PD-L1 IHC 22C3 pharmdx er indiceret som en hjælp til at identificere NSCLC-patienter, der kan behandles med KEYTRUDA (pembrolizumab).

Transkript

1 PD-L1 IHC 22C3 pharmdx SK test til anvendelse sammen med Autostainer Link 48 Tilsigtet anvendelse Til in vitro-diagnostisk brug. PD-L1 IHC 22C3 pharmdx er en kvalitativ immunhistokemisk analyse, der bruger Monoclonal Mouse Anti-PD-L1, Clone 22C3 og er beregnet til brug til visualisering af PD-L1-protein i formalinfikseret, paraffinindstøbt væv (FFPE-væv) af ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) ved brug af visualiseringssystemet EnVision FLEX på Autostainer Link 48. Ekspression af PD-L1-protein påvises ved at bruge TPS (Tumor Proportion Score), som er den procentdel af levedygtige tumorceller, der udviser delvis eller komplet membranfarvning. PD-L1 IHC 22C3 pharmdx er indiceret som en hjælp til at identificere NSCLC-patienter, der kan behandles med KEYTRUDA (pembrolizumab). Resumé og forklaring Binding af PD-1-liganderne, PD-L1 og PD-L2, til PD-1-receptoren, der findes på T-celler, hæmmer T-celleproliferation og cytokinproduktion. Opregulering af PD-1-ligander forekommer i visse tumorer, og signalering gennem denne pathway kan bidrage til at hæmme tumorernes immunovervågning af aktive T-celler. KEYTRUDA er et humaniseret, monoklonalt antistof, der binder sig til PD-1-receptoren og blokerer dens interaktion med PD-L1 og PD-L2, som udløser PD-1-pathway-medieret hæmning af immunresponsen, herunder anti-tumor-immunresponsen. I modeller med tumorer hos syngeniske mus medførte blokering af PD-1- aktivitet mindsket tumorvækst (1). Princip for proceduren PD-L1 IHC 22C3 pharmdx indeholder optimerede reagenser og den påkrævede protokol til at udføre en IHC-farvningsprocedure på FFPE-præparater ved brug af Autostainer Link 48. Efter inkubation med det primære monoklonale antistof mod PD-L1 eller Negative Control Reagent (NCR) inkuberes præparaterne med et linker-antistof, der er specifikt for det primære antistofs værtsart, og de inkuberes derefter med et brugsklart visualiseringsreagens bestående af sekundære antistofmolekyler og peberrodsperoxidasemolekyler koblet til en dextranpolymerbase. Den enzymatiske omdannelse af det efterfølgende tilsatte kromogen medfører udfældning af et synligt reaktionsprodukt på antigenstedet. Den kromogene reaktions farve modificeres med et reagens til kromogen forbedring. Præparatet kan derefter modfarves og forsynes med dækglas. Resultaterne fortolkes ved hjælp af et lysmikroskop. Medfølgende materialer Hvert sæt inkluderer 19,5 ml PD-L1 primært antistof (cirka 3µg/mL proteinkoncentration) og omfatter de nødvendige reagenser til at udføre 50 test i op til 15 individuelle kørsler. De nedenfor anførte materialer rækker til 50 analyser (50 objektglas inkuberet med primært antistof mod PD-L1 og 50 objektglas inkuberet med det tilsvarende Negative Control Agent, i alt 100 objektglas). Antallet af analyser er baseret på anvendelse af 2 x 150 µl pr. objektglas for hvert reagens bortset fra DAB+ og Target Retrieval Solution. Sættet indeholder materialer til maks. 15 individuelle farvninger. Mængde Beskrivelse 1 x 34,5 ml Peroxidase-Blocking Reagent PEROXIDASE-BLOCKING REAGENT Bufferopløsning, der indeholder hydrogenperoxid, detergent og 0,015 mol/l natriumazid. 1 x 19,5 ml Primært antistof: Monoclonal Mouse Anti-PD-L1, Clone 22C3 MONOCLONAL MOUSE ANTI-PD-L1 CLONE 22C3 Monoklonalt muse-anti-pd-l1 (IgG 1 ) i en bufferopløsning, der indeholder stabiliserende protein og 0,015 mol/l natriumazid. 1 x 15 ml Negative Control Reagent NEGATIVE CONTROL REAGENT Monoklonalt muse-kontrol-igg-antistof i en bufferopløsning, der indeholder stabiliserende protein og 0,015 mol/l natriumazid. 1 x 34,5 ml Mouse LINKER LINKER, ANTI-MOUSE Sekundært kaninantistof mod museimmunoglobuliner i en bufferopløsning, der indeholder stabiliserende protein og 0,015 mol/l natriumazid. 1 x 34,5 ml Visualization Reagent-HRP VISUALIZATION REAGENT-HRP Dextran koblet med peroxidasemolekyler og sekundære gedeantistofmolekyler mod kanin- og museimmunoglobuliner i en bufferopløsning, der indeholder stabiliserende protein og et antimikrobielt stof. P03928DK_03/SK / s. 1/15

2 15 x 7,2 ml DAB+ Substrate Buffer DAB+ SUBSTRATE BUFFER Bufferopløsning, der indeholder hydrogenperoxid og et antimikrobielt stof. 1 x 5 ml DAB+ kromogen DAB+ CHROMOGEN 3,3'-diaminobenzidin-tetrahydrochlorid i organisk opløsningsmiddel. 1 x 34,5 ml DAB Enhancer DAB ENHANCER Cuprisulfat i vand. 6 x 30 ml EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low ph, 50x EnVision FLEX TARGET RETRIEVAL SOLUTION LOW ph (50X) Bufferopløsning, ph 6,1, der indeholder detergent og et antimikrobielt stof. 15 objektglas PD-L1 IHC 22C3 pharmdx Control Slides CONTROL SLIDES Hvert objektglas indeholder vævssnit af to pelleterede, formalinfikserede, paraffinindstøbte cellelinjer: NCI-H226* med moderat PD-L1-proteinekspression og MCF-7 med negativ PD-L1-proteinekspression. PD-L1 IHC 22C3 pharmdx XXXXX MCF-7: PD-L1-negativ NCI-H226: PD-L1-positiv *Dr. A.F. Gazdar og dr. J.D. Minna fra NIH anerkendes for deres bidrag til udviklingen af NCI-H226 (ATCC-nr.: CRL-5826 ) (2). Bemærk: Alle reagenser, som medfølger, er formuleret specifikt til anvendelse sammen med dette sæt. Hvis analysen skal fungere som angivet, må disse ikke erstattes med andet end EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low ph, 50x (kode K8005). PD-L1IHC 22C3 pharmdx er skræddersyet til brug sammen med Autostainer Link 48. Der henvises til brugervejledningerne til Autostainer Link 48 og PT Link for yderligere oplysninger. Nødvendige materialer, der ikke medfølger PT Link Pre-treatment Module (kode PT100/PT101) Autostainer Link 48 (kode AS480) EnVision FLEX Wash Buffer, 20x (kode K8007) Hematoxylin (kode K8008) Destilleret eller deioniseret vand (vand af reagenskvalitet) Timer Positive og negative vævsprøver til brug som proceskontroller (se afsnittet Kvalitetskontrol) Objektglas: Dako FLEX IHC Microscope Slides (kode K8020) eller Fisherbrand Superfrost Plus-ladede objektglas Dækglas Permanent monteringsmedium og andre reagenser, der er nødvendige til montering af dækglas Lysmikroskop (4x-40x objektivforstørrelse) Forholdsregler 1. Til in vitro-diagnostisk brug. 2. Må kun anvendes af uddannet personale. 3. Dette produkt indeholder natriumazid (NaN3), et kemikalie, som er meget giftigt i ren form. Selvom koncentrationen i produktet ikke er klassificeret som farlig, kan NaN3 reagere med bly og kobber og danne meget eksplosive ophobninger af metalazider. Efter bortskaffelse skylles med rigelige mængder vand for at hindre ophobning af metalazid i afløb (3). 4. Primært antistof, negativt kontrolreagens, linker og visualiseringsreagens indeholder materialer af animalsk oprindelse. 5. Før og efter fiksering skal præparater og alle materialer, der kommer i berøring med disse, håndteres som værende i stand til at overføre smitte og bortskaffes med de korrekte foranstaltninger (4). 6. Andre inkubationstider, -temperaturer eller -metoder end de angivne kan give fejlagtige resultater. 7. Reagenserne er optimalt fortyndede. Yderligere fortynding kan medføre tab af antigenfarvning. 8. Visualization Reagent, Liquid DAB+ Chromogen og klargjort DAB+ Substrate-Chromogen Solution kan blive påvirket negativt, hvis de udsættes for stærke lyskilder. Undlad at opbevare systemkomponenter eller udføre farvning i kraftig belysning, f.eks. direkte sollys. 9. Paraffinrester kan medføre forkerte negative resultater. 10. Brug af andre reagensvolumener end de anbefalede kan føre til tab af synlig PD-L1-immunreaktivitet. 11. Resultaterne fra en lille undersøgelse viste et lignende dynamisk område af PD-L1-ekspression i primære og metastatiske NSCLC-præparatpar. Der kan muligvis være forskelle i PD-L1-ekspression i primære tumorer kontra metastatiske områder i den samme patient. 12. Store vævssnit kan kræve 3x150 µl reagens. P03928DK_03/SK / s. 2/15

3 13. Som hovedregel gælder det, at personer under 18 år ikke må arbejde med dette produkt. Brugerne skal omhyggeligt vejledes i den korrekte arbejdsprocedure, produktets farlige egenskaber og de nødvendige sikkerhedsanvisninger. Se yderligere oplysninger i sikkerhedsdatabladet (SDS). 14. Brug passende personlige værnemidler for at undgå, at materialet kommer i kontakt med øjne og hud. 15. Ubrugt opløsning skal bortskaffes i henhold til lokal, national og EU-retlig lovgivning. 16. Sikkerhedsdatablade til professionelle brugere kan rekvireres. Fare DAB+ Chromogen: 1-5% biphenyl-3,3',4,4'-tetrayltetraammoniumtetrachlorid H350 Kan fremkalde kræft. H341 Mistænkt for at forårsage genetiske defekter. P201 Indhent særlige anvisninger før brug. P202 Anvend ikke produktet, før alle advarsler er læst og forstået. P280 Bær beskyttelseshandsker. Bær øjenbeskyttelse eller ansigtsbeskyttelse. Bær beskyttelsestøj. P308 + P313 VED eksponering eller mistanke om eksponering: Søg lægehjælp. P405 Opbevares under lås. P501 Indholdet/beholderen bortskaffes i overensstemmelse med alle lokale, regionale, nationale og internationale bestemmelser. Advarsel EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low ph (50x): 1-5% citronsyre H319 Medfører øjenirritation. H411 Giftig for vandlevende organismer, med langvarige virkninger. P280 Bær øjenbeskyttelse eller ansigtsbeskyttelse. P273 Undgå udledning til miljøet. P264 Vask hænderne grundigt efter brug. P305 + P351 + P338 VED KONTAKT MED ØJNENE: Skyl forsigtigt med vand i adskillige minutter. Fjern eventuelle kontaktlinser, hvis dette kan gøres let. Fortsæt skylning. P337 + P313 Ved vedvarende øjenirritation: Søg lægehjælp. P501 Indholdet/beholderen bortskaffes i overensstemmelse med alle lokale, regionale, nationale og internationale bestemmelser. Opbevaring Alle komponenter fra PD-L1 IHC 22C3 pharmdx, inklusive kontrolobjektglas, skal opbevares mørkt ved 2-8 C, når de ikke er i brug på Autostainer Link 48. Sættet må ikke anvendes efter udløbsdatoen, der er trykt udvendigt på æsken. Hvis reagenserne opbevares under andre forhold end dem, der er nævnt i denne indlægsseddel, skal disse forhold først evalueres af brugeren. Der er ingen synlige tegn på, at produktet er ustabilt. Derfor skal der udføres positive og negative kontroller samtidig med patientpræparater. Klargøring af præparater Præparaterne skal behandles, så vævet bevares til IHC-farvning. Der skal anvendes standardmetoder til vævsbehandling til alle præparater. Paraffinindstøbte snit Formalinfikserede, paraffinindstøbte vævsprøver er egnede til brug. Alternative fikseringer er ikke blevet vurderet og kan give forkerte resultater. En fikseringstid på timer i 10% neutralt bufferet formalin (NBF) anbefales, men en undersøgelse med et begrænset antal prøver viste, at fikseringstider på timer i 10% NBF ikke ændrede visualisering af PD-L1 systematisk. Fikseringstider på 3 timer kan medføre forskelle i visualisering af PD-L1. Præparaterne skal skæres ud i blokke med en tykkelse på 3 eller 4 mm, fikseres i formalin og dehydreres og renses i en række alkoholer og xylen, efterfulgt af infiltrering med smeltet paraffin. Paraffintemperaturen må ikke overstige 60 C. FPPE-vævsblokke, som er 5 år gamle eller ældre, kan medføre tab af PD-L1-immunreaktivitet. Vævsprøver skal opskæres i snit med en tykkelse på 4-5 µm. Efter skæringen skal vævene monteres på Fisherbrand Superfrost Plusobjektglas eller Dako FLEX IHC Microscope Slides (kode K8020) og derefter anbringes i en 58 ± 2 C varm ovn i 1 time. For at bevare antigeniciteten skal vævssnittene, når de er monteret på objektglas, opbevares i mørke ved 2-8 C (foretrækkes) eller ved stuetemperatur op til 25 C og farves inden 6 måneder efter opskæring. Objektglassenes opbevaringsforhold og håndteringsforhold må ikke overstige 25 C på noget tidspunkt efter montering af hensyn til sikring af vævsintegriteten og antigeniciteten. Anvendelse af PD-L1 IHC 22C3 pharmdx på afkalkede væv er ikke blevet valideret og frarådes. Klargøring af reagens Følgende reagenser skal klargøres forud for farvning: EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low ph, 50x Klargør en passende mængde 1x Target Retrieval Solution, Low ph ved at fortynde Target Retrieval Solution, Low ph, 50x 1:50 med destilleret eller deioniseret vand (vand i reagenskvalitet). ph-værdien for 1x Target Retrieval Solution skal være 6,1 ± 0,2. 1x Target Retrieval Solution med ph under 5,9 kan give fejlbehæftede resultater. Én 30 ml flaske med Target Retrieval Solution, Low ph, 50x fortyndet 1:50 giver 1,5 L 1x reagens, hvilket er tilstrækkeligt til at fylde én PT Link-beholder, som kan behandle op til 24 objektglas pr. brugsgang. Bortskaf 1x Target Retrieval Solution efter brug tre gange, og brug det ikke senere end 5 dage efter fortynding. Yderligere EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low ph, 50x kan eventuelt bestilles med kode K8005. P03928DK_03/SK / s. 3/15

4 EnVision FLEX Wash Buffer, 20x Klargør en passende mængde vaskebuffer ved at fortynde Wash Buffer 20x 1:20 med destilleret eller deioniseret vand (vand i reagenskvalitet) til brug på vasketrinnene. Opbevar ubenyttet 1x opløsning ved 2-8 ºC i højst en måned. Kasser bufferen, hvis den er uklar. Se brugsanvisningen til Autostainer Link 48 for yderligere oplysninger. EnVision FLEX Wash Buffer, 20x leveres som kode K8007. DAB+ substratkromogenopløsning Denne opløsning skal blandes grundigt inden brug. En eventuel udfældning, der dannes i opløsningen, påvirker ikke farvningskvaliteten. DAB+ Substrate-Chromogen Solution klargøres ved at tilsætte 1 dråbe Liquid DAB+ Chromogen pr. ml DAB+ Substrate Buffer og blande. Klargjort substratkromogen er stabilt i ca. 5 dage, når det opbevares i mørke ved 2-8 C. Vigtige bemærkninger: Hvis der bruges en hel flaske DAB+ Substrate Buffer, skal der tilsættes 9 dråber DAB+ Chromogen. Selvom der står 7,2 ml på mærkaten, er dette et udtryk for brugsvolumen og medregner ikke "dødvolumenet" i flasken. Farven på det flydende DAB+ Chromogen i flasken kan variere fra klar til lavendelbrun. Dette påvirker ikke produktets effektivitet. Fortynd i henhold til ovenstående retningslinjer. Hvis der tilsættes for meget flydende DAB+ kromogen til DAB+ substratbufferen, vil det medføre en forringelse af det positive signal. Farvningsprocedure på Autostainer Link 48-løsningen Bemærkninger til proceduren Brugeren skal læse denne vejledning grundigt og gøre sig fortrolig med alle komponenter og instrumenter inden brug (se Forholdsregler). Alle reagenser skal have stuetemperatur (20-25 C) inden immunfarvningen. Desuden skal alle inkubationer foregå ved stuetemperatur. Vævssnittene må ikke tørre ud under farvningsproceduren. Udtørrede vævssnit kan udvise øget, uspecifik farvning. Alle de påkrævede trin og inkubationstider for farvning er forprogrammeret i Dako Link-softwaren. Der henvises til brugsanvisningerne til Autostainer Link 48 og PT Link for yderligere oplysninger om programmeringsprotokoller og isætning af objektglas og reagenser. Bemærk: Reagenserne og vejledningen, der følger med dette system, er udviklet til at yde optimalt ved brug sammen med de anbefalede reagenser og materialer. Yderligere fortynding af sættets reagenser eller ændring af inkubationstiderne eller - temperaturerne kan give fejlagtige eller uoverensstemmende resultater. Farvningsprotokol Vælg farvningsprotokollen for PD-L1 IHC 22C3 pharmdx i indstillingerne i rullemenuen i Dako Link. Alle de påkrævede trin og inkubationstider for farvning er forprogrammeret i Autostainer Link 48. Hvis de korrekte PD-L1 IHC 22C3 pharmdx-protokoller ikke findes på serveren, skal du kontakte den lokale teknisk service-repræsentant med henblik på at anskaffe protokollerne. Trin 1: Procedure for afparaffinering, rehydrering og target-retrieval (3-i-1) Der henvises til brugervejledningen for PT LINK. Indstil forvarmnings- og nedkølingstemperatur på PT Link (kode PT100/PT101) til 65 C. Indstil opvarmning til 97 C i 20 minutter. Fyld PT Link-karrene med 1,5 L Target Retrieval Solution, Low ph, 1x brugsopløsning pr. kar til at dække vævssnittene. Forvarm Target Retrieval Solution til 65 C. Nedsænk Autostainer-holderne med de monterede FFPE-vævssnit i den forvarmede Target Retrieval Solution, Low ph (1x brugsopløsning) i PT Link-karret. Inkuber i 20 minutter ved 97 C. Når target retrieval-inkubationen er fuldført, og temperaturen er kølet ned til 65 C, skal du fjerne hver Autostainer-objektglasholder med objektglas fra PT Link-karret og straks placere Autostainer-holderen i et kar (f.eks. PT Link Rinse Station, kode PT109) med fortyndet Wash Buffer (kode K8007), der har stuetemperatur. Inkuber objektglassene i den fortyndede Wash Buffer med stuetemperatur i 5 minutter. Trin 2: Farvningsprocedure Efter afparaffinering, rehydrering og target-retrieval-proceduren (3-i-1-proceduren) placeres Autostainer-holderne med objektglas på Autostainer Link 48. Instrumentet vil udføre farvningsproceduren ved at påføre det korrekte reagens, overvåge inkubationstiden og skylle objektglas mellem de forskellige reagenser. Reagenstiderne er forprogrammeret i Dako Link-softwaren. Trin 3: Kontrastfarve Objektglassene skal modfarves med Hematoxylin (Link) (kode K8008) i 5 minutter. Inkubationstiden i Hematoxylin er forprogrammeret i protokollen. Trin 4: Montering Ikke-vandigt permanent monteringsmedie er påkrævet. Bemærk: Der kan opstå en vis falmning af de farvede objektglas afhængigt af flere faktorer omfattende, men ikke begrænset til, modfarvning, monteringsmaterialer og metoder samt objektglassenes opbevaringsforhold. Dette kan mindskes, hvis objektglassene opbevares mørkt ved stuetemperatur (20-25 C). P03928DK_03/SK / s. 4/15

5 Kvalitetskontrol Reagenser i PD-L1 IHC 22C3 pharmdx er kvalitetskontrolleret med immunhistokemi ved hjælp af den ovenfor angivne target retrievalog farvningsprocedure. Afvigelser fra de anbefalede procedurer for vævsfiksering, behandling og indstøbning på brugerens laboratorium kan medføre, at resultaterne varierer betydeligt. For hver farvningskørsel skal der medtages kvalitetskontroller. Disse kvalitetskontroller er angivet i tabel 1 og omfatter: et farvet H&E-patientvævspræparat, positive og negative kontrolvæv leveret af laboratoriet og et kontrolcellelinje-objektglas (5) leveret af Dako. I USA henvises til retningslinjerne for kvalitetskontrol i College of American Pathologists (CAP) Accreditation Program for Immunohistochemistry, se også CLSI Quality Assurance for Immunocytochemistry, Approved Guideline (5, 6, 7) i litteraturlisten for yderligere oplysninger. Kontrol af analysen Før et farvningssystem anvendes første gang i en diagnostisk procedure, skal brugeren kontrollere analysens effektivitet ved at teste den på en række væv leveret af laboratoriet, som har kendte IHC-resultatkendetegn, der repræsenterer kendte positive og negative væv. Se procedurerne for kvalitetskontrol, som er beskrevet i afsnittet om kvalitetskontrol ovenfor. Disse kvalitetskontrolprocedurer skal gentages for hvert nyt antistofparti, eller når analyseparametrene ændres. Muligheder for fejlfinding ved potentielle problemer, problemernes årsager og forslag til afhjælpning beskrives i tabel 10. Scoringsfortolkning NSCLC Alle levedygtige tumorceller på hele objektglasset skal evalueres og medtages i PD-L1-scoringsvurderingen. Der skal være mindst 100 levedygtige tumorceller til stede i det PD-L1-farvede objektglas, før præparatet anses for at være egnet til PD-L1-vurdering. Med henblik på en vellykket scoring af PD-L1 IHC 22C3 pharmdx-farvede præparater er det meget vigtigt, at de rigtige celler evalueres, at den korrekte celleplacering identificeres og at intensiteten af farvningen fortolkes korrekt. En patolog skal evaluere objektglassene ved hjælp af et lysmikroskop. Et objektiv med en forstørrelse på 10-40x er velegnet til evaluering af den immunhistokemiske farvning og scoring. Enhver synlig membranfarvning af tumorceller skal medtages i scoringen. Delvis eller komplet membranfarvning ( 1+), som er synligt forskellig fra cytoplasmisk farvning, skal scores. Cytoplasmisk farvning skal anses for at være uspecifik farvning og udelukkes fra vurderingen af farvningens intensitet. Normale celler og tumor-associerede immunceller såsom infiltrerende lymfocytter eller makrofager skal ikke medtages i scoringen med henblik på bestemmelse af PD-L1-positivitet. Tumorpræparater, der er farvet med NCR, skal have 0 specifik farvning og 1+ baggrundsfarvning. Tumor Proportion Score (TPS) er den procentdel af levedygtige tumorceller, der udviser delvis eller komplet membranfarvning ( 1+). Præparatet skal anses for at være PD-L1-positivt, hvis TPS 1% af de levedygtige tumorceller udviser membranfarvning med en hvilken som helst intensitet (dvs. 1+). For at bestemme farvningskørslens gyldighed og muliggøre en vurdering af præparaternes farvning for hver farvningskørsel skal objektglassene undersøges i den rækkefølge, der vises i tabel 1. Se fortolkningsvejledningen til PD-L1 IHC 22C3 pharmdx for at få yderligere vejledning. Yderligere anbefalinger vedrørende fortolkning af PD-L1 IHC 22C3 pharmdx-farvning 1. Til kontrol af cellemembranfarvningen anvendes en 10 40x objektivforstørrelse. 2. Forskellige ikke-target-elementer såsom tumor-associerede immunceller (f.eks. makrofager) og stroma kan også farves positive for PD-L1, men de skal ikke medtages i scoringen. Tabel 1. Anbefalet rækkefølge for vurdering af objektglassene Præparater Rationale Krav 1. H&E (leveres af laboratoriet) Først evalueres en farvning af vævspræparaterne med hæmatoxylin og eosin (H&E) for at vurdere histologi og bevarelse af væv. PD-L1 IHC 22C3 pharmdx- H&E-farvningen skal udføres på snit skåret efter hinanden fra samme paraffinblok af vævspræparatet. Der skal være mindst 100 levedygtige tumorceller til stede, før præparatet anses for at være egnet til PD-L1-vurdering. Vævspræparaterne skal være intakte, velbevarede og skal bekræfte tumorindikation. 2. Kontrolcellelinjeobjektglas (leveres af Dako) Det positive kontrolcellelinjeobjektglas med PD-L1 primært antistof fra PD-L1 IHC 22C3 pharmdx skal først undersøges med henblik på at sikre, at alle reagenser fungerer korrekt. Kontrolcellelinje-objektglasset indeholder den PDL1-positive cellelinje-pellet og den PD-L1- negative cellelinje-pellet. Ét kontrolcellelinje-objektglas skal farves med det primære antistof for PD-L1 i hver farvningskørsel. NCI-H226 (PD-L1-positiv kontrolcellelinje), acceptkriterier: Cellemembranfarvning af 70% af cellerne ved 2+ gennemsnitlig farvningsintensitet. Uspecifik farvning <1+ intensitet. MCF-7 (PD-L1-negativ kontrolcellelinje), acceptkriterier: Uspecifik farvning. Uspecifik farvning <1+ intensitet. Bemærk, at der lejlighedsvis kan observeres farvning af nogle få celler i MCF-7-celle-pelleten. Følgende acceptkriterier skal anvendes: tilstedeværelse af 10 celler i alt med tydelig farvning af plasmamembran eller cytoplasmisk farvning med 1+ intensitet inden for grænserne af MCF-7-cellepillen er acceptabelt. Hvis en af kontrolcellelinjerne ikke opfylder disse kriterier, skal alle resultater for patientpræparaterne betragtes som ugyldige. P03928DK_03/SK / s. 5/15

6 3. Objektglas med positivt kontrolvæv (leveres af laboratoriet) 4. Objektglas med negativt kontrolvæv (leveres af laboratoriet) 5. Objektglas med patientvæv, der er farvet med Negative Control Reagent 6. Objektglas med patientpræparat, der er farvet ved hjælp af PD-L1 primært antistof Objektglassene med positivt kontrolvæv, der er farvet med både PD-L1 primært antistof og Negative Control Reagent, skal undersøges derefter. Disse objektglas bekræfter, at fikseringsog epitop-retrieval-processen er effektiv. Kendte positive vævskontroller må kun anvendes til overvågning af, om det behandlede væv og testreagenser fungerer korrekt IKKE som en hjælp til formuleringen af en specifik diagnose for patientprøverne. Objektglassene med negativt kontrolvæv (som vides at være PD-L1-negative), som er farvet med både PD-L1 primært antistof og Negative Control Reagent, skal derefter undersøges for at kontrollere specificiteten af det primære antigens mærkning af målantigenet. Alternativt kan negative områder i det positive kontrolvæv bruges som negativt kontrolvæv, men dette bør kontrolleres af brugeren. Undersøg patientpræparater, der er farvet med Negative Control Reagent fra PD-L1 IHC 22C3 pharmdx. Negative Control Reagent bruges i stedet for det primære antistof og er en hjælp i fortolkningen af specifik farvning på antigenstedet. Hele objektglasset med patientpræparaterne, der er farvet med PD-L1 primært antistof fra PD-L1 IHC 22C3 pharmdx, skal undersøges til sidst. Der henvises til Resumé og forklaring, Begrænsninger samt Resultatkendetegn for specifikke oplysninger om immunreaktiviteten for PD-L1 IHC 22C3 pharmdx. Kontrollerne skal være friske biopsi-/kirurgiske præparater fra samme tumorindikation som patientprøven, der er fikseret, behandlet og indstøbt så hurtigt som muligt på samme måde som patientprøven (-prøverne). Anvend intakte præparater til fortolkning af farvningsresultaterne, da nekrotiske eller degenererede celler ofte farves uspecifikt. De væv, der vælges til anvendelse som positive vævskontroller, skal give svag til moderat farvning ved farvning med PD-L1 som en hjælp til detektering af små forandringer analysens sensitivitet. Der skal medtages to positive vævskontrolobjektglas i hver farvningskørsel. Objektglas farvet med PD-L1: Der skal ses brunfarvning af plasmamembranen. Uspecifik farvning skal være 1+. Objektglas farvet med Negative Control Reagent: Ingen membranfarvning. Uspecifik farvning skal være 1+. Hvis de positive vævskontroller ikke udviser en passende, positiv farvning, skal resultaterne fra de analyserede præparater betragtes som ugyldige. Kontrollerne skal være friske biopsi-/kirurgiske præparater fra samme tumorindikation som patientprøven, der er fikseret, behandlet og indstøbt så hurtigt som muligt på samme måde som patientprøven (-prøverne). Der skal medtages to negative vævskontrolobjektglas i hver farvningskørsel. Objektglas farvet med PD-L1: Ingen membranfarvning i tumorceller. Uspecifik farvning skal være 1+. Objektglas farvet med Negative Control Reagent: Ingen membranfarvning. Uspecifik farvning skal være 1+. Hvis objektglassene med det negative kontrolvæv udviser specifik cellemembranfarvning, skal resultaterne med patientpræparatet betragtes som ugyldige. Fravær af cellespecifik membranfarvning verificerer den specifikke mærkning af målantigenet med det primære antistof. Uspecifik farvning skal være 1+. Positiv farvningsintensitet skal vurderes i relation til en eventuel observeret uspecifik baggrundsfarvning på patientens objektglas med Negative Control Reagent i samme kørsel. Som det er tilfældet med enhver immunhistokemisk analyse, betyder et negativt resultat, at antigenet ikke blev detekteret, ikke nødvendigvis at antigenet ikke var til stede i de analyserede celler/væv. Alle levedygtige tumorceller på hele det PD-L1-farvede patientobjektglas skal evalueres og medtages i PD-L1-scoringsvurderingen. Der skal være mindst 100 levedygtige tumorceller til stede, før præparatet anses for at være egnet til PD-L1-vurdering. Generelle begrænsninger 1. Immunhistokemi er en diagnostisk proces i flere trin, der kræver specialuddannelse i udvælgelse af passende reagenser og væv, fiksering og behandling, klargøring af objektglas til immunhistokemi samt fortolkning af farvningsresultaterne. 2. Vævsfarvningen afhænger af håndteringen og behandlingen af vævsprøverne inden farvningen. Ukorrekt fiksering, nedfrysning, optøning, vask, tørring, opvarmning, sektionering eller kontaminering med andre vævsprøver eller væsker kan medføre artefakter, antistof-trapping eller fejlagtigt negative resultater. Uoverensstemmende resultater kan skyldes forskelle i fikserings- og indstøbningsmetoder eller uregelmæssigheder i selve vævet. 3. For meget eller ufuldstændig modfarvning kan påvirke en korrekt fortolkning af resultaterne. 4. Den kliniske fortolkning af enhver positiv farvning eller mangel på samme skal evalueres i sammenhæng med den kliniske fremtræden, morfologien og andre histopatologiske kriterier. Den kliniske fortolkning af enhver farvning eller mangel på samme skal suppleres med morfologiske undersøgelser og egnede kontroller samt med andre diagnostiske test. En kvalificeret patolog, som er fortrolig med antistofferne, reagenserne og de anvendte metoder, skal være ansvarlig for fortolkningen af det farvede præparat. Farvningen skal udføres på et certificeret laboratorium under overvågning af en patolog, som er ansvarlig for gennemgangen af de farvede objektglas og sikring af, at de positive og negative kontroller er tilstrækkelige. 5. Vævspræparater fra personer, som er inficeret med hepatitis B-virus, og som indeholder hepatitis B overfladeantigen (HBsAg), kan udvise non-specifik farvning med peberrodsperoxidase (7). 6. Reagenser kan udvise uventede reaktioner i vævstyper, der ikke tidligere er blevet testet. Muligheden for uventede reaktioner selv i testede vævstyper kan ikke fuldstændig elimineres på grund af den biologiske variabilitet, der er forbundet med antigenekspression i neoplasmer eller andet patologisk væv. Kontakt teknisk support hos Dako med eventuelle dokumenterede uventede reaktioner. P03928DK_03/SK / s. 6/15

7 7. Falsk positive resultater kan forekomme på grund af ikke-immunologisk binding af proteiner eller substratreaktionsprodukter. De kan også skyldes pseudoperoxidaseaktivitet (erytrocytter) og endogen peroxidaseaktivitet (cytochrome C) (7). 8. Reagenserne og vejledningen i dette system er udviklet til at yde optimalt. Yderligere fortynding af sættets reagenser eller ændring af inkubationstiderne eller -temperaturerne kan give fejlagtige eller uoverensstemmende resultater. Produktspecifikke begrænsninger 1. Falsk negative resultater kan skyldes nedbrydning af antigenet i vævene med tiden. Præparaterne skal farves inden seks måneder efter monteringen af vævene på objektglas, når de opbevares i mørke ved 2-8 C (foretrækkes), eller ved stuetemperatur op til 25 C. 2. For at opnå optimale og reproducerbare resultater kræver PD-L1-proteinet target retrieval-forbehandling, når vævene fikseres (neutralt bufferet formalin) og paraffinindstøbes rutinemæssigt. 3. Udskift ikke med reagenser fra produkter med forskellige lotnumre eller fra sæt fra andre producenter. Den eneste undtagelse er EnVision FLEX Target Retrieval Solution, Low ph 50x, som om nødvendigt kan leveres som kode K Farvede kontrolcellelinjer skal kun anvendes til validering af farvningskørslen og ikke til bedømmelse af farvningsreaktionen i vævssnit. 5. Brug af PD-L1 IHC 22C3 pharmdx på væv med andre fiksativer end formalin er ikke blevet valideret. 6. Brug af PD-L1 IHC 22C3 pharmdx på finnålsaspirater er ikke blevet valideret. Evaluering af klinisk præstation Den kliniske nytte af PD-L1 IHC 22C3 pharmdx blev undersøgt i et åbent, randomiseret multicenterstudie, som blev udført med henblik på at vurdere sikkerheden og virkningen af KEYTRUDA hos patienter med fremskreden NSCLC (9). Patienterne blev bestemt at være PD-L1-positive med en analyse fra et klinisk forsøg (CTA), og deres sygdom var progredieret efter behandling med kemoterapi med platin. Patienter med EGFR- eller ALK-genomiske tumoraberrationer have sygdomsprogression med FDA-godkendt behandling for disse aberrationer, før de fik KEYTRUDA. Patienterne blev randomiseret (1:1:1) til at få 2 mg/kg (n=344) eller 10 mg/kg (n=346) KEYTRUDA hver 3. uge eller 75 mg/m 2 docetaxel hver 3. uge (n=343). Der blev foretaget vurdering af tumorstatus hver 9. uge. De primære endepunkter for virkning var OS (Overall Survival, samlet overlevelse) og PFS (Progression-Free Survival, progressionsfri overlevelse) i henhold til RECIST version 1.1 (Response Evaluation Criteria on Solid Tumors Version 1.1) baseret på blindet evaluering fra uafhængige radiologer. På baggrund af CTA blev i alt NSCLC-patienter randomiseret i studiet. For at vurdere den kliniske anvendelighed af PD-L1 IHC 22C3 pharmdx blev arkiverede prøver fra kliniske studier testet retrospektivt med PD-L1 IHC 22C3 pharmdx på et referencelaboratorium i USA. Af de patienter blev tumorvæv fra 529 patienter testet retrospektivt med PD-L1 IHC 22C3 pharmdxtesten. Præparater fra 413 patienter var positive for PD-L1-ekspression ( 1% af levedygtige tumorceller udvisende membranfarvning med en hvilken som helst intensitet), og prøver fra 94 patienter var negative for PD-L1-ekspression (<1% af levedygtige tumorceller udvisende membranfarvning med en hvilken som helst intensitet). Blandt disse 413 patienter med positiv PD-L1-ekspression havde præparater fra 163 patienter høj PD-L1-ekspression ( 50% af levedygtige tumorceller udvisende membranfarvning med en hvilken som helst intensitet). Det opnåede overensstemmelsesniveau mellem CTA og PD-L1 IHC 22C3 pharmdx er anført i tabel 2. Tabel 2: Overensstemmelse mellem CTA kontra PD-L1 IHC 22C3 pharmdx Overensstemmelsesrater CTA kontra PD-L1 IHC 22C3 pharmdx PD-L1 Afskæring Negativ procentoverensstemmelse (95% konfidensinterval (CI)) Positiv procentoverensstemmelse (95% konfidensinterval (CI)) TPS 1% 94,5% [91,4%-96,6%] 80,0% [76,9%-82,8%] TPS 50% 98,3% [97,1%-99,0%] 73,2% [67,9%-77,9%] Blandt randomiserede patienter, der var positive iht. PD-L1 IHC 22C3 pharmdx, var demografien og andre baseline-karakteristika godt afbalancerede mellem behandlingsgrupperne. Den mediane alder var 63 år (44% var 65 år gamle eller ældre). Hovedparten af patienterne var hvide (77%) og mænd (58%), og ECOG-scoren ved baseline var 0 (29%) eller 1 (71%). Otteoghalvfjerds procent (78%) af patienterne var tidligere/nuværende rygere. Toogtyve procent (22%) af patienterne havde pladecellehistologi, og 69% havde ikkepladecellehistologi. Baseline og de demografiske karakteristika var ligeledes godt afbalanceret mellem pembrolizumab- og docetaxelgrupperne i det samlede kliniske studie. Effektresultaterne er opsummeret i tabel 3. Der blev påvist længerevarende klinisk nytte af KEYTRUDA hos NSCLC-patienter med positiv PD-L1-ekspression med TPS 1%, hvilket var forstærket hos patienter med høj PD-L1-ekspression af TPS 50%, som påvist med PD-L1 IHC 22C3 pharmdx. Nytteværdiens størrelse var sammenlignelig med den for det overordnede kliniske forsøg. Tabel 3 viser en opsummering af de vigtigste virkningsmål i den samlede PD-L1-positive population (TPS 1%) samt i undergruppen med PD-L1 positiv høj ekspression (TPS 50%) i det samlede kliniske forsøg (PD-L1-positiv iht. CTA) samt i den population, der var positiv iht. PD-L1 IHC 22C3 pharmdx. Kaplan-Meier-kurven for OS (TPS 1%, som påvist af PD-L1 IHC 22C3 pharmdx), vises i figur 1. P03928DK_03/SK / s. 7/15

8 Tabel 3: Respons på KEYTRUDA hos tidligere behandlede NSCLC-patienter: Samlet klinisk studie og PD-L1 IHC 22C3 pharmdx-positive patienter: PD-L1 TPS 1% og TPS 50% KEYTRUDA KEYTRUDA Docetaxel Endepunkt 2 mg/kg hver 3. uge 10 mg/kg hver 3. uge 75 mg/m 2 hver 3. uge Klinisk forsøg PD-L1 IHC 22C3 pharmdx Klinisk forsøg PD-L1 IHC 22C3 pharmdx Klinisk forsøg PD-L1 IHC 22C3 pharmdx TPS 1% Antal patienter OS Dødsfald (%) 172 (50%) 59 (42%) 156 (45%) 59 (42%) 193 (56%) 67 (51%) Hazard ratio 0,71 0,54 0,61 0,57 (0,58, 0,88) (0,37, 0,78) (0,49, 0,75) (0,39, 0,82) p-værdi <0,001 <0,001 <0,001 0, Median i måneder 10,4 (9,4, 11,9) 11,8 (9,6, NA) 12,7 (10,0, 17,3) 12,0 (8,7, NA) 8,5 (7,5, 9,8) 7,5 (6,3, 9,9) PFS Hændelser (%) 266 (77%) 97 (63%) 255 (74%) 103 (73%) 257 (75%) 94 (72%) Hazard ratio 0,88 0,68 0,79 0,79 (0,73, 1,04) (0,50, 0,92) (0,66, 0,94) (0,59, 1,06) p-værdi 0,068 0, ,005 0, Median i måneder 3,9 4,9 4,0 4,0 4,0 3,8 (3,1, 4,1) (4,1, 6,2) (2,6, 4,3) (2,2, 4,6) (3,1, 4,2) (2,2, 4,2) Samlet responsrate ORR % 18% (14, 23) 24% (17, 32) 18% (15, 23) 20% (14, 28) 9% (7, 13) 5% (2, 11) TPS 50% Antal patienter OS Dødsfald (%) 58 (42%) 18 (32%) 60 (40%) 19 (32%) 86 (57%) 25 (53%) Hazard ratio 0,54 0,45 0,50 0,29 (0,38, 0,77) (0,24, 0,84) (0,36, 0,70) (0,15, 0,56) p-værdi <0,001 0,00541 <0,001 <0, Median i måneder 14,9 (10,4, NA) Ikke nået (9,3, NA) 17,3 (11,8, NA) Ikke nået (8,3, NA) 8,2 (6,4, 10,7) 7,2 (4,4, 8,3) PFS Hændelser (%) 89 (64%) 33 (59%) 97 (64%) 34 (57%) 118 (78%) 33 (70%) Hazard ratio 0,58 0,47 0,59 0,41 (0,24, (0,43, 0,77) (0,28, 0,80) (0,45, 0,78) 0,70) p-værdi <0,001 0,00221 <0,001 <0, Median i måneder 5,2 (4,0, 6,5) 5,9 (4,2, 9,0) 5,2 (4,1, 8,1) 4,8 (2,8, NA) 4,1 (3,6, 4,3) 3,9 (2,0, 4,3) Samlet responsrate ORR % 30% (23, 39) 37% (25, 52) 29% (22, 37) 28% (18, 41) 8% (4, 13) 4% (1, 15) * Hazard ratio (KEYTRUDA sammenlignet med docetaxel) baseret på den stratificerede "Cox proportional hazard"-model Baseret på stratificeret log rank-test Bedømt ved BICR vha. RECIST 1.1 Alle responser var delvise responser Baseret på patienter med en bedste samlede respons som bekræftet komplet eller delvis respons P03928DK_03/SK / s. 8/15

9 Figur 1: Kaplan-Meier-kurve for samlet overlevelse ud fra behandlingsgruppe (TPS 1% efter PD-L1 IHC 22C3 pharmdx, Intent to Treat-population) Samlet overlevelse (%) Docetaxel 75 mg/m2 hver 3. uge MK mg/kg hver 3. uge MK mg/kg hver 3. uge n i risikogruppe Docetaxel 75 mg/m2 hver 3. uge Tid i måneder MK mg/kg hver 3. uge MK mg/kg hver 3. uge Der blev gennemført yderligere robusthedsanalyser for at tage højde for den potentielle påvirkning af manglende data som følge af patienter, som havde positiv PD-L1 IHC 22C3 pharmdx-testresultater, men som muligvis var negative iht. CTA. Patienter med sådanne testresultater er en del af den tilsigtede anvendelsespopulation/itd-populationen (intent to diagnose) for PD-L1 IHC 22C3 pharmdx, men de blev udelukket fra det kliniske forsøg på grund af negative resulter efter CTA-screening. For at opveje disse manglende data blev der gennemført en sensitivitetsanalyse for at forstå det mulige interval for den hazard ratio (HR), der blev anslået ud fra PD-L1 IHC 22C3 pharmdx i TPS 1%- og TPS 50%-underpopulationerne i en ITD-ramme med henblik på at verificere overensstemmelsen med den observerede HR på baggrund af rekruttering med CTA. HR-sensitivitetsanalyseresultaterne viste, at HR-estimaterne er robuste vedrørende en hvilken som helst antaget dæmpning af behandlingens virkning under ITD-rammen. P03928DK_03/SK / s. 9/15

10 Evaluering af ikke-klinisk præstation Analytisk sensitivitet/specificitet Analytisk sensitivitet for PD-L1 IHC 22C3 pharmdx blev testet på 127 unikke tilfælde med FFPE-præparater af ikke-småcellet lungekarcinom (NSCLC) i stadie I til IV med anvendelse af et fremstillet produktionslot. Vurderingen af PD-L1-ekpression viste farvning i hele området af 0-100% positive tumorceller og farvningsintensitet 0-3. Normalt væv: Tabel 4 giver en oversigt over immunreaktiviteten for Monoclonal Mouse Anti-PD-L1, Clone 22C3 på det anbefalede panel af normalt væv. Plasmamembranfarvning blev observeret på immunceller og celler af epiteloprindelse. Cytoplasmisk farvning blev observeret i nogle celletyper, men blev ikke registreret som positiv farvning. Alle væv blev formalinfikseret og paraffinindstøbt samt farvet med PD-L1 IHC 22C3 pharmdx i henhold til vejledningen i denne indlægssedlen. Der blev ikke observeret uventede resultater i de testede celle- eller vævstyper. Den observerede farvning stemte overens med data fra litteraturen med hensyn til PD-L1 IHC-ekspression i normale væv (10, 11). Tabel 4: Oversigt over reaktivitet af PD-L1 IHC 22C3 pharmdx i normalt væv Vævstype (antal analyserede) Positiv plasmamembranfarvning: Vævselementer Positiv cytoplasmisk farvning: Vævselementer Binyre (3) 0/3 1/3 medullære celler 0/3 Bryst (3) 0/3 0/3 0/3 Cerebellum (3) 0/3 0/3 0/3 Cerebrum (3) 0/3 0/3 0/3 Cervix (3) 1/3 epitel 0/3 0/3 Colon (3) 2/3 Makrofager 0/3 0/3 Hud (3) 0/3 0/3 0/3 Hypofysen (3) 1/3 Anterior hypofyse 1/3 Anterior hypofyse 0/3 1/3 Posterior hypofyse 1/3 Posterior hypofyse Knoglemarv (3) 3/3 megakaryocytter 3/3 megakaryocytter 0/3 Lever (3) 1/3 Makrofager 0/3 0/3 1/3 Hepatocytter Lunge (3) 3/3 alveolære makrofager 0/3 0/3 Mavesæk (3) 2/3 Lymfocytter 1/3 Funduskirtler 0/3 1/3 Funduskirtler Mesotelceller (2) 0/2 0/2 0/2 Milt (3) 2/3 Makrofager 0/3 0/3 Muskel, hjerte (3) 0/3 0/3 0/3 Muskel, skelet (3) 0/2 0/2 0/2 Nerve, perifert (3) 0/3 1/3 Bindevæv/kar 0/3 Nyre (3) 1/3 cylinderepitel 0/3 0/3 Oesophagus (3) 0/3 0/3 0/3 Ovarie (3) 0/3 0/3 0/3 Pancreas (3) 0/3 0/3 0/3 Parathyroidea (3) 1/3 Kirtelepitel 0/3 0/3 Prostata (2) 2/2 epitel 0/2 0/2 Spytkirtel (3) 0/3 0/3 0/3 Testikel (3) 0/3 0/3 0/3 Thymus (3) 3/3 medullært epitel 0/3 0/3 Thyroidea (3) 0/3 0/3 0/3 Tonsil (3) 3/3 kryptepitel 0/3 0/3 2/3 Germinalcenter (makrofager) Tyndtarm (3) 0/3 0/3 0/3 Uterus (3) 0/3 0/3 0/3 Uspecifik farvning Neoplastisk væv: Tabel 5 indeholder en oversigt over immunreaktivitet for Monoclonal Mouse Anti-PD-L1, Clone 22C3 på et panel af neoplastisk væv. Plasmamembranfarvning blev observeret på immunceller og celler af epiteloprindelse. Cytoplasmisk farvning blev observeret i nogle celletyper, men blev ikke registreret som positiv farvning. Alle væv blev formalinfikseret og paraffinindstøbt samt farvet med PD-L1 IHC 22C3 pharmdx i henhold til vejledningen i denne indlægssedlen. Der blev ikke observeret uventede resultater i de testede tumorpræparater. Den observerede farvning stemte overens med data fra litteraturen med hensyn til PD-L1 IHC-ekspression i neoplastiske væv (10-13). Tabel 5: Oversigt over reaktivitet af PD-L1 IHC 22C3 pharmdx i neoplastisk væv Tumortype Placering PD-L1-positiv/total N=159 Appendix 0/1 Bryst, DCIS 0/2 Bryst, invasiv duktal 0/7 Bryst, invasiv duktal, metastatisk til lymfeknude 0/1 Adenokarcinom Cervix, endocervikal type 0/1 Colon 0/5 Colon, metastatisk til lever 0/1 Colon, mucinøs 0/1 Galdeblære 1/5 GI, metastatisk til lunge 0/1 P03928DK_03/SK / s. 10/15

11 Tumortype Placering PD-L1-positiv/total N=159 Hoved og hals, hårde gane 0/1 Lunge 1/4 Mave 0/6 Mavesæk, mucinøs 0/1 Oesophagus 0/1 Ovarie 0/1 Ovarie, endometrioid 0/1 Ovarie, mucinøs 0/1 Ovarie, serøs 0/1 Pancreas 0/2 Pancreas, duktal 0/3 Prostata 0/5 Rectum 0/4 Spytkirtel/parotis 0/2 Thyroidea, follikulær 0/1 Thyroidea, follikulær-papillær 0/1 Thyroidea, papillær 0/3 Tyndtarm 0/2 Uterus, clear cell 0/1 Uterus, endometrium 0/3 Adrenokortikalt karcinom Adrenal 0/1 Astrocytom Cerebrum 0/3 Basalcellekarcinom Hud 0/1 Chondrosarkom Knogle 0/1 Chordom Bækkenhule 0/1 Embryonalt karcinom Testikel 0/1 Ependymom Hjerne 0/1 Glioblastom Hjerne 0/1 Hepatoblastom Lever 0/1 Hepatocellulært karcinom Lever 0/5 Colon 0/1 Interstitialom Rectum 0/1 Tyndtarm 0/1 Karcinom Nasofaryngeal, NPC 0/1 Leiomoysarkom Blære 0/1 Bløddele, brystvæg 0/1 Lymfom Anaplastiske storcellet Lymfeknude 0/1 Diffus B-celle Lymfeknude 0/4 Hodgkin Lymfeknude 2/2 Non-Hodgkin Lymfeknude 1/1 Medulloblastom Hjerne 0/1 Medullært karcinom Thyroidea 0/1 Melanoma Næsehule 0/1 Rectum 0/1 Meningiom Hjerne 0/2 Mesotheliom Peritoneum 0/1 Neuroblastom Retroperitoneum 0/1 Neurofibrom Bløddele, nedre ryg 0/1 Osteosarkom Knogle 0/2 Pheochromocytom Adrenal 0/1 Cervix 2/5 Hoved og hals 0/2 Hud 0/2 Lunge 1/2 Pladecellekarcinom Oesophagus 0/7 Pladecellekarcinom i oesophagus metasteret til lymfeknude 0/1 Uterus 0/1 Primitiv neuroektodermal tumor (PNET) Retroperitoneum 0/1 Renalt cellekarcinom Clear cell Nyre 0/6 Papillær Nyre 0/1 Bløddele, embryonal 0/1 Rhabdomyosarkom Prostata 0/1 Retroperitoneum 0/1 Seminom Testikel 0/2 Colon 0/1 Signetringcellekarcinom Signetringcellekarcinom i colon metasteret til ovarie 0/1 Småcellet karcinom Lunge 0/1 Spermatocytisk seminom Testikel 0/2 Synovialt sarkom Bækkenhule 0/1 Thymom Mediastinum 1/1 P03928DK_03/SK / s. 11/15

12 Tumortype Placering PD-L1-positiv/total N=159 Blære 0/6 Transitionalt cellekarcinom Nyre 0/1 Øcelletumor Pancreas 0/1 Gentagelsesnøjagtighed/ekstern reproducerbarhed Gentagelsesnøjagtigheden og reproducerbarheden for PD-L1 IHC 22C3 pharmdx blev evalueret hos Dako og på tre eksterne testlaboratorier. Præstationsdata vises i tabel 6-9. I de gentagelsesnøjagtighedsstudier, der blev udført hos Dako, blev negativ procentoverensstemmelse (NPA), positiv procentoverensstemmelse (PPA) og samlet overensstemmelse (OA) bestemt for 1% afskæring og 50% afskæring som vist i tabel 6 og tabel 7. Eftersom gentagelsesnøjagtighedsstudierne medførte 100% overensstemmelse, blev konfidensintervallerne beregnet med Wilson Score-metoden, baseret på antallet af uafhængige parvise sammenligninger. I de eksterne reproducerbarhedsstudier blev gennemsnitlig negativ procentoverensstemmelse (ANA), gennemsnitlig positiv procentoverensstemmelse (APA) og samlet overensstemmelse (OA) bestemt for 1% afskæring og 50% afskæring som vist nedenfor i tabel 8 og tabel 9. Gennemsnitlig overensstemmelse blev beregnet, da der ikke findes nogen naturlig reference i reproducerbarhedsparametrene som f.eks. laboratorium og observatør. Konfidensintervaller for den gennemsnitlige overensstemmelse blev beregnet med en "percentile bootstrap"-metode. (Bemærk, at gentagelsesnøjagtighedsstudierne ikke blev analyseret med "bootstrap"-konfidensintervaller, da disse ikke kan beregnes ud fra data uden diskordans). Tabel 6: Gentagelsesnøjagtighed for PD-L1 IHC 22C3 pharmdx testet på ét laboratorium ( 1%) Gentagelsesnøjagtighedsstudie Diagnostisk afskæring Studiedesign Mellem instrumenter 1% Hvert af 16 NSCLC-præparater (8 PD-L1- negative og 8 PD-L1-positive) med et testet på alle seks Autostainer Link 48- instrumenter. Mellem operatører 1% Hvert af 16 NSCLC-præparater (8 PD-L1- negative og 8 PD-L1-positive) med et testet af seks analytikere på ét Autostainer Link 48-instrument. Fra forskellige dage 1% Hvert af 16 NSCLC-præparater (8PD-L1- negative og 8 PD-L1-positive) med et testet på seks ikke på hinanden følgende dage på Autostainer Link 48-instrumentet. Fra forskellige lot 1% Hvert af 16 NSCLC-præparater (8 PD-L1- negative og 8 PD-L1-positive) med et testet med tre replikater med hvert af de tre reagenslot på Autostainer Link 48- instrumentet. Inden for kørsler 1% Hvert af 16 NSCLC-præparater (8 PD-L1- negative og 8 PD-L1-positive) med et testet med seks replikater inden for en kørsel på Autostainer Link 48-instrumentet. Inden for samme dag 1% Hvert af 16 NSCLC-præparater (8PD-L1- negative og 8 PD-L1-positive) med et testet i to kørsler på samme dag, gentaget over tre dage, på Autostainer Link 48- instrumentet. NPA = Negativ procentoverensstemmelse; PPA = Positiv procentoverensstemmelse; OA = Samlet overensstemmelse % overensstemmelse NPA 100% (91,2-100%) PPA 100% (91,2-100%) NPA 100% (91,0-100%) PPA 100% (91,2-100%) NPA 100% (91,2-100%) PPA 100% (91,2-100%) NPA 98,6% (96,0-100%) PPA 98,6% (95,7-100%) OA 98,6% (95,8-100%) NPA 100% (91,2-100%) PPA 100% (91,2-100%) NPA 100% (91,0-100%) PPA 100% (91,2-100%) Tabel 7: Gentagelsesnøjagtighed for PD-L1 IHC 22C3 pharmdx testet på ét laboratorium ( 50%) Gentagelsesnøjagtighedsstudie Diagnostisk afskæring Studiedesign Mellem instrumenter 50% Hvert af 16 NSCLC-præparater (10 PD-L1- negative og 6 PD-L1-positive) med et testet på alle seks Autostainer Link 48- instrumenter. Mellem operatører 50% Hvert af 16 NSCLC-præparater (10 PD-L1- negative og 6 PD-L1-positive) med et testet af seks analytikere på ét Autostainer Link 48-instrument. Fra forskellige dage 50% Hvert af 16 NSCLC-præparater (10 PD-L1- negative og 6 PD-L1-positive) med et testet på seks ikke på hinanden følgende dage på Autostainer Link 48-instrumentet. % overensstemmelse NPA 100% (92,9-100%) PPA 100% (88,6-100%) NPA 100% (92,7-100%) PPA 100% (88,6-100%) NPA 100% (92,9-100%) PPA 100% (88,6-100%) P03928DK_03/SK / s. 12/15

13 Gentagelsesnøjagtighedsstudie Diagnostisk afskæring Studiedesign Fra forskellige lot 50% Hvert af 16 NSCLC-præparater (8 PD-L1- negative og 8 PD-L1-positive) med et testet med tre replikater med hvert af de tre reagenslot på Autostainer Link 48- instrumentet. Inden for kørsler 50% Hvert af 16 NSCLC-præparater (10 PD-L1- negative og 6 PD-L1-positive) med et testet med seks replikater inden for en kørsel på Autostainer Link 48-instrumentet. Inden for samme dag 50% Hvert af 16 NSCLC-præparater (10 PD-L1- negative og 6 PD-L1-positive) med et testet i to kørsler på samme dag, gentaget over tre dage, på Autostainer Link 48- instrumentet. NPA = Negativ procentoverensstemmelse; PPA = Positiv procentoverensstemmelse; OA = Samlet overensstemmelse % overensstemmelse NPA 100% (92,6-100%) PPA 100% (92,6-100%) OA 100% (96,2-100%) NPA 100% (92,9-100%) PPA 100% (88,6-100%) NPA 100% (88,3-100%) PPA 100% (82,4-100%) OA 100% (92,4-100%) Tabel 8: Reproducerbarhed for PD-L1 IHC 22C3 pharmdx testet på tre eksterne laboratorier ( 1%) Reproducerbarhedsstudie Diagnostisk afskæring Studiedesign Mellem laboratorier 1% Hvert af de 36 NSCLC-præparater (16 PD-L1- negative og 20 PD-L1-positive) med et område af PD-L1 IHC-ekspression blev testet på fem ikke på hinanden følgende dage. Analysen mellem laboratorier blev udført mellem tre laboratorier på i alt 2700 parvise sammenligninger. Fra samme laboratorie 1% Hvert af de 36 NSCLC-præparater (16 PD-L1- negative og 20 PD-L1-positive) med et område af PD-L1 IHC-ekspression blev testet på fem ikke på hinanden følgende dage på hvert af tre laboratorier. Analysen inden for laboratorier blev udført for tre laboratorier på i alt 1080 parvise sammenligninger. Mellem observatører 1% Scoring af 62 NSCLC-præparater (28 PD-L1- negative og 34 PD-L1-positive) med et område af PD-L1 IHC-ekspression farvet med PD-L1 IHC 22C3 pharmdx blev udført at tre patologer, én på hvert af de tre undersøgelseslaboratorier, på tre ikke på hinanden følgende dage. Analysen mellem observatører blev udført mellem tre laboratorier på i alt 1674 parvise sammenligninger. Fra samme observatør 1% Scoring af 62 NSCLC-præparater (28 PD-L1- negative og 34 PD-L1-positive) med et område af PD-L1 IHC-ekspression farvet med PD-L1 IHC 22C3 pharmdx blev udført at tre patologer, én på hvert af de tre undersøgelseslaboratorier, på tre ikke på hinanden følgende dage. Analysen fra samme observatør blev udført for tre laboratorier på i alt 558 parvise sammenligninger. % overensstemmelse ANA 94,8% (90,3 98,4%) APA 95,5% (91,2 98,7%) OA 95,2% (90,8 98,6%) ANA 96,2% (94,1-97,5%) APA 96,7% (95,0-97,9%) OA 96,5% (95,2-97,4%) ANA 85,8% (79,3-91,8%) APA 88,2% (82,2-93,3%) OA 87,1% (81,0-92,6%) ANA 93,7% (90,0-96,1%) APA 94,8% (91,6-96,7%) OA 94,3% (92,0-95,9%) ANA = Gennemsnitlig negativ overensstemmelse; PPA = Gennemsnitlig positiv overensstemmelse; OA = Samlet overensstemmelse P03928DK_03/SK / s. 13/15