,76, 1,16) T-DM1 + pertuzumab i forhold til T-DM1 + placebo 0,85 (0,69, 1,06) p-værdi (log-klassificering) - - 0,3075 Fareforhold (95 % CI) - - Ikke-stratificeret analyse 0,91 (0,73, 1,13) p-værdi (log-klassificering) - - 0,2949 0,91 Fareforhold (95 % CI) - - (0,73, 1,12) *Stratificering efter verdensdel (USA, Vesteuropa, Canada og Australien- Stillehavsområdet, Østeuropa, Asien, Andre), inden adjuverende/neoadjuverende behandling (nej, ja-trastuzumab og/eller lapatinib, ja-nej trastuzumab og/eller lapatinib) og visceral sygdom (til stede, fraværende). FEJLFINDING 1. Det er vigtigt at evaluere tilstedeværelsen af relevant signal i de interne positive kontrolkerner. Normale HER2- og Chromosome 17-signaler (1 til 2 kopier pr. celle) fungerer som interne, positive kontroller, og deres tilstedeværelse bekræfter analysesensitiviteten og -specificiteten på individuelle objektglas. Denne kernefarvning kan være lokaliseret i forskellige ikke-neoplastiske celler, inklusiv: stromale fibroblaster, endotelceller, lymfocytter og ikke-neoplastiske celler. 2. Svag eller ingen farvning af præparater i en kørsel kan indikere et problem med reagenserne eller instrumentet. Kontrollér, at de korrekte betingelser forud for analysen er blevet overholdt (se Klargøring af præparater). Kontrollér, at alle dispensere fungerer korrekt. Brugen af HER2 Dual ISH 3-in-1 Xenograft Slides kan bruges til fejlfinding, hvis der er mistanke om problemer med reagenser eller instrumenter. 3. Hvis SISH-signalet er tilstrækkeligt, men Red ISH-signalet er svagt eller fraværende, skal du sikre, at objektglassene ikke er blevet dehydreret i alkohol eller acetone og ikke har været udsat for xylen-bade i længere tid. Hvis Red ISH-signalet er tilstrækkeligt, men SISH er svagt eller fraværende (eller ser ud til at blive svagere eller skifter til brun/orange), kan der forekomme oxidering af signalet. Sørg for, at der er blevet anvendt det korrekte monteringsmedie (se Tabel 11). 4. Præparater, der er blevet forkert indsamlet, fikseret eller opbevaret, udviser muligvis upassende farvning (se Klargøring af præparater). 5. Hvis signalet for én eller begge prober ser ud til at være svagt eller fraværende, og tumorkernen forekommer intakt og/eller blå i farve, anbefales det at øge varigheden af forbehandlingstilstanden. Specifikt kan brugen af ISH Protease 3 i mere end 16 minutter (dvs., 24 minutter) eller ISH Protease 2 i 4 minutter eller mere udføres. Længere cellebehandlingstider (16 minutter pr. cyklus i 3 cyklusser) er også effektive. Ventana har fastslået, at manipulation af forbehandlingstrinnene er mest effektiv til at udbedre svag farvning. 6. Hvis signalet fra de anbefalede betingelser er svagt eller fraværende i tumorcellerne, og tumorcellerne forekommer overfordøjede (dvs. blege eller uden kontrastfarvning), kan det skyldes underfiksering (se Klargøring af præparater). Afkortning af ISH Protease 3-tiden til 8 eller 12 minutter anbefales. Desuden vil forøgelsen af inkubationstiderne for SISH HRP Multimer, Silver C, AP Multimer og Fast Red Chromogen også være effektiv til udbedring af svag farvning. 7. Hvis objektglassene påviser uspecifik SISH-baggrundsfarvning ( støv ) i kernerne, som kan forstyrre optællingen af det specifikke SISH-signal, kan Protease 3-tiden afkortes fra 16 minutter til 4, 8 eller Hvis uspecifik Red ISH-farvning i kernen forstyrrer optælling, skal du genfarve objektglasset ved højere temperaturer under stringensafskylningen (dvs., 76 C). 9. Se afsnittet Fremgangsmåde trin for trin i brugervejledningen til det automatiske farvningssystem for korrigerende handlinger, eller kontakt den lokale repræsentant. 10. Snit, der er tykkere end 4 μm, kan kræve stærkere proteaseforhold for at demaskere mål-dna. Tyndere snit kan kræve mildere proteaseforhold. Desuden kan tykkere snit kræve mere nukleær bobledannelse end tyndere snit på grund af for meget paraffin i vævet (se Klargøring af præparater). Det kan være nødvendigt at afparaffinere disse præparater i alkohol- og xylen-bade inden farvning på instrumentet, eller brugeren kan vælge funktionen udvidet afparaffinering under farvningen for at forebygge nukleær bobledannelse på grund af for meget paraffin. 11. Hvis et tilfælde udviser ufortolkelig farvning, med brun, sort eller mørkerød baggrund i hele vævet, skal objektglasset køres igen. Hvis farvning stadig er uacceptabel, skal du sørge for, at objektglassene er SuperFrost Plus. Hvis der deponeres for meget Silver eller Red på objektglasset, og det bliver svært at optælle det nukleære signal på grund af stænk gennem vævet, skal objektglasset også køres igen. Normalt skulle det ikke være nødvendigt at gentage mere end 5-6 % af tilfældene på grund af disse tørrings-/stænkartefakter. Tabel 11. Kompatibilitet af monteringsmedier med SISH-baserede analyser. Monteringsmedier Producent Type (xylen, alkohol, vandig) Eukitt EMS Xylen N Entellan New Merck Xylen N Entellan Merck Xylen N HSR Sysmex Xylen N Malinol Muto Chemical Xylen N Cytoseal XYL Richard Allan Scientific Xylen Softmount WAKO LEMASOL A J Paramount Protaqs Quartett: Dako Xylen DPX BDH: Raymond Lamb Xylen J Cytoseal 60 Richard Allan Scientific Xylen Permount Fisher Xylen J Histomount Raymond Lamb Xylen J Ultramount Dako Xylen J Thermo EZ Mount Thermo Scientific Xylen J SureMount Triangle Biomedical Sciences Xylen Flo-Texx Lerner Labs Xylen J Kompatibilitet med SISH J J J J / DA Rev C