Identifikation af CYP2B6 Sekvensvarianter ved Brug af Restriktions analyse

Transkript

1 Identifikation af CYP2B6 Sekvensvarianter ved Brug af Restriktions analyse Udarbejdet af: Susan Nørmann Andersen projektperiode: April 2009 Juni 2009 Projekttype: bachelorprojekt Vejledere: Henrik B Rasmussen (Institut for biologisk psykiatri) Jesper Bahrenscheer Uddannelse: Bioanalytikeruddannelsen København -1-

2 Forord Dette bachelorprojektet er lavet på Institut for biologisk psykiatri. Efter projektets gennemførelse, vil resultaterne blive brugt af en phd studerende i hendes projekt. Projektet omhandler opbygning af PCR (Polymerase Chain Reaction) restriktions - assay, i forbindelse med identifikation af SNP'er i CYP2B6. Rapporten er opbygget i IMRAD format. (Introduction, Methods, Result And Discussion). Introduktionen består af problembaggrund, målsætning og relevant teori. Metoden vil indeholde forskellige optimeringsprocesser. Resultaterne vil være bygget op over optimeringsprocesserne, og billeder af agarosegeler der påviser disse. Jeg vil gerne benytte forordet til også at takke alle på Institut for biologisk psykiatri for at tage så godt i mod, og fået mig til at føle mig hjemme lige fra dag 1. Herunder skal lyde en speciel tak til Gerda, Lisbeth, Tina og Henrik, der altid har stået klar med en hjælpende hånd, når jeg har haft brug for det. Ikke mindst en stor tak til Jesper, vejleder fra skolen, som har bistået med god vejledning undervejs i forløbet. Roskilde 8. Juni 2009 Susan Nørmann Andersen -2-

3 Resume Skræddersyet medicin er en ny term i den lægelige verden. Dette dækker over individuel medicinering i forhold til ens genotyper. Rapporten her beskriver en metode, hvorpå man kan påvise SNP er i CYP2B6 genet. SNP er i CYP2B6 har betydning for metabolismen i leveren, i forhold til visse medikamenter såsom medicin til HIV og malaria. Vi har med projektet udviklet et assay til genotypning af 5 SNP er i exon 1 af CYP2B6 baseret på skæring af samme PCR-amplificerede fragment med en række forskellige restriktionsenzymer. Der er levet brugt 5 forskellige enzymer der alle hjælper til indetificering af de 5, føromtalte, SNP er. Metoden er bygget op over et PCR restriktions assay, hvor SNP er lokaliseres med restriktionsskæringer. Herunder optimering af PCR, restrikstions assay, og behandling af resultater. Der er lokaliseret 9 SNP er i CYB2B6 genet, som der er udgangspunkt for dette assay. Det har ikke været muligt at påvise dem alle. Dog er enkelte SNP er blevet påvist med stor succes, og haplotypen CYP2B6*10 er blevet det endelig resultat for alle vores patientprøver. Dog er assayet endnu ikke blevet optimeret til en sådan grad at det kan blive indført på nuværende tidspunkt. -3-

4 Indholdsfortegnelse Forord... 1 Resume... 3 Indholdsfortegnelse INTRODUKTION Problembaggrund Problemformulering Problemuddybning Hypoteser Metodevalg BAGGRUNDSTEORI PCR Princippet bag PCR MgCl koncentrationer Deoxynukleotider dntp Primere Taq-polymerase Annealing Elektroforese Restriktionsenzymer Star aktivitet BioLabs enzymer Sekventering Sequence Alignment Pseudogener Single nukleotid polymorphisme Haplotyper MATERIALER OG METODER Metodevalg Primer og primeroptimering Lokalisering af SNP'er Restriktionsenzymer Materialeliste: Kliniske prøver:

5 4 RESULTATER Optimering Assay med primerpar Assay primerpar 1-2 optimering MgCl konc Assay primerpar 4-5 optimering af temp. og MgCl Assay nyt primerpar optimering Assay Optimering på alle primerpar Assay primerpar 1-2 og 3-4 temp optimering Sekventering: Assay Sekventering- primerpar 1-2 og 3-4 temp optimering Skæringer Skæring Skæring DISKUSSION Optimeringer sekventering Restriktions skæringer Overvejelser i forbindelse med bestemmelse af enzymer Skæring med restriktionsenzymer KONKLUSION Perspektivering: Referencer:

6 1 INTRODUKTION Farmakogenetik er et nyere begreb i forskningens univers. Man forventer, at man med tiden kan tilpasse medicineringen til den enkelte patient på baggrund af en molekylært baseret diagnose og en genetisk profilering. I fremtiden vil det måske blive muligt, at kunne lave en DNA analyse af patienterne, og dermed kunne medicinere korrekt i forhold til deres genetiske opbygning. Man bruger udtryk som normal metabolizer, fast metabolizer og poor metabolizer, disse giver et udtryk for hvor hurtigt eller langsomt man omsætter medicin. Det er et velkendt fænomen, at der er større eller mindre dele af patienterne der ikke respondere på et givent lægemiddel. Denne rapport ligger til grund for videre forskning inden for farmakogenetik, i forhold til medikamenter som antidepressivt middel: bupropion, som også bruges til rygeafvænning 1, artemisinine, antimalaria medicin og anti-parkinson medicin selegiline. (3) Som hovedopgave er der designet et PCR-restriktions assay, som giver produktet CYP2B6 genet, og derefter udvælge restriktionsenzymer, der kan påvise SNP'er (single nukleotide polymorphisme). Det har dog ikke være muligt at finde nok enzymer til at påvise alle SNP'er. Det har dog været med succes, at de enzymer der er fundet, blev brugt. 1.1 Problembaggrund CYP2B6 er ansvarlig for nedbrydning af en række vigtige typer lægemidler. Herunder lægemidler mod HIV og malaria. Variationer i genet der koder for dette enzym, medfører at omsætningen af disse lægemidler er langsom hos nogle mennesker og hurtigere end normalt hos andre. Dette kan have betydning for udfaldet af behandlingen. Normal metabolizer: Udtryk som bruges om patienter som har effekt af og som kan tåle en stadarddosis medicin. Udgør næsten 70% af en befolkning. 1 /UFL_2004_42/UFL 2004_42_

7 Slow metabolizer: Udtryk som bruges om patienter med mange genetiske varianter, som medfører at nedbrydning af medicin ikke er muligt eller at medicinen nedbrydes så langsomt at det resulterer i ophobning i kroppen, og dermed en øget sandsynlighed for bivirkningssymptomer. Patienter med en langsom metabolisme kan have gavn af lavere dosis medicin. Patienter med langsom metabolisme udgør ca. 10% af en befolkning. Der tilkan regnes ca. 18% ud af en befolkning som kan have en nedsat omsætningskapacitet. Fast Metabolizer: Udtryk som bruges om patienter, ligeledes med genetiske varianter, som medfører at medicin nedbrydes meget hurtigt. Dette kan resultere i at patienten ikke får den ønskede virkning af en standard dosis medicin. Disse patienter har en meget hurtig metabolisme og udgør ca. 3% af en befolkning. 2 For at kunne hjælpe både læger og patienter med medicineringen, skal man kunne identificere de SNP'er der spiller en rolle for metabolismen. 1.2 Problemformulering Kan man udvikle et assay baseret på PCR og skæring med restriktionsenzymer, der kan bestemme flere SNP er samtidigt, og skelne mellem SNP er der ligger tæt på hinanden? - Herunder udvælgelse af primere der er specifikke for CYP2B6 genet altså ikke amplificerer andre medlemmer af CYP-gen familien. 1.3 Problemuddybning Hypoteser Ved omhyggeligt valg af restriktionsenzymer håber vi det er muligt at skelne mellem to SNP er der ligger tæt på hinanden. Ved omhyggelig design af primere er det muligt specifikt at amplificere fragmenter af CYP2B6 genet. Fx ved at lægge primerne i introns der er langt mindre konserveret end exons. 2

8 1.3.2 Metodevalg Programmer til påvisning af enzymsites, såsom NEBcutter 3. Programmer til primerdesign og test af hvorvidt et primerpar er specifikt eller amplificerer uønskede sekvenser. Opsæt og optimering af PCR reaktion. Skæring af PCR produktioner Agarosegel elektroforese Sekventering Alignment af DNA sekvenser

9 2 BAGGRUNDSTEORI -9-

10 2.1 PCR Det er nødvendig i arbejdet med DNA at simplificere denne, da man normalt kun har en lille mængde til rådighed. Dette gøres vha PCR. Dette foregår ved en fordoblingsproces. Men ved at gentage denne proces kan man få nogle enkelte DNA strenge til at blive til flere milliarder. Opskrift på PCR-mix Eks. MgCl konc= 2,25 Vand Buffer MgCl (25mM) dntp (10 mm each) Primer Primer Amplitaq Template (10ug/ml) 10ul assay x 1 prøve 5,8 ul 1 ul 0,9 ul 0,2 ul 0,5 ul 0,5 ul 0,1 ul 1 ul Princippet bag PCR Mixen opvarmes til 95 grader, hvor hydrogenbindingerne brydes, og man får således enkelt strenget DNA. Mixen nedkøles hurtigt til 54 grader, da forbliver det enkeltstrenget. De to primere sætter sig nu fast til deres komplementære områder(annealing), på hver sin side af DNA'et. Mixen opvarmes til 72 grader, som er den optimale temperatur for DNA-polymerasen at arbejde i. Polymerasen tilføjer nu komplimentære nukleotider til den DNA-streng der sidder i forlængelse af primerne. På den måde dannes dobbeltstrenget DNA. Herefter opvames mixen igen til 95 grader, hvor hydrogen bindingerne brydes, så DNA'et kommer på enkeltstrenget form igen. Se figur

11 Figur 1PCR princip MgCl koncentrationer Taq-polymerasens aktivitet afhænger af frie Mg-ioner, som fungerer som co-faktorer for enzymet. dntp molekylerne binder Mg++ i forholdet 1:1, derfor vil en ændring i dntp koncentrationen, automatisk påvirke koncentrationen af frit Mg++, hvilket medfører fald i enzymaktiviteten. Hvis MgCl2 koncentrationen er for lav, vil dette medføre en ringe eller intet udbytte af amplifikationen. Omvendt vil en for høj koncentration medføre en uspecifik amplifikation, eller en hæmning af polymerasen. Som regel, bør MgCl2 koncentrationen altid være 0,2-2,5 mm højere end den totale dntp koncentration, så der altid til være frie Mg-ioner til rådighed til polymerasen Deoxynukleotider dntp Består af datp, dttp, dgtp, dctp. dntp har 2 funktioner i reaktionen: 1.dNTP udgør byggestene i DNA, da deoxynukleotider gennem esterbindinger forbinder sig med hinanden i dannelsen af DNA strengen. 2.dNTP tilfører reaktionen energi, som er nødvendigt fordi DNA syntesen er en energikrævende proces. Under processen frigøres der energi ved fraspaltning af de 2 yderste fosfatgrupper i dntp. Der optimeres oftest inden for området uM af hver dntp. For høj dntp kan medføre, at polymerasen inkorporerer for mange fejlbaser udover enzymets naturlige -11-

12 fejlinkorporeringsfrekvenser (bestemt for Taq til 1 ud af 400 baser ved 30 cykler, og kun gældende for de enzymer, som ikke har proof reading). En for lav dntp koncentration vil omvendt betyde, at PCR-udbyttet mindskes. De 4 nukleotider bør for øvrigt altid forefindes i reaktionsblandingen i samme koncentration for at mindske fejlinkorporering. Ved optimering vælges den laveste konventration, der giver en rimeligt udbytte Primere Primere er enkeltstrenget DNA stykker der svarer til en del af DNA-sekvensen (cirka 20 baser) på hver ende af det stykke man ønsker at opformere. For at kunne foretage en specifik DNA-amplifikation, skal man konstruere primere som binder sig specifikt til det ønskede område. Man skal under udvælgelsen af primere tage højde for flere faktorer: 1. Primerne bør være mellem 18 og 30 basepar lange. Dertil bør GC indholdet være 40-60%. Hvis primerne bliver for lange, øger man risikoen for primer-dimer, mens, hvis primerne er for korte øges risikoen for uspecifikke bindinger, andre steder på DNA'et, hvor man ikke ønsker det. 2. Det er vigtigt at især 3'enden er specifikt i forhold til DNA'et, da man ellers kan komme ud for at 3'enden sætter sig et forkert sted, og dermed ikke kan kopiere den ønskede streng. 3. Man bør undgå sekundærstrukturer i den enkelte primer. En sekundærstruktur i primeren, kan medføre, at primeren ikke binder sig specifikt til DNA'et. 4. Undgå at 3'enderne ikke er komplimentære, da disse ellers vil kunne sætte sig til hinanden, i stedet for til DNA'et som man ønsker opformeret. 5. Undgå for mange baser af typen A og G (polypurin), eller mange baser af typen T og C (polypyrimidin). Da dette vil føre til en ujævn basesammesætning i primerne og dermed give problemer med at finde et optimalt annealingstemperatur. De 2 primere bør have nogenlunde samme Tm, ellers vil annelingstemperaturen være for høj for den ene primer. Man risikerer da at der enten ikke fremkommer PCR produkt eller at der sker en uspecifik amplifikation. -12-

13 Ved optimering af primerkoncentrationer arbejder man normalt inden for 0,1 1ul af hver primer. Hvis man arbejder med for høje primer koncentrationer, kan dette medføre annealing til de forkerte DNA sekvenser, samt øge risikoen for primer-dimer-dannelse. Omcendt vil for lave primerkoncentrationer giver et for lavt, eller måske intet udbytte. Ved optimering bør vælges den laveste koncentration der giver et rimeligt udbytte. 2.2 Taq-polymerase Er et varmestabilt enzym fra en termofil bakterie. DNA polymerasen katalyserer DNA syntesen, ud fra en enkeltstrenget template streng med et dobbeltstrenget stykke som startsted. Ved optimering af polymerasen arbejder man normalt inden for 0,5-5 units pr. 100 ul reaktionsmix. Man bør vælge den laveste koncentration der giver et rimeligt udbytte (også ud fra økonomiske overvejelser). Taqpolymerasen er påsat et antigen, som gør at polymerasen er deaktiveret. Ved hotstart, altså en væsentlig forøgelse af temperaturen, vil dette antigen blive fraspalet, og polymerasen være aktivt. 2.3 Annealing En tommelfinger regel siger at annelings temperaturen kan beregnes ud fra formlen: Tm= 4 x (antal G+C) + 2 x (antal A+T). Dermed afhænger annelingstemperaturen af længden af primeren og forholdet mellem C+G og T+A. Optimering af annelings temperatur. Som regel kan man starte optimeringen med 5C under Tm, for primeren med den laveste Tm. Efterhånden kan man hæve temperaturen indtil amplifikationen er tilfredsstillende. Hvis man arbejder med en for lav annealingstemperatur vil dette resultere i at den ene eller begge primere amplificerer andet sted end target DNA, og dermed kopierer andre sekvenser Hvis annealings temperaturen er for høj, bliver sandsynligheden for at primerne annealer til template reduceret, og dette kan resultere i for lavt udbytte eller ingen amplifikation Elektroforese Gelen laves manuelt i takt med man skal bruge den. Gelen placeres i et kar hvor man sætter en spænding over. Da DNA er er negativt ladet, pga. fosfat grupperne, vil de vandre mod den positive pol i karret. 4 PCR kompendium Indutriens Uddannelser -13-

14 Når elektroforesen er færdig, vil de kortere stykker DNA være vandret længere end de størrer stykker. Derpå kan man se en præcis adskillelse af DNA stykkerne. Efter PCR reaktionen er færdig, tilsætter man sine prøver noget farvet loadingbuffer, så man på gelen kan se hvad man laver og hvor langt den er kørt. 2.5 Restriktionsenzymer Restriktionsenzymer er enzymer der kommer fra bakterier. Restriktionsenzymer er meget specifikke, og klipper DNA over ved specielle DNA sekvenser. I dette projekt leder vi efter eventuelle mutationer, men det er ikke noget problem i forhold til restriktionsenzymerne. Hvis vi antager at enzymet klipper når sekvensen er korrekt, vil samme enzym ikke klippe når der er en mutation. På det måde kan man vi se om der er en mutation, når vi ser på gelen. Ved to bånd, vil der ikke være nogen mutation. Ved 1 bånd, vil dette påvise en mutation, i området hvor restriktionsenzymet sætter sig. Enzymaktiviteten er angivet i units, hvor 1 unit svare til den mængde enzym der skal til for at skære 1 ug DNA på 1 time ved 37gr. Enzymaktivtet er bestemt af temperatur og ionkoncentration. Hver enzym har en temperatur de arbejder optimalt ved. Et temperaturoptimum. Ligeledes hver enzym et ph optimum. 5 Figur 2 Graf der viser hhv. Temperaturoptimum og ph optimum for enzymer Star aktivitet Star aktivitet er et begreb man bruger når man skærer med restiktionsenzymer under forhold som ikke er optimale for det enkelte enzym. Konsekvenserne ved ikke at arbejde med de respektive forhold, kan være at enzymet skærer andre steder på sitet, end det egentlig var tænkt

15 Betingelser som for høj ph eller for lav ionstyrke, glycerol koncentrationer over 5%, ekstremt høje koncentrationer af enzym, eller hvis der er organiske opløsningsmidler i mixet, kan give grund for star aktivitet BioLabs enzymer BioLabs har designet deres enzymer sådan, at de arbejdes bedst ved en given buffer. (Buffer 1, 2, 3 eller 4). Dette kan man læse om i deres katalog, hvor man også kan se deres temperaturoptimum. På denne måde er det muligt at planlægge dobbeltskæringer, ved at sammensætte enszymer der passer sammen i buffer og temperatur, og dermed få optimale betingelser for begge enzymer. 2.6 Sekventering Formålet med at lave en sekventering, er at bestemme rækkefølgen af baser i et stykke ukendt DNA. Ved sekventering bruges en elongeringsreaktion. Forskellen mellem en almindelig PCR og elongeringsreaktionen der bruges til sekventering, er at der her kun bruges 1 primer. Derudover bruges der ddntp, som er di-deoxynuklotider som stopper replikationen. Disse nukleotider er mærket med hvert sit fluorescerende stof, og får derfor hver sin farve, som kan detekteres. Når PCR-reaktionen er løbet til ende, vil der grundet stopnukleotiderne, være opstået DNA-fragmenter med forskellig størrelse. Fragmenterne er dog startet samme sted, nemlig ved primeren. Fragmenterne er stoppet med et ddntp, der fluorescerer i en farve. Farven angiver hvilket nukleotid der på sætter sig på den pågældende position. Fragmenterne kan derefter adskilles, enten vha elektroforese gel, eller vha kapillar elektroforese (denne er i dag den mest benyttede). Princippet mellem de to metoder er ens. Fragmenterne vil trænge gennem gelen i forskellig hastighed, afhængig af størrelse, de små hurtigst, de store langsomst. Herefter kan sekvensen af DNA aflæses, idet der til Figur 3: Princippet bag sekventering -15-

16 hvert fragment er bundet et fluorescerende molekyle, afhængig af hvilket stopnukleotid der sidder. Fx vil det DNA fragment, der er mindst, og dermed trænger hurtigst igennem gelen være mærket med blå fluorescens, hvilket svarer til nukleotidbasen A, og dermed kan man se at første nukleotid i sekvensen er A. Se figur 3 Det er oftest computere der udfører sekventeringen. Detektionen fungere ved at der sendes laserstråler mod de forskellige fragmenter, hvilket giver et bestemt udslag af fluorescens. Dette signal opsamles i et datasæt på computeren. Se figur 4. Figur 4: Eksempel på datasæt for DNA-sekventering. Hver base giver et bestemt flourescens-udslag. De forskellige toppe viser hvilke nukleotider der er blevet detekteret i en given position. Metoden er dog ikke 100% sikker, da der kan forekomme to toppe oven i hinanden. Dette kan skyldes at det kan være svært at adskille meget små fragmenter, og at disse derved kan blive detekteret samtidigt. Toppens højde indikerer hvor stærkt detekteringssignalet er, dette afhænger af mægden af DNA. Når der kun er 1 top, spiller højden ingen rolle. I de tilfælde hvor der er to toppe, hvor den ene er højere end den anden, vil den højeste bestemme hvilken base computeren angiver i denne position. Computeren gør dog opmæksom på at der er noget ikke normalt på denne position, med en gul streg

17 2.7 Sequence Alignment Eller på dansk; sekvenssammenligning. Et udtryk der bruges når man snakker om sammenligning af DNA sekvenser. Sammenligningen foregår base for base, så man får et præcist billede af hvor ens, eller forskellige de to sekvenser man sammenligner er. Hvis sekvenserne varierer i længden indsættes gaps som forlænger et stykke af sekvensen. Hvis disse ikke blev indsat, ville de to relativt ens molekyler, se ud til at være vidt forskellige. Se figur 5 I figuren kan man se hvordan et sequence alignmet i praksis kan se ud. Så længe sekvenserne er relativt korte er det ikke noget problem selv at kigge dem efter og se hvor forskellene ligger. Dog kan man risikere at skulle lave en sådan sequence alignment på sekvenser der er meget større, og som næsten er umuligt at sammenligne selv. Derfor er der udviklet computerprogrammer der kan lave disse sekvenssammenligninger, disse kan endog sammenligne flere sekvenser på en gang. Programmerne er intelligente og kan selv sætte gaps ind og de kan genkende vigtige områder i sekvenserne. Når sekvenssammenligningen er færdig, vil det være muligt at se hvor meget sekvenserne ligner hinanden. 7 Figur 5: Sequence alignment med indsættelse af gaps. Et-tallene viser når der er overensstemmelse mellem de to sekvenser. 0'erne viser at der ikke er overensstemmelse. Ved indsættelse af gaps viser det sig at de to sekvenser er ret ens

18 2.7.1 Pseudogener Pseudogener er gener der ikke er aktive. De er med tiden blevet deaktiveret, og derfor ikke længere producerer det protein som det engang forsynede kroppen med. Menneskecellerne har gener hvoraf er pseudogener. Pseudogenet defineres som et genomisk DNA segment som i sin basesekvens ligner et funktionelt gen, disse har dog ingen funktion. Man mener at pseudogener er evolutionære restprodukter, som er blevet inaktive grundet mutationer i deres kodende sekvenser. Andre pseudogener er opstået ved en proces hvor en ekstra DNA-kopi er dannet fra mrna ved revers transkription, efterfølgende er denne integreret i genomet. Disse pseudogener mangler introns og kaldes derfor for processerede pseudogener Single nukleotid polymorphisme SNP'er er den simpleste form for genetiske polymorfier, hvor der er forskel på en enkelt base i en bestemt position i DNA'et (se figur 6). I dag kender man til flere millioner SNP'er rundt om i genomet, da der findes en SNP for hver 1 kb. Næsten hvert gen har således en eller flere SNP'er. SNP'er kan være lokaliseret i exon og intron. SNP'er i exon kan give anledning til ændringer i aminosyresammentæningen og dermed også det endelige genprodukt. SNP'er i intron kan have betydning for kontrollen med genekspressionen. 8 Menneskets genom, Eigil Kjeldsen og Søren Nørby Figur 6 Eksempel på en SNP -18-

19 2.8.1 Haplotyper Haplotyper er loci som sidder relativt tæt sammen på et kromosom, og derfor nedarves sammen, da sandsynligheden for overkrydsning kun sker meget sjældent. Man kan sagtens lede efter enkelte SNP'er. Men det har vist sig at man får langt mere information hvis man leder efter haplotyper. Haplotyper er en gruppe af SNP'er der har tendens til at blive nedarvet sammen som perler på en snor. -19-

20 3 MATERIALER OG METODER 3.1 Metodevalg Som det første skal baggrunden være i orden før arbejdet i laboratoriet begynder. Søgningen foregår på pubmed, for at finde CYP2B6 9. Herefter indtegnes det specifikke område, exon, der er relevant for arbejdet. Herunder er exon tegnet med rødt. caggaccat ggaactcagc gtcctcctct tccttgcact 2041 cctcacagga ctcytgctac tcctggttcw gygccaccct aacwcccatg rcmscctccc 2101 accagggccc cgccctctgc cccttttggg aaaccttctg cagrtggata gaagaggcct 2161 actcaaatcc tttctgaggg Primer og primeroptimering Næste skridt er at finde primere. Dette gøres igen vha nettet 10. Under denne søgning kom der op mod 100 forskellige primerpar frem. Alle disse blev læst igennem, og den med det bedste match bestilte vi hjem og kalde primerpar 1-2. Der laves nu et opsæt med primerpar 1-2. Opsættet laves under normale vilkår, se resultat Der laves en mindre optimering med MgCl på hhv. 1,25-1,5-1,75-2,0 mm. Båndende bliver her så kraftige at vi ser os nødsaget til at tjekke primerne. Under søgningen i primer blast, blev vi gjort opmærksomme på at den havde 2 bindesteder. Vi valgte dog at se bort fra dette, da det formentlig bare var fra nogle gamle data, og derfor ikke være noget problem. Det viser sig da også at de fanger et psudogen CYP2B7, og at båndende derfor bliver dobbelt så kraftige som man normalt kunne forvente. Vi laver nu en allignment 11 (se bilag 1) mellem vores CYP2B6 og vores pseudogen CYP2B7, og finder, manuelt vores nye primere. Primerpar 3-4. Derudover laver vi også en primer 5, i tilfælde af de andre ikke lykkedes. Nu har vi så mulighed for kombinere vores nye primere og de gamle primerpar 1-2, og dermed få en sekvens der ikke indeholder pseudogenet CYP2B

21 Herefter begynder optimeringen af de forskellige primerpar. Optimeringer består i ændringer af MgCl koncentrationer og annealingstemperaturer. Grundopskriften på PCRmix, eneste variabel under projektet er MgCl konsentrationen. Eks. MgCl konc= 2,25mM 10ul assay x 1 prøve Vand 5,8 ul Buffer x10 1 ul MgCl (25mM) 0,9 ul dntp (10 mm each) 0,2 ul Primer (10mM) 0,5 ul Primer (10mM) 0,5 ul Amplitaq 0,1 ul Template (10ug/ml) 1 ul Lokalisering af SNP'er ccacacat tcacttgctc acctggactt tgatatctct accactgtat ccctgccaat atctacagag tgggtaaagg gataggcatc aggtcactgg gttgcccaag caggaagtct gggttcccta acaacttttt ctaagctaat gctcctggat gatgatgaaa aaggaggtgg ggaatggatg aaatttta ta acagggtgca gaggcagggt caggataaaa ggcccagttg gaggctgcag cagggtgcag ggcagtcaga ccaggaccat ggaactcagc gtcctcctct tccttgcact cctcacagga ctcttgctac tcctggttca gcgc caccct aacacccatg AcCGcctccc accagggccc cgccctctgc cccttttggg aaaccttctg cagatggata gaagaggcct actcaaatcc tttctgaggg taagacacag acgaatgggg tctgagggtc agctgcttct tgccttggta cttggggaag cttcaccaaa cagaatgagg SNP 1: T>C SNP 2: T>C SNP 3: A>T SNP 4: C>T SNP 5: A>T SNP 6: A>G SNP 7: C>A SNP 8: G>C SNP 9: C>G Fundet på NCBI

22 3.1.3 Restriktionsenzymer Jeg har ved hjælp fra nettet 13 søgt efter retriktionsenzymer. Desværre var det via NEBcutter ikke muligt at finde enzymer til samtlige SNP'er. Dog kunne det lykkes at finde enzymer til bestemmelse af SNP 1, 3, 4, 6 og 9. Der var flere enzymer at vælge i mellem til de her SNP'er. Dem der er udvalgt er derfor valgt efter hvilken buffer der er deres optimale. Restriktionsmønstre er beregnet, fra samme netside. Derefter er der beregnet mønstre til sammenligning hvis man blandede 2 enzymer sammen. Ud fra disse resultater valgte jeg at blande enzymer, så der blev 3 enzym mix: Sammensætning af enzymer PsiI + HaeII EcoNI + HhaI HaeIII wild' 196,146, ,100,87 230,145,50,103 SNP 1 342, ,100,87 230,145,50,103 SNP 2 196,146, ,100,87 230,145,50,103 SNP 3 196, ,100,87 230,145,50,103 SNP 4 196, ,87 230,145,50,103 SNP 5 196,146, ,100,87 230,145,50,103 SNP 6 196,146, ,100,87 230,129,16,50,103 SNP 7 196,146, ,100,87 230,145,50,103 SNP 8 196,146, ,100,87 230,145,50,103 SNP 9 196,146, ,65,35,87, ,145,50, Materialeliste: Primere: 1, 2, 3, 4, 5. Amplitaq polymerase Buffer MgCl DNTP Farvet loadingbuffer restriktionsenzymer fra biolabs PsiI

23 HaeII EcoNI HhaI HaeIII Buffer 4 markør 5 (se bilag 2) markør 8 (se bilag 2) 3.3 Kliniske prøver: Prøvematerialet der er brugt til dette projekt, er patientmateriale der er opbevaret i instituttets biobank. Patienterne har alle givet skriftligt samtykke til at deres DNA må bruges til forskning og forsøg. Herunder også at de ikke får individuel information om undersøgelser (se bilag 3) Dermed giver det mulighed for at lave alle de undersøgelser der måtte være relevante i forhold til projektet, uden at informere patienterne. -23-

24 4 RESULTATER 4.1 Optimering Assay med primerpar 1-2 Primer : o <1> o <2> PCR temp: o 94 /5min + ( 94 /15sek + 58 /15 sek + 72 /2min ) x x 7 min +10 / MgCl koncentration 1,5mM Meget flotte og tydelige bånd, som passer med den forventede størrelse Assay primerpar 1-2 optimering MgCl konc Primer: o <1> o <2> 94 /5min + ( 94 /15sek + 58 /15 sek + 72 /2min ) x x 7 min +10 / MgCl koncentration 1,25 1,75-1,5 2,0 mm Finder ud af at primerne er upræcise, bestiller nye hjem! Assay primerpar 4-5 optimering af temp. og MgCl Primer: o <4> o <5> Annealings temperatur: o 94 /5min + ( 94 /15sek + 58 /15 sek + 72 /2min ) x x 7 min +10 / o 94 /5min + ( 94 /15sek + 61 /15 sek + 72 /2min ) x x 7 min +10 / o 94 /5min + ( 94 /15sek + 55 /15 sek + 72 /2min ) x x 7 min +10 / -24-

25 MgCl koncentration 1,25 1,50 1,75 2,0 mm Assay nyt primerpar optimering Primer: o <3> o <4> Anelings tempertur: o 94 /5min + ( 94 /15sek + 58 /15 sek + 72 /2min ) x x 7 min +10 / o 94 /5min + ( 94 /15sek + 61 /15 sek + 72 /2min ) x x 7 min +10 / o 94 /5min + ( 94 /15sek + 55 /15 sek + 72 /2min ) x x 7 min +10 / MgCl koncentration 1,25 1,5 1,75 2,0 mm Figur 7: Primerpar 3-4 optimering, Temperatur hhv 55 og 58gr. MgCl koncentration hhv. 1,25mM og 1,5mM Figur 8: Primerpar 3-4 optimering, Temperatur hh 58gr og 61gr. MgCl koncentration hhv. 1,75mM og 2,0mM Svage resultater, dog tydeligere bånd når MgCl koncentrationen når over 1,5mM -25-

26 4.1.5 Assay Optimering på alle primerpar Primer o <1> o <2> o <3> o <4> o <5> Sammensætning af primere: o 1-2, 3-4, 5-4, 1-4, 2-3, 2-5 Annealings tempertur 94 /5min + ( 94 /30sek sek + 72 /1min ) x x 7 min +10 / MgCl koncentration 1,5 2,0 2,5 3,0 mm o Gelerne viser optimering i temperatur og MgCl koncentration for alle kombinationer af primerpar. Gelen er kørt så det er tydeligt at se resultaterne, og ligeledes tydeligt at se hvor kraftige båndene er. -26-

27 Figur 9: MgCl optimering med alle primerpar kombinationer, fra 1,5mM MgCl til 1,75mM MgCl Figur 10: MgCl optimering med alle primerpar kombinationer, fra 2,0mM MgCl til 2,25mM MgCl Assay primerpar 1-2 og 3-4 temp optimering Primerpar o <1> o <2> o <3> o <4> Annealings temperatur Figur 11: Primerpar 1-2 og 3-4, temperatur o 94 /5min + ( 94 /30sek sek + optimering hhv. 56 og 59 gr 72 /1min ) x x 7 min +10 / o 94 /5min + ( 94 /30sek sek + 72 /1min ) x x 7 min +10 / MgCl koncentration 2,25 mm -27-

28 4.2 Sekventering: Assay Sekventering- primerpar 1-2 og 3-4 temp optimering Primerpar o <1> o <2> o <3> o <4> Annealings temperatur o 94 /5min + ( 94 /30sek sek + 72 /1min ) x x 7 min +10 / MgCl koncentration 2,25 mm (Se bilag 4) -28-

29 4.3 Skæringer Skæring Primerpar o <3> o <4> Annealings temperatur o 94 /5min + ( 94 /30sek sek + 72 /1min ) x x 7 min +10 / MgCl koncentration 2,25 Figur 12 Billede af første skæring, opsat som følger: 1. Markør, 2. Enzymmix1, 3. Enzymmix2, 4. Enzymmix3, 5.vand = 1 Patient Figur 13 Billede af første skæring, opsat som følger: 1. Markør, 2. Enzymmix1, 3. Enzymmix2, 4. Enzymmix3, 5.vand = 1 Patient -29-

30 4.3.2 Skæring 2. Primerpar o <3> o <4> Annealings temperatur o 94 /5min + ( 94 /30sek sek + 72 /1min ) x x 7 min +10 / MgCl koncentration 2,25 Enzymblandinger: mixa x1 mix b mix c buffer 1,3 Buffer 1,3 Buffer 1,3 Psil 0,4 EcoNi 0,2 HaeIII 0,2 HaeII 0,2 HhaI 0,2 Vand 1,5 Vand 1,1 Vand 1,3-30-

31 Figur Skæring med enzymer, 1. 8 prøver med enzymmix 1, 2. 8 prøver med enzymmix 2, 3. 8 prøver med enzymmix 3. Gentaget 2 g ange. Sidste 24 prøver = DNA uden enzymer. Imellem Markør 5 og

32 5 DISKUSSION Vi har med projektet udviklet et assay til genotypning af 5 SNP er i exon 1 af CYP2B6 baseret på skæring af samme PCR-amplificerede fragment med en række forskellige restriktionsenzymer. Der er levet brugt 5 forskellige enzymer der alle hjælper til indetificering af de 5, føromtalte, SNP er. Projektet har gennemgået en større optimering, af PCR restriktions assay. Herunder optimering af MgCl og annealingstemperatur. Diskussionen herunder vil komme dybere ind på hvilke optimeringer der er lavet og hvorfor. Endvidere vil det endelige assay blive diskuteret. Derudover har der været store overvejelser i forbindelse med bestemmelse af enzymer til skræing, hvilken diskussionen herunder også vil uddybe. I slutningen af processen, efter en større optimering af PCR, er der kommet nogle ganske diskuterbare resultater. Til slut i diskussionen, vil resultaterne blive diskuteret, sammen med en perspektivering. 5.1 Optimeringer Det første problem vi mødte under udarbejdelsen af dette assay var allerede ved det første primerpar. Artiklen(1) havde godt beskrevet pseudogenet, CYP2B7, som kunne blive et problem, under annealingen af primerne. Den anden artikel vi har haft med (2), har dog ikke beskrevet pseudogenet, hvilket giver os en indikation af at de ikke har været opmærksomme på dette under deres projekt forløb. Disse to artikler (1), (2) taget i betragtning, mente vi det var vigtigt at tjekke vores første primerpar inden vi fortsatte vores arbejde. Vi undersøgte derfor endnu engang vores kilder til primerne, program via nette. Primerprogammet gjorde her ikke opmærksom på at dette psudogen kunne blive et problem ved disse primere. Vi undersøgte da pseudogenet og fandt at det var næsten identisk med vores CYP2B6. Ved en allignment kunne vi da også se at primerne amplificerer lige så godt her, som på CYP2B6. Nu gennemgik vi da både CYP2B6 og CYP2B7, for at finde et passende sted for primerne. (se bilag 1) -32-

33 alignement). Folkene bag artikel (1), gjorde netop det samme da de skulle designe primere, de alignede CYP2B6 og CYP2B7, og baserede deres primervalgt ud fra dette af frygt for at få amplificeret det forkerte DNA. Der var dog ikke mange muligheder, men vi fandt dog et enkelt sted med 3 baseforskelle i 3'enden. Dette mente vi burde være nok til at vi ikke ville få amplificeret CYP2B7 pseudogenet(1). CYP2B6 og CYP2B7 er lokaliseret i et område på 112 kb. Vi designede her 3 nye primere. Et primerpar 3-4 og en primer 5 for at være på den sikre side. Vi fortsatte nu arbejdet med de nye primere. Vi startede ud med at lave en MgCl optimering. Resultatet viste dog hurtigt at vi skulle op i nogle høje koncentrationer for at få et fornuftigt bånd. På billedet vises en annealingstemperatur på 55 gr., og 4 prøver med hhv. 1,25 1,5 1,75 og 2,0 mm MgCl. Ved både 1,25 og 1,5 vises ingen tydelige bånd. Båndene begynder da at vise sig når MgCl koncentrationen kommer op på 1,75 og 2,0 mm MgCl. Dog er de stadig ikke særlig tydelige. I samme omgang lavede vi også en annelingstemperatur optimering. På hhv. 55gr, 58 gr. Og 61 gr. Som tidligere beskrevet i teoriafsnittet, gælder det om iforhold til primer annealingen at finde den helt rette annealingstemperatur. Hvis temperaturen sættes for lavt, risikerer man at primerne amplificere et andet sted end på target DNA. Hvis dette sker i en af de første cykler, kan det have stor betydning for det endelige produkt, da der så vil være blevet kopieret millioner af det forkerte produkt. Vores resultat viser os at, primerne bliver amplificeret fint ved 55 gr og 58 gr. Derimod er der ingen synlig amplifikation ved 61 gr. Her vælger vi så at fortsætte med 58 gr. Annealingen bliver mere specifik jo højere temperaturen bliver, og dermed nedsættes risikoen for mismatch. Efter dette resultat, kørte vi en prøve med alle primer kombinationer, for at se om der var nogle der var bedre end andre. Vi valgte her at forøge koncentrationen af MgCl. Da vi i det foregående forsøg ikke fik så tydelige bånd som man kunne ønske. Næste opsæt bestod da af en annealingstemperatur på 58 gr. og MgCl koncentrationer på hhv 1,5 2,0 2,5 3,0mM. Derudover øgede vi antal cykler fra stk. Her blev resultatet dog ret tydeligt. -33-

34 Figur 15: sammenklipning af alle primerpar kombinationer ved hh. 1,5mM og 2,25mM Mgcl På det første billede med en MgCl koncentration på 1.5mM, er de fleste bånd ret pæne(se figur 15). Man kan stadig se at båndene fra primer par 1-2 er næsten dobbelt så kraftige som de andre. (Man kunne dog have samme mistanke om primerpar 1-4). Derudover kan man se at primerpar 3-4 giver nogle flotte tydelige bånd, og det bekræfter os i at det er de rette primere at bruge når vi skal i gang med vore skæringer. Sammenligning af primerpar 3-4 på hhv 1,5mM MgCl og 2,25mM Mgcl, viser da også at båndene på 2,25mM MgCl er en anelse kraftigere, hvilket vil være en fordel når vi skal til at skære. Derfor vælger vi at fortsætte med koncentrationen på 2,25 mm. I næste opsæt laver vi en en lille temperatur optimering. På hhv 56 og 59 gr.(se figur 16) Her hersker der ingen tvivl om at båndende for både primerpar 1-2 og 3-4 er en kraftigere ved 59 gr end ved 56 gr. Derfor er der heller ingen tvivl om at det er denne temperatur, der er den rigtige når vi fortsætter med skæringerne. Figur 16: Primerpar 1-2 og 3-4, temperatur optimering hhv. 56 og 59 gr -34-

35 5.2 sekventering Vi vælger nu at sende et prøvesæt til sekventering i Tyskland. Dette for at se forskellen mellem primerpar 1-2 og 3-4 og for at se om vi har fanget det gen som er hele formålet. Desværre var resultatet langt fra som håbet da sekventeringen kom tilbage som failed, og dermed ikke giver noget tydeligt billede(se bilag 5). Dette kan der være flere grunde til og vi har overvejet hvorfor de dikke blev til noget i Tyskland. Den måske mest sandsynlige grund er at assay'et ligger uden for deres standard. De har en standard metode til at lave de her sekventeringer. De samme temperaturer og MgCl koncentrationer på alle prøver. Vores assay kræver en høj koncentration MgCl og en relativ høj annealingstemperatur. Dette kan have betydning for om primerne annealier ordenligt inden sekventeringen. En anden ting vi overvejede, var at tiden efter vi sendte prøven, til firmaet i Tyskland sendte en mail om at de havde modtaget den, var over en uge og det var varmt i vejret. Dog da DNA prøverne blev sendt som en tør pellet, bør dette ikke have nogen betydning. 5.3 Restriktions skæringer Overvejelser i forbindelse med bestemmelse af enzymer Vi gjorde os flere overvejelser under valget af enzymer. Vi overvejede muligheden for at kunne blande 2 enzymer sammen, i et mix, og stadig få adskilte bånd på gelen. For at dette skulle kunne lade sig gøre, var det vigtigt at enzymerne fungerede under de samme omstændigheder. Herunder temperatur og buffersystem. Vi brugte NEBcutter, til at finde enzymer der kunne skære ved vores variationer. Derefter var vi så heldige at vi kunne udvælge enzymer fra samme firma, og endog enzymer der var optimale under samme forudsætninger Skæring med restriktionsenzymer Undervejs til fremstillingen af dette skærings assay, har vi lavet skæringer af to omgange, med enkelte justeringer fra den første til den anden skæring. -35-

36 Første skæring har ikke det store at byde på. En enkelt variant er at finde blandt de 16 prøver. Denne vil jeg dog ikke kommentere yderligere nu, da den er ens med de varianter der er at finde i 2. skæring. Gelen, ved første skæring, er blevet ret utydelig, hvilken kan skyldes af gelen ikke er kraftig nok, og at den måske er kørt for hurtigt, dette er der taget højde for i anden skæring. Hvor gelen er lavet kraftigere og kørsels hastigheden er nedsat. Markør 5 på første gel, er derfor ikke optimal da man ikke kan se den nederste del af denne. Ligeledes er de nederste bånd på gelen lettere udglattede. Ligeledes kan man se at der ikke har været nok restriktionsenzym til stede til at skære ordenligt. Udover de førnævnte ændringer, har vi halveret mængden af DNA og fordoblet mængden af enzymer. Dette kommer til udtryk på den anden gel, da DNA'et nu er skåret helt i bund. I og med at gelen er lavet kraftigere er båndene blevet skilt bedre, og man kan nu identificere de enkelte bånd uden problemer. Ydermere er opsætningen på gelen gjort mere overskuelig, ved at sætte de respektive enzymer ved siden af hinanden, så man derfor nemmere kan overskue hvor eventuelle variationer er at finde. Dette har ikke nogen diagnostisk effekt, andet end det gør det nemmere for aflæserne at aflæse gelen. -36-

37 Figur Skæring med enzymer, 1. 8 prøver med enzymmix 1, 2. 8 prøver med enzymmix 2, 3. 8 prøver med enzymmix 3. Gentaget 2 g ange. Sidste 24 prøver = DNA uden enzymer. Imellem Markør 5 og 8. På denne gel (se figur 17) ses tydeligt hvor variationerne findes. Ved de første 8 skæringer ses en variation ved prøve 1, 5 og 7. Denne variation ses ved både første enzymmix og andet enzymmix. Dette skyldes at disse hænger sammen. Hvis der kun havde været bånd i første kolone, havde dette indikeret enten en SNP, 1 eller 3. Grunden til at disse ikke kan adskilles, er en fejl fra tidligt i processen med enzymberegningerne, inden vi gik i gang med arbejdet med primerpar 3-4. De første udregninger vi lavede mht størrelsen af bånd, var med primer par 1-2, og med disse kunne man skelne en forskel på SNP 1 og 3. Denne fejl er dog blevet overset i det videre arbejde, og resulterer nu i at vi ikke kan skelne disse 2 SNP'er. Dog skal der her gøres opmærksom på at man ved at skille enzymerne kan adskille SNP'erne. Dette er dog først kommet for vores øjne, efter arbejdstiden i laboratoriet er færdiggjort. Det er dog væsenligt i forhold til haplotyperne at kunne adskille disse SNP'er, så det vil klart være en fordel at adskille enzymerne, og dermed få præciseret hvilke SNP'er der arbejdes med. -37-

38 Den anden kolone, viser om SNP 4 er tilstede i vores prøve. Vi kan med tydelighed se at det er den i de samme føromtalte prøver 1, 5 og 7. Vi kan dermed kun sige at SNP 4 er i disse prøver og ikke hvorvidt SNP 1 og 3 er. Vores haplotyper kan dog give et svar på dette. Det er dog kun muligt at skelne haplotyperne *10 og *17(se bilag 6), fordi vores sidste enzym ikke giver nogle resultater. Haplotype *10 fortæller os at hvis vi finder en SNP 4, vil der med stor sandsynlighed også være SNP 3 og 9. Hvorimod at hvis vi havde fundet en SNP 6 med 3. enzymmix ville der være tale om haplotype *17. Derudover kan det noteres at alle SNP er ved 2. enzym mix er heterozygote. Dette ses ved de 3 bånd. Lidt anderledes er det for det førsre enzymmix, da vi her ikke med sikkerhed kan sige at de er homozygote, da vi ikke kan se forskel på SNP 1 og 3. I anden række af prøver kan man se endnu en SNP i prøve 5. Både med enzymmix 1 og 2. Denne skiller sig ud fra de andre da denne øjensynligt ikke er blevet skåret helt, da der ligger et bånd oppe ved båndstørrelse

39 6 KONKLUSION Det er muligt at lave et delvist assay der vha retriktionsenzymer kan bestemme flere SNP er samtidigt. Dog var det ikke muligt at adskille alle tætliggende SNP er, da der i exon ligger 3 SNP er meget tæt AcCG. Der kunne ikke findes enzymer til netop disse SNP er. Det var dog muligt at adskille to andre SNP er der ligeledes lå helt tæt, med en enkelt base i mellem. Alt i alt var det muligt at adskille 5 ud af 9 SNP er ved hjælp af restriktionsenzymer. Det var muligt at udvælge primere der var specifikke for CYP2B6 og ikke amplificerede andre gener eller pseudogener. 6.2 Perspektivering: Farmakogenetik er uden tvivl fremtiden. Man vil i fremtiden kunne se flere og flere genotypninger, der har henblik på at kunne medicinere den enkelte patient. Man har endnu ikke helt kortlagt genet CYP2B6, men man ved dog alligevel at denne har en stor betyning for metaboliseringen af flere forskellige medikamenter, herunder malariamedicin(5) og anti-depressivt medicin og HIV medicin. Efavirenz er et af de medikamenter CYP2B6 metabolisere. Efavirenz bruges til behandling af HIV. Her kan det være en fordel at vide hvor god ens omsætning af medikamentet er, da man jo meget nødigt vil have for små mængder, og dermed gøre virus immunt overfor medicinen. Omvendt vil man ikke lave om på minimums mængden af midicin, da man, trods genotype bestemt metabolisme, er bage for at give så lidt at, igen, virus bliver immunt. -39-

40 Referencer: exon Cyp2B til at finde SNP er Primer design Alignment Primer blast Billede af PCR NEBcutter, enzymskæringer ERE_NUMRE/2004/UFL_2004_42/UFL 2004_42_ Sekventeringsteori PCR kompendium Indutriens Uddannelser Menneskets genom, Eigil Kjeldsen og Søren Nørby Artikler: -40-

41 (1) Jacob, M., Robyn., et al (2004) Identification of CYP2B6 Sequence Variants by Use og Multiplex PCR with Allele-Spevific Genotyping. Clinical Chemistry 50: (2) Guan, Su., et al (2006) Genetic polymorphisms of cytochrome P450 2B6 gene i Han Chinese. European jurnal of pharmaceutical sciences 29, (3) Blievernicht, K., Julia., et al (2007) MALDI-TOF Mass Spectromertry for Multiplex Genotyping of CYP2B6 Single-Nucleotide Polymorphisms. Clinical Chemistry 53: (4) Zanger, M., Ulrich., et al (2007) Polymorphic CYP2B6: molecular mechanisms and emerging clinical signifiance. Future Medicine ltd ISSN (5) Ferreira, E., Pedre., Et al (2008) Polymorphism og Antimalaria Drug Metabolizing, Nuclear Receptor, and Drug Transport Genes among Malaria Patients in Zanzibar, East Africa. Ther Drug Monit, Volume 30, Number 1, February

42 CLUSTAL multiple sequence alignment Bilag 1 gi _ ref NT_ Hs19_11266_13 ATTGAATTGAACAATTCCTTCTTTTCATCAGCTTCTCAATTTTTTTTTTG 50 gi _ ref NT_ Hs19_11266_13 AGACAGAGTATTGCTCTGTCACCCAGGCTAGTGTGCAGTGGCATAATCCT 100 gi _ ref NT_ Hs19_11266_13 GGCTCACTGCAGCCTCCACCTCCCAGGTTCAAGTGACTCTCTTGCCTCAG 150 gi _ ref NT_ Hs19_11266_13 CCTCCCGAGTAGCTGGAATTAAAGGTGCCCACCACCACGCCCGGCTAATT 200 gi _ ref NT_ Hs19_11266_13 TTTGTATTTTTAGTAGAGACGGGGTTTTGCCATGTTGGCCAGGCTGGTCT 250 gi _ ref NT_ Hs19_11266_13 CGAACTCCTAACCTCAAGTGATCTGCCCACCTTAGCTTCCCAAAGTGCTG 300 gi _ ref NT_ Hs19_11266_13 GGATTACAGGTGTGAGCCACTGCACCCAGCCAGCCTCCCAATTTTGAACA 350 gi _ ref NT_ Hs19_11266_13 CACACTACCACCACCTCCACAACACACAAATGTAAATGCACTTTCATATA 400 gi _ GCTCATACACATGCAAGGATACACACA 27 ref NT_ Hs19_11266_13 TGAAACTGTATAAATACAAGGAAGCTC-CACACGTGCAAGGATATACACA 449 **** **** ********** ***** gi _ TAAGCACCCCCAGATTCAACCACAGAAATATACGCCAGTACATTTGCATA 77 ref NT_ Hs19_11266_13 TAAGCACCCCCAGATTCAACCACAGAAACACACGCCTGCACATTTGCATA 499 **************************** * ***** * *********** gi _ AATTCAAACACCCCTTTACATGTAAAAATCATATAAGCACATACAGGGAT 127 ref NT_ Hs19_11266_13 AATACAAACACCACTTTACATATAAAAATCATATAAGCACATACACGGAT 549 *** ******** ******** *********************** **** gi _ GCAAGCAGGCATGGACAAATGCATGCAAGCACAGACAAACAGACAAAGCT 177 ref NT_ Hs19_11266_13 GCAAGCAAGCATGGAGAAATGCACGGAAGCATAAACAAACAGACAAAGCT 599 ******* ******* ******* * ***** * **************** gi _ AAGTAAAAAAGTG--CAAGCTCACCTATGCTTACAAAAATAGACATACAT 225 ref NT_ Hs19_11266_13 AAGTAAAAAAGTGTGCATGCTCACCTGTGCTTACAAAAATACACATACTC 649 ************* ** ******** ************** ****** gi _ ATACCCACAAACCCACACACCCACACATTCACTTGCTCACCTGGACTTTG 275 ref NT_ Hs19_11266_13 ATA--CACAAA------CACCCACACGTTCACATGCTTAGGTGGACTTTG 691 *** ****** ********* ***** **** * ********* gi _ ATATCTCTACCACTGTATCCCTGCCAATATCTACAGAGTGGGTAAAGGGA 325 ref NT_ Hs19_11266_13 ATATCTCTACCACTGTATCCCTGCCAACATCTAGAGAGTGGATAA-GGGA 740 *************************** ***** ******* *** **** gi _ TAGGCATCAGGTCACTGGGTTGCCCAAGCAGGAAGTCTGGGTTCCCTAAC 375 ref NT_ Hs19_11266_13 TAGGCATTAGGTCGCTGGGTTGCCTAAGCAGGAAGTCTGGGTTCCCTAAC 790 ******* ***** ********** ************************* gi _ AACTTTTTCTAAGCTAATGCTCCTGGATGATGATGAAAAAGGAGGTGGGG 425 ref NT_ Hs19_11266_13 ACCTTTTTCTAAGCTAATGCTCCTTGACGATAATGAGAAAGGAGGCGGGG 840 * ********************** ** *** **** ******** **** -42-

43 gi _ AATGGATGAAATTTTATAACAGGGTGCAGAGGCAGGGTCAGGATAAAAGG 475 ref NT_ Hs19_11266_13 AATGGATGAAGTTTCATAACTGAGTGAAGAGGCAGGTTCAGGATAAAAGG 890 ********** *** ***** * *** ********* ************* gi _ CCCAGTTGGAGGCTGCAGCAGGGTGCAGGGCAGTCAGACCAGGACCATGG 525 ref NT_ Hs19_11266_13 CCCAGTTAGAGGCTGCAGTGGGGTGCAGGGCAGTCAGACTGGAACCATGG 940 ******* ********** ******************* * ******* gi _ AACTCAGCGTCCTCCTCTTCCTTGCACTCCTCACAGGACTCTTGCTACTC 575 ref NT_ Hs19_11266_13 AGCTCAGCGTCCTCCTCTTCCTTGCACTCCTCACAGGCCTCTTGCTACTC 990 * *********************************** ************ gi _ CTGGTTCAGCGCCACCCTAACACCCATGACCGCCTCCCACCAGGGCCCCG 625 ref NT_ Hs19_11266_13 CTGGTTCAGCGTCACCCTAACTCCCATGGCACCCTCCCACCAGGGCCCCG 1040 *********** ********* ****** * ****************** gi _ CCCTCTGCCCCTTTTGGGAAACCTTCTGCAGATGGATAGAAGAGGCCTAC 675 ref NT_ Hs19_11266_13 CCCTCTGCCCCTTTTGGGGAACCTTCTGCAGATGGACAGAAGAGGCCTAC 1090 ****************** ***************** ************* gi _ TCAAATCCTTTCTGAGGGTAAGACACAGACGAATGGGGTCTGAGGGTGAG 725 ref NT_ Hs19_11266_13 TCAAATCCTTTCTGAGGGTAAGACACAGACGAATGGGGTCTGAGGGTGGG 1140 ************************************************ * gi _ CTGCTTCTTGCCTTGGTACTTGGGGAAGCTTCACCAAACAGAATGAGGCA 775 ref NT_ Hs19_11266_13 CTGCTTCTTGTCTCTGTACTTGGGGATCCTTCACCAAACAGAATGAGGCA 1190 ********** ** *********** ********************** gi _ GACTTCCAGAGTCAGGGGTGGCACGGGCATGGTTGGTGAGTACGGAGCAT 825 ref NT_ Hs19_11266_13 GACTTCCAGAGTCAGGG ***************** Forward primer CCACACATTCACTTGCTCACC Reverse primer CCTCATTCTGTTTGGTGAAGCT -43-