7. semester Bachelorprojekt, Bioanalytikeruddannelsen, Metropol Metodevalidering af P- M-komponent; arb.k.(0,1), på Capillarys 2. Skrevet af: Jesper Østrup Nielsen 29.10.1984 Vejledere: Conni Jølving, underviser på bioanalytiker uddannelsen, Professionshøjskolen Metropol Mariann Jensen, underviser på Københavns Praktiserede Lægers Laboratorium Projektperiode: 26. okt. 2009 8 Jan. 2010 [2010]
Forord: Dette projekt er udarbejdet på Københavns Praktiserende Lægers Laboratorium. Den praktiske del af projektet er ud arbejdet sammen med Mary Pedersen, 7. semester studerende, mens den litterære del af projektet er udarbejdet individuelt. I forbindelse med udarbejdelsen af dette projekt ønsker jeg at takke vores 2 vejledere, Mariann Jensen underviser på KPLL, samt Conni Jølving underviser på Metropol højskolen i København, for deres gode vejledningen under processen. Endvidere skal der også rettes en tak til Conni Larsen, afdelingsbioanalytiker på KPLL, samt Bent Lind, overlæge på KPLL, som begge har hjulpet os med at tolke resultater, udarbejdelse af metode, samt for at skaffe os artikler og statistikker, som er benyttet i dette projekt. Til sidst vil vi gerne sige tak til Lars Bendixen fra Sebia, som har hjulpet os med at få de sidste detaljer på plads, hvor vi ikke har kunnet finde svaret andet steds. Metodevalidering af Capillarys 2 Jesper Østrup Nielsen 2
Indholdsfortegnelse: Resume:... 5 1. Introduktion:... 6 1.1 Baggrund:... 6 1.2 Formål:... 7 1.3 Problemformulering:... 7 1.4 Problemuddybning:... 7 1.5 Teori:... 9 1.5.1 M-komponenter:... 9 1.5.2 Analyseprincip for Capillarys 2... 10 1.6 Metodevalg og afgrænsning:... 10 1.7 Etiske overvejelser:... 14 2. Materialer og metode:... 14 2.1 Materialer:... 14 2.2 Metode:... 15 2.2.1 Udvælgelse og indsamling af patientprøver til metodesammenligningen:... 15 2.2.2 Generel fremgangsmåde:... 15 2.2.3 Metodesammenligning:... 15 2.2.4 Linearitet/detektionsgrænse:... 16 2.2.5 Interferens:... 16 2.2.6 Interseriel impræcision:... 16 2.2.7 Intraseriel impræcision:... 16 2.2.8 Præanalytiske forhold/holdbarhed:... 16 3. Resultater:... 17 3.1 Kontroller:... 17 3.2 Metodesammenligning:... 18 3.3 Linearitet og detektionsgrænse:... 19 3.4 Interferens:... 19 3.5 Interseriel impræcision:... 21 3.6 Intraseriel impræcision:... 21 3.7 Præanalytiske forhold/holdbarhed:... 22 4. Diskussion:... 23 4.1 Kontroller:... 23 Metodevalidering af Capillarys 2 Jesper Østrup Nielsen 3
4.2 Metrologisk sporbarhed:... 23 4.3 Metodesammenligning:... 23 4.4 Måleinterval:... 25 4.5 Detektionsgrænse og linearitet:... 25 4.6 Interferens/analytisk specificitet:... 26 4.7 Interseriel impræcision:... 27 4.8 Intraseriel Impræcision:... 27 4.9 Robusthed:... 28 4.10 Afsmitning:... 29 4.11 Præanalytiske forhold/holdbarhed:... 29 5. Konklusion:... 30 6. Perspektivering:... 30 7. Litteraturliste:... 31 8. Bilag:... 32 Metodevalidering af Capillarys 2 Jesper Østrup Nielsen 4
Resume: Vi har undersøgt, om P- M-komponent; arb.k.(0,1) kan flyttes fra den i dag anvendte gelelektroforese metode, til kapillærelektroforese på Capillarys 2. Dette har vi undersøgt vha. en metodevalidering, der er udarbejdet efter DANAK s forskrifter (3). 150 serum prøver blev udvalgt, heraf 34 positive for M- komponent og 116 negative. Capillarys 2 formåede, at identificere alle de positive M-komponent prøver undtagen en. Dette kan skyldes, at vi ikke har tilstrækkelig erfaring til entydigt at tolke resultaterne fra Capillarys 2, dog var vi enige om at sende prøven til typebestemmelse, men da vi skulle afgive analysesvaret kvalitativt blev det negativ. Capillarys 2 detektionsgrænse og linearitet blev ligeledes undersøgt, vi fandt, at Capillarys 2 s detektionsgrænse ligger mellem 1-2 g/l M-komponent. Lineariteten for Capillarys 2 var i området 2-10 g/l af M-komponent rigtig god, da R 2 -værdien blev beregnet til 0,9996. Den øvre grænse blev ikke undersøgt, men er også mindre relevant, da svaret fra Capillarys 2 skal afgives kvalitativt. Ydermere anvendte vi 5 EDTA, 5 Citrat og 5 CRP (koncentrationer 19-84g/l) prøver for at undersøge, om faktorer som fibrinogen og CRP kunne påvirke analyse svaret. Her fandt vi, at plasmaprøver, dvs. fibrinogen, vil påvirke β2-fraktionen til at blive falsk forhøjet, i en sådan grad, at det kunne tolkes som en M-komponent. Resultatet for de 5 CRP prøver viste, at det ikke påvirkede analysesvaret ved koncentrationer af CRP på 19-84 g/l. Der blev også udført inter- og intraseriel impræcision. Resultaterne viste god overensstemmelse med resultaterne opnået af fabrikanten, Sebia, dog opnåede vi med vores forsøg en generel lavere CV %. Sidst blev holdbarheden undersøgt. 2 serumprøver blev udvalgt (frisk og gammel prøve), den ene opbevaret ved 2-8 C den anden ved -18 C. Prøven opbevaret ved 2-8 C blev analyseret første gang samme dag som blodprøven var taget, og herefter hver 4.dag. Her fandt vi, at analysesvaret blev påvirket efter 8-12 dage. Den anden prøve blev analyseret første gang inden holdbarhedskravet fra Sebia udløb og anden gang en måned efter. Forsøget viste ingen betydelig forskel i analyseresultatet. De andre punkter i DANAK s forskrift blev undersøgt litterært. Overordnet set mener vi, at P- M-komponent; arb.k.(0,1) kan flyttes fra den i dag anvendte gelelektroforese metode til kapillærelektroforese på Capillarys 2. Metodevalidering af Capillarys 2 Jesper Østrup Nielsen 5
1. Introduktion: 1.1 Baggrund: M-komponent Monoklonalt immunoglobulin, er defineret som et enkelt immunoglobulin, eller en del heraf, der forekommer i så høj koncentration, at den fremtræder som et abnormt distinkt proteinbånd ved elektroforese. Ved monokonalt forstås, at immunoglobulinet stammer fra samme plasmacelle-klon (5). Figur 1: På Københavns Praktiserende Lægers Laboratorium (KPLL) modtog man i 2008 ca. 4000 serum prøver til analysering for M-komponent. Omkring 5 % (ca. 200 prøver) af disse blev fundet positive (11). Endvidere viser flere populationsstudier en relativ høj prævalens af M-komponenter i den almindelige voksne befolkning (ca. 1 %), og prævalensen stiger med alderen. Samme undersøgelse har også påvist M-komponent hos 0,1-0,3 % af bloddonorer (2). Myelomatose er den hyppigste sygdomstilstand forbundet med fund af M- komponenter(2). Man har i november 2009 udgaven af Dbio s medlemsblad kunne læse om en patients kamp med sygdommen, som kan have mange symptomer og følgevirkninger. Symptomerne på myelomatose kan være smerter i arme, ben, ryg, vedvarende træthed og hyppige infektioner. Myelomatose kan ikke helbredes, men det er muligt at holde sygdommen i ro i lange perioder (4). Derfor er en sikker diagnose og et tidligt fund af disse M- komponenter essentielt for at mindske følgevirkningerne disse kan have. Figur 1 viser resultatet af en almindelig gelelektroforese. Til venstre ses det tydeligt at der er et abnormt protein bånd, altså en M- komponent. Til højre ses en prøve uden M-komponent. (19) I dag benytter KPLL sig af Beckmann Appraise, der anvender gelelektroforese til analysering af patientprøver for M-komponent i serum. Leverandøren af den anvendte agarosegel har meddelt afdelingen, at de pr. 01.04.2009 ikke længere fremstiller/leverer den aktuelle gel. Dette har forårsaget, at man på KPLL har været nødt til at finde en alternativ metode til påvisning af M-komponent. Valget er faldet på Capillarys 2 fra Sebia et apparat, der benytter kapillærelektroforese til påvisning af M-komponenter i serum og urin. En anden stor forskel på de to analysemetoder er, at Capillarys 2 er et fuldt automatiseret apparat, som kan analysere ca. 85 prøver pr. time (15). Ved gelelektroforese metoden kan der max. udføres 40 M-komponent analyser på en dag. Metodevalidering af Capillarys 2 Jesper Østrup Nielsen 6
På KPLL vil der kun blive foretaget screening af prøver fra de praktiserende læger, mens der på Hvidovre hospital både foretages screening og type-klasse bestemmelse af de forskellige M-komponenter (IgG, IgA, IgM, IgD og IgE, samt Kappa eller Lambda). Dette betyder, at patientprøver der på KPLL er bestemt positive, sendes videre til Hvidovre hospital for at blive typebestemt. Når en analyse skal flyttes fra et apparatur til et andet, skal der udarbejdes en metodevalidering af den nye metode. En metodevalidering bør indeholde visse faste punkter bestemt af Den Danske Akkrediterings og Metrologifond (DANAK) (3), se 1.4 problemuddybning. Disse punkter vil alle blive berørt i større eller mindre grad. Nogle af punkterne undersøges vha. praktiske laboratorieforsøg, mens andre vil blive besvaret litterært, dvs. besvaret ved hjælp af videnskabelige artikler eller lignende. 1.2 Formål: Formålet med dette projekt er at udarbejde en metodevalidering af P- M-komponent; arb.k.(0,1) til Capillarys 2. Denne skal bruges til at vurdere, hvorvidt analysen kan overføres til det nye apparatur. Hvis analysen kan overflyttes, vil det for bioanalytikerne på KPLL betyde en markant hurtigere arbejdsgang ved analysering af patientprøver, da Capillarys 2 er et fuldautomatiseret apparatur. En udarbejdelse af en metodevalidering kræver mange undersøgelser, og derfor vil vores projekt kunne bidrage til den endelige metodevalidering af M-komponent analysen på Capillarys 2, som udarbejdes af dennes metodeansvarlige. 1.3 Problemformulering: Hvordan påvirkes resultater og arbejdsgang på Københavns Praktiserende Lægers Laboratorium, hvis P- M-komponent; arb.k.(0,1) flyttes fra den i dag anvendte gelelektroforese til kapillærelektroforese på Capillarys 2 vurderet ved udarbejdelse af en metodevalidering? 1.4 Problemuddybning: Vi vil undersøge Capillarys 2 på følgende punkter jævnfør DANAK s anvisning om udarbejdelse af metodevalideringer (3): Metrologisk sporbarhed: Her angives toppen af hierarkiet for de målestandarder, hvortil resultaterne kan spores. Korrekthed og metodesammenligning Her anvendes serum prøver til at sammenligne resultater fra Capillarys 2 og Gelelektroforesen. Metodevalidering af Capillarys 2 Jesper Østrup Nielsen 7
Måleinterval Måleintervallet er det interval, hvor metoden kan afgive et kvantitativt svar med acceptabel sikkerhed. I vores tilfælde afgives svaret kvalitativt, og måleinterval besvares herefter. Detektionsgrænse Detektionsgrænsen er det laveste analyseresultat metoden kan måle med acceptabel sikkerhed. Analytisk specificitet Defineres som metodens evne til at kunne måle målestørrelsen. Her angives også eventuelle elementer, der kan interferere med analysesvaret. Linearitet Lineariteten er den direkte proportionalitet mellem måleresultat og værdien af målestørrelsen indenfor det givne måleinterval. Intermediær præcision Herunder bestemmes den intraserielle impræcision samt dag til dag impræcisionen. Robusthed Robusthed vurderer en metodes påvirkning af ændringer i ydre forhold såsom temperatur og ved skift af reagens lot nr. Afsmitning Afsmitning betyder, at en prøve med en given høj eller lav koncentration, kan indvirke på analyseresultatet af den efterfølgende analyserede prøve. Præanalytiske forhold Her angives hvilke præanalytiske forholdsregler, der er gældende op til analysering af prøvematerialet. Metodevalidering af Capillarys 2 Jesper Østrup Nielsen 8
1.5 Teori: 1.5.1 M-komponenter: M-komponenter er et enkelt immunoglobulin, der fremtræder i en sådan grad, at det fremtræder som et abnormt distinkt bånd ved elektroforese (5). M-komponenter syntetiseres af en gruppe af plasmacelle kloner, som alle producerer en slags immunoglobuliner. M-komponenten er forskellig fra de normale antistoffer/immunoglobuliner, der produceres i raske plasmaceller ved, at det ikke bekæmper infektion. Hvis M-komponent er af høj koncentration, kan denne undertrykke de normale plasmaceller, hvilket medfører nedsat produktion af de normale immunoglobuliner. Der opstår herved hypogammaglobulinæmi og heraf øget infektionstendens (17). M-komponenter er opbygget af to lette og to tunge kæder, og inddeles i type og klasse efter disse. Der findes 5 klasser af M-komponenternes tunge kæder, IgG, IgA, IgM, IgD og IgE, hvor de hyppigste fund er af typerne A, G og M. Imodsætning til de tunge kæder findes der kun 2 typer af lette kæder disse benævnes Kappa og Lambda, hvor Kappa findes i 60 % af tilfældene (2). Fundet af en M-komponent opstår ofte tilfældigt, men de tilfælde, hvor raske personer får konstateret en M-komponent, kaldes for Monoklonal gammopati af ukendt signifikans (MGUS). I andre tilfælde er fundet af en M-komponent krævet for at kunne stille en diagnose som f.eks. myelomatose, som er den hyppigste sygdomstilstand forbundet med fund af M-komponenter. Når der analyseres for M-komponenter vha. elektroforese, bliver blodets proteiner delt op i 6 fraktioner (Albumin, α1, α2, β1, β2 og γ), disse fraktioner består hovedsagligt af akutproteiner (Se figur 2). M- komponenter findes hyppigst i γ-fraktionen, men kan teoretisk set findes i alle fraktionerne (5). Ved gelelektroforese kan en M-komponent ses som et abnormt distinkt bånd, hvor det ved kapillærelektroforese udført på Capillarys 2 kan ses som en uregelmæssighed i kurven (se figur 6). Hvis en sådant uregelmæssighed bliver opdaget, kan man ved hjælp af en metode kaldet immunofixation klassificerer M-komponentens type og klasse. Denne klassifikation af M-komponenten er nødvendig for at erklærer, om en patient har en M-komponent eller ej. Ligeledes skal patienter, der tidligere har fået konstateret en M-komponent, have foretaget en ny immunofixation som er negativ, før de kan erklæres raske (5). Immunofixation er nødvendig, da f.eks. oligoklonale bånd kan forveksles med M-komponenter ved gel og kapillær elektroforese. Figur 2: Figur 2 viser et elektropherogram og nogle af de proteiner der spiller ind på størrelsen af hver fraktion. (6) Metodevalidering af Capillarys 2 Jesper Østrup Nielsen 9
1.5.2 Analyseprincip for Capillarys 2 Capillarys 2 anvender kapillærelektroforese til separation af proteiner og andre hydrofile stoffer. Proteinerne adskilles i et kapillærrør fortyndet med en alkalisk buffer ved ph 9,9, og detekteres ved absorptionsspektrometri ved bølgelængde 200nm af en deuterium lampe, hvorefter de forskellige proteinfraktioner optegnes i et elektropherogram. Under migrationen vil proteinerne være påvirket dels af de elektriske kræfter, og dels af de elektroosmotiske kræfter. De elektriske kræfter bevirker, at positivt ladede molekyler vil blive tiltrukket af katoden, og negativt ladede proteiner af anoden. De elektroosmotiske kræfter opstår ved, at positivt ladede ioner i bufferen bliver tiltrukket af kapillærernes negativt ladede sillicacoatede inderside samtidig med, at de selv samme ioner tiltrækkes af katoden. Disse elementer bevirker et elektroosmotisk flow imod katoden, hvor detektoren er placeret. De 8 kapillærer, som Capillarys 2 indeholder, er indlejret i et såkaldt Peltier-modul således at temperaturen forbliver stabil. Efter migration og aflæsning af en prøve, bliver kapillæret vasket med wash solution (10). Capillarys 2 anvender 20-40μl prøvemateriale til analysering af M-komponent, og har en dødvolume på 300μl (15). Figur 3: Figur 4: Figur 3 illustrer princippet bag kapillærelektroforesen. (9) Figur 4 viser et elektropherogram af en normal serum prøve uden M-komponent. 1.6 Metodevalg og afgrænsning: Som tidligere nævnt undersøges visse af punkterne ved laboratorie forsøg, mens andre besvares litterært. De punkter af metodevalideringen vi ønsker at undersøge i laboratoriet er; metodesammenligning, detektionsgrænse, linearitet, analytisk specificitet samt præanalytiske forhold. De resterende punkter i metodevalideringen forsøges besvaret litterært. Den metrologiske sporbarhed vil blive besvaret litterært. Metodevalidering af Capillarys 2 Jesper Østrup Nielsen 10
Til metodesammenligningen vil vi anvende resultater fra Capillarys 2, samt resultater fra gelelektroforesen som er metoden, der i dag benyttes på KPLL. Gelelektroforesen anvendes som vores referencemetode. M- komponent analysen på Capillarys 2 er en kvantitativ analyse, men på KPLL afgives svaret kvalitativt til den rekvirerende læge Altså som positiv eller negativ. Resultaterne fra gelelektroforesen skal bruges til at vurdere Capillarys 2 s evne til at detektere M- komponenter. Her forventes det, at Capillarys 2 mindst opnår samme analyseresultater eller bedre, dvs. at alle prøver, der er fundet positive ved reference metoden også findes positive ved kapillærelektroforesen. Men da der anvendes to forskellige analyse metoder, kan det ikke forventes, at der er 100 % overensstemmelse mellem resultaterne. Ved udvælgelse af prøver har vi ønsket at medtage så mange M- komponent positive prøver som muligt. Vores prøver er derfor udvalgt ud fra analyseresultaterne, der er opnået ved referencemetoden (gelelektroforesen). Vi har valgt at anvende 150 serumprøver, der har indgået i rutinen på KPLL for M-komponent. Vi har udvalgt 34 M-komponent positive prøver og 116 M- komponent negative prøver. Grunden til vi har valgt at anvende 150 prøver er dels, at Professionshøjskolen Metropol har fastsat, at vi højst må anvende 200 prøver til projektet, og dels at der ikke var fundet så mange M-komponent positive prøver i rutinen. Det er fra producentens side oplyst, at serum til M-komponent analyse på Capillarys 2 har en holdbarhed på 1 måned ved - C (14), og vi har udvalgt de M-komponent negative prøver ud fra dette kriterium. Alle de udvalgte negative prøver er fra perioden 6.10.2009 30.10.2009, og vil blive analyseret mellem d. 3.11.2009 og d. 5.11.2009. Vi har derimod været nødsaget til at anvende M-komponent positive prøver, hvor den anbefalede holdbarhed er overskredet. Dette skyldes, at der på KPLL ikke er fundet tilstrækkelig mange M-komponent positive prøver. Vi mener ikke at overskridelse af den anbefalede holdbarhed bør have indflydelse for vores projekt, da vi udelukkende skal konstatere, om der er en M-komponent tilstede eller ej. For at vurdere Capillarys 2 s identifikationskraft opstilles et skema for antal positive og negative serum prøver analyseret ved gelelektroforese sammenlignet med antallet af positive og negative serum prøver fundet ved Capillarys 2 s kapillærelektroforese. Måleintervallet vil blive beskrevet litterært, dog vil vi som følge af vores linearitet undersøgelse kunne understøtte vores litteratur. Detektionsgrænsen vil blive undersøgt. Dette gøres vha. en fortyndingsrække af en serumprøve med en kendt høj koncentration af M-komponent. Ved hjælp af denne fortyndingsrække vil vi kunne vurdere metodens detektionsgrænse, hvilket er af interesse, da selv en svag koncentration af M-komponent kan være en indikation på f.eks. light chain disease, lymfatisk leukæmi eller MGUS m.fl. Fortyndingerne af den Metodevalidering af Capillarys 2 Jesper Østrup Nielsen 11
udvalgte prøve vil have en koncentration af M-komponent på henholdsvis ca. 0,5 g/l, 1 g/l, 2 g/l, 2,5 g/l, 3 g/l 3,5 g/l, 4 g/l, 4,5 g/l 5 g/l og 10 g/l.. Vi har valgt disse fortyndinger, da detektionsgrænsen for Capillarys apparatet ifølge artiklen af Bergón, Enrique er ca. 3,5g/l (1). Detektionsgrænsen vurderes ved at der opstilles et xy-plot, hvorved vi kan se, hvornår der opstår uregelmæssigheder I lineariteten. Der anvendes buffer fra Capillarys 2 til at fortynde med. Da der laves fortyndinger foretages der dobbelt bestemmelse af resultaterne. Middelværdierne af disse resultater vil blive anvendt til xy-plottet. Capillarys 2 s linearitet vil ligeledes blive undersøgt vha. selvsamme fortyndingsrække anvendt ved undersøgelse af detektionsgrænsen. Dette er med til at vurdere proportionaliteten i det valgte måleområde (0,5-10g/l af M-komponent). Vi har valgt ikke at medtage fortyndinger med en højere koncentration af M- komponent, da flere tidligere udarbejdede valideringsrapporter har vist, at de ikke har kunne bestemme den øvre grænse for lineariteten. Derfor vil vi også kun kunne udtale os om lineariteten I området fra 0,5g/l til 10g/l, dog kan vi ved hjælp af forskellige valideringsrapporter og artikler udtale os om et større interval. Da vi som før nævnt kun skal afgive svaret kvalitativt, er det mindre vigtigt at kunne vurdere Capillarys 2 s øvre grænse for linearitet. Lineariteten undersøges ved at anvende det før optegnede xy-plot, som også blev anvendt til detektionsgrænsen. På denne måde vil vi kunne vurdere, hvor detektionsgrænsen ligger, samt undersøge Capillarys 2 s linearitet i det givne interval. Ydermere vil vi beregne linjens ligning samt R 2 ved de mindste kvadraters metode. Disse giver begge et mål for lineariteten I måleområdet. Den analytiske specificitet vil blive besvaret vha. laboratorieforsøg. Her vil vi anvende hhv. 5 EDTA stabiliserede plasma prøver, 5 citrat stabiliserede plasma prøver, og 5 serum prøver med en høj koncentration af CRP. EDTA og citrat prøver anvendes for at vurdere, hvorvidt fibrinogenen i disse prøver påvirker den visuelle vurdering af resultaterne. Grunden til, at der er udvalgt 5 prøver af hver, og ikke blot én skyldes, at vi ikke ud fra en prøve kan bevise en tendens. Fibrionogen kan påvirke β2 fraktionen til at blive falsk forhøjet. En høj koncentration af CRP i prøve vil ligeledes give en falsk forhøjet β2 fraktion. For at undersøge dette analyseres hver enkel EDTA og citrat prøve også på deres tilhørende serumglas. Herefter opstilles et skema som viser forskellen i de forskellige fraktioner. Udfra skemaet vurderes fibrinogens påvirkning af de 6 fraktioner. CRP prøvernes β2 fraktion vil blive sammenlignet med reference intervallet for denne fraktion, således kan CRP s indvirkning på B2 fraktionen vurderes. Andre faktorer såsom hæmolyse, haptoglobinfænotype og genetiske uregelmæssigheder kan også spille ind på den visuelle tolkning af resultater. Disse vil dog blive forsøgt besvaret litterært. Metodevalidering af Capillarys 2 Jesper Østrup Nielsen 12
Den interserielle impræcision vurderes ved at analysere normalkontrollen fra Sebia i alle kapillærer en gang hver dag i 10 dage. Efterfølgende kan vi anvende disse resultater til at bestemme en middelværdi, SD, CV %, samt at opstille et acceptinterval omkring denne kontrol. Eventuelle outliers vil blive sorteret fra, hvis deres resultat ligger mere end +/- 5 x SD fra middelværdien. Ligeledes vurderes Capillarys 2 s intraserielle impræcision. Her anvendes 2 serumprøver i stedet for kontrolmateriale fra Sebia. De 2 serum prøver analyseres begge 20 gange i træk, i 2 udvalgte kapillærer. Vi har valgt at anvende serumprøver til denne del af forsøget, da kontrol materiale er meget dyrt, og derfor vil det økonomisk set bedre kunne betale sig at anvende serum. Her beregnes ligeledes middelværdi, SD, og CV %. Den intraserielle impræcision kan også anvendes, hvis endnu et Capillarys 2 apparat skal tages i brug. Her kan man anvende resultaterne fra den intraserielle impræcision i stedet for at skulle analyserer kontrollerne interserielt. Den interserielle undersøgelse skal dog udføres på det nye apparat, men stemmer den intraserielle CV % overens med den intraserielle CV % på det apparat, der er taget i brug i rutinen, kan det nye apparat anvendes i rutinen med det samme. Robustheden vurderes litterært, da vi kun har analyseret én patientprøve efter skift af reagens lot nr. Faktorer som temperatur, luftfugtighed med videre vil ikke blive omtalt. Afsmitningen i apparatet vil blive besvaret litterært. De præanalytiske forhold vil blive undersøgt. Her har vi valgt at fokusere primært på holdbarheden af serum prøver, som skal analyseres for M-komponenter på Capillarys 2. Vi har udvalgt én frisk serum prøve, dvs. en serum prøve, som har samme prøvetagningsdato, som den dag, hvor den første gang bliver analyseret. Herefter analyseres den ca. hver 4 dag for at undersøge, hvornår der sker en ændring i den visuelle vurdering af analyseresultatet. Prøven opbevares mellem analysering ved 2-8 C. Der er også udvalgt en prøve, som har været nedfrosset ved -18 C, men som stadig overholder Sebias holdbarhed krav på 1 måned ved denne temperatur (14). Prøven vil blive analyseret 1. gang et par dage inden holdbarhedskravet fra Sebia overskrides, og 2. gang ca. en måned efter, hvor holdbarhedskravet fra Sebia er overskredet. Mellem de to analyseringer opbevares prøven ved -18 C, for at minimere eventuelle ændringer i serummet. Andre præanalytiske faktorer såsom interferens og alternativt prøvemateriale er beskrevet under analytisk specificitet. Metodevalidering af Capillarys 2 Jesper Østrup Nielsen 13
1.7 Etiske overvejelser: Da vi kun anvender prøver, som er indgået i rutinen på KPLL, vil der være afgivet svar til den rekvirerende læge. Er der uoverensstemmelser mellem rutine analyseresultaterne og analyseresultaterne opnået ved analysering på Capillarys 2, konfereredes der med M-komponent analysens metodeansvarlige, som tager stilling til hvorvidt der skal gøres noget ved dette. 2. Materialer og metode: 2.1 Materialer: Apparatur: Capillarys 2 Se nr: 100272 Pipette 20-200μl Se nr. J03814 Pipette 200-1000 μl Se nr. AK4 94739 Reagenser, kontroller og kalibratorer: 1 Protein(e) 6 kit Lot.: 06059/01 (Nok til 740 analyseringer) Protein(e) 6 alkaline buffer ph 9,9 (klar til brug) Protein(e) 6 wash solution (75 ml NaOH koncentrat) Fortyndingssegmenter 3 Filtre Normalkontrol Lot.: 19039/01 Ingen kalibratorer Prøvemateriale: 150 serum prøver 5 EDTA stabiliserede plasma prøver 5 citrat stabiliserede plasma prøve 5 serum prøver med høj koncentration af CRP 1 frisk prøve 1 gammel prøve Metodevalidering af Capillarys 2 Jesper Østrup Nielsen 14
2.2 Metode: 2.2.1 Udvælgelse og indsamling af patientprøver til metodesammenligningen: Serum prøverne er indsamlet i perioden 24.8.2009 til 1.11.2009 og nedfrosset ved -18 C. 2.2.2 Generel fremgangsmåde: 1. Prøver fra frost tages ud af fryseren, og står til de har opnået stuetemperatur 20-25 C, og vendes derefter 20 minutter på et vendeapparat. Prøver, der allerede har stue temperatur, kan analyseres med det samme. 2. Kontrolmaterialet tages ud af køleskabet. Tørstoffet opløses i 1 ml destilleret/deioniseret vand og henstår 30 min. ved 20-25 C. Efter anvendelse stilles resten på køl ved 2-8 C til næste analysering. Kontrol materialet skal have stuetemperatur 20-25 C før analysering. 3. Wash solution opløses i deoiniseret/destilleret vand ad 750 ml, og bufferen påsættes direkte. 4. Opstart af Capillarys 2 foregår efter Sebias brugermanual (15). 5. Den interserielle kontrol analyses og godkendes jævnfør Sebias acceptintervaller på kontrol indlægsseddelen (16). 6. Prøverne analyseres, og i eventuelle tomme kapillærer sættes et plastglas med deioniseret vand. 7. Afslutningskontrollen analyseres og godkendes jævnfør Sebias acceptintervaller på kontrol indlægsseddelen (16). 8. Apparatet lukkes efter Sebias brugermanual (15). 2.2.3 Metodesammenligning: Den generelle fremgangsmåde anvendes, der analyseres 50 prøver pr. dag, dvs. analyseringen af patientprøver til metodesammenligningen foregår over 3 dage. Metodevalidering af Capillarys 2 Jesper Østrup Nielsen 15
2.2.4 Linearitet/detektionsgrænse: 1. Prøven tages ud af fryseren, og står til de har opnået stuetemperatur 20-25 C, og vendes derefter 20 minutter på et vendeapparat. 2. Der måles totalprotein på prøven på ADVIA 2400 3. Fortyndingerne fremstilles efter bilag 2, og vendes grundigt herefter. 4. Den generelle fremgangsmåde følges fra punkt 2. 2.2.5 Interferens: Plasma prøverne centrifugeres jævnfør apparatvejledningen dok nr: 20057-01 (12), herefter følges den generelle fremgangsmåde. 2.2.6 Interseriel impræcision: Den generelle fremgangsmåde anvendes, undtaget punkt 5 og 7. Endvidere anvendes rack 0 ved punkt 6, Capillarys 2 vil ved dette punkt have man indtaster lot nr et på den anvendte kontrol, som kan findes på kontrolflasken. 2.2.7 Intraseriel impræcision: Den generelle fremgangsmåde anvendes. Punkt 6 gentages dog 20 gange inden der fortsættes. 2.2.8 Præanalytiske forhold/holdbarhed: 1. Total protein for begge prøver måles på ADVIA 2400 jævnfør apparatvejledningen dok nr: 20055-03 (13) 2. Capillarys 2 opstartes jævnfør brugermanualen (15) 3. Start kontrollen analyseres og valideres jævnfør indlægsseddel til kontrollen (16). Kontrollen skal have opnået stue temperatur inden analysering. 4. Den friske og gamle prøve analyseres. 5. Slut kontrollen analyseres og valideres jævnfør indlægsseddelen til kontrollen (16). 6. Capillarys 2 lukkes ned efter brugermanualen (15). Herefter analyseres den friske prøve hver fjerde dag, indtil det ikke længere er muligt at opdele fraktionerne korrekt. Mellem analyseringerne opbevares prøven på køl ved 2-8 C. Den gamle prøve Metodevalidering af Capillarys 2 Jesper Østrup Nielsen 16
sættes på frys ved -18 C og analyseres igen en måned efter. Ved hver analysering medtages der start og slut kontroller. 3. Resultater: 3.1 Kontroller: Skema 1: Enhed: % Sebias Acceptintervaller omkring kontrollen i % Albumin α1 α2 β1 β2 γ Middelværdi 60,2 4,5 9,45 6,4 4,4 15,1 SD 3,0 0,7 1,175 0,95 0,7 1,5 CV % 5,0 15,6 12,4 14,8 15,9 9,9 Acceptinterval 54,2 66,2 3,1 5,9 7,1 11,7 4,5 8,3 3,0 5,8 12,1 18,1 *Skema 1 viser acceptintervallerne omkring normal kontrollen opgivet af Sebia (14). Skema 2: Start Kontroller Enhed: % Albumin α1 α2 β1 β2 γ 02.11.2009 60,7 4,4 9,1 6,6 4,4 14,8 03.11.2009 60,1 4,5 9,4 6,4 4,4 15,2 04.11.2009 60,5 4,5 9,3 6,4 4,3 15,1 05.11.2009 60,4 4,5 9,3 6,5 4,4 14,9 06.11.2009 60,8 4,5 9,2 6,5 4,4 14,7 09.11.2009 - - - - - - 10.11.2009 61,1 4,4 9,0 6,6 4,2 14,8 11.11.2009 60,8 4,4 9,3 6,3 4,3 14,9 12.11.2009 - - - - - - 13.11.2009 60,6 4,5 9,2 6,4 4,2 15,1 17.11.2009 60,8 4,4 9,3 6,3 4,2 15,0 01.12.2009 59,7 4,8 9,3 6,7 4,5 15,0 *Skema 2 viser start kontrollerne for de forskellige analyse dage. De dage hvor der ikke er medtaget en start kontrol, er dage, hvor der kun er analyseret interseriel impræcision, og derfor gør en start kontrol overflødig. Den grønne farve indikerer, at kontrollerne ligger indenfor Sebia s acceptinterval, og kan derfor godkendes. Metodevalidering af Capillarys 2 Jesper Østrup Nielsen 17
Skema 3: Afsluttende kontroller Enhed: % Albumin α1 α2 β1 β2 γ 02.11.2009 61,0 4,2 9,0 6,4 4,5 14,9 03.11.2009 61,2 4,4 9,0 6,3 4,4 14,7 04.11.2009 59,8 4,6 9,4 6,6 4,4 15,2 05.11.2009 59,4 4,6 9,9 6,3 4,5 15,3 06.11.2009 61,5 4,4 9,1 6,1 4,3 14,6 09.11.2009 - - - - - - 10.11.2009 61,4 4,4 9,2 6,3 4,0 14,7 11.11.2009 60,9 4,4 8,9 6,7 4,0 15,1 12.11.2009 - - - - - - 13.11.2009 61,1 4,3 9,2 6,4 4,3 14,7 17.11.2009 61,6 4,4 9,1 6,1 4,2 14,6 01.12.2009 60,0 4,7 9,2 6,5 4,3 15,3 *Skema 3 viser slut kontrollerne for de forskellige analyse dage. De dage, hvor der ikke er medtaget en slut kontrol, er dage, hvor der kun er analyseret interseriel impræcision, og derfor gør en slut kontrol overflødig. Den grønne farve indikerer, at kontrollerne ligger indenfor Sebia s acceptinterval, og kan derfor godkendes. 3.2 Metodesammenligning: 3 serumprøver gik tabt under analyseringen på Capillarys 2, og vil derfor ikke indgå i skema 7. Skema 4: Capillarys 2 Positiv Capillarys 2 Negativ Gelelektroforese Positiv 30 1 Gelelektroforese Negativ 3 113 *Skema 4 viser antallet af positive og negative serumprøver analyseret ved gel og kapillærelektroforese, og hvor der er forskel i resultaterne på disse. Rådata kan ses på bilag 1. Figur 5: Figur 6: Figur 5 viser resultatet fra Capillarys som er blevet fundet positiv ved gelelektroforesen Figur 6 viser et af de 3 resultater fra Capillarys, som er blevet fundet negativ ved gelelektroforesen. Metodevalidering af Capillarys 2 Jesper Østrup Nielsen 18
Målt koncentration af M-komponent i g/l 3.3 Linearitet og detektionsgrænse: Figur 7 12,00 Linearitet og Detektionsgrænse Linearitet y = 0,9951x - 0,0332 R 2 = 0,9996 10,00 8,00 6,00 Linearitet Detektionsgrænse Tendens linje for linearitet 4,00 2,00 0,00 0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 Forventet koncentration af M-komponent i g/l *Figur 7 viser resultatet af linearitet og detektionsgrænse undersøgelsen, linjens ligning og R 2 er også beregnet for lineariteten. Endvidere er der indtegnet en tendens linje, som viser den bedste rette linje gennem punkterne. Rådata kan ses på bilag 2. 3.4 Interferens: Skema 5: Interferens Enhed: % Difference (Serum - Citrat) Prøve Albumin α1 α2 β1 β2 γ Citrat 1 1,8 0,2 1,0 0,6-5,4 1,8 Citrat 2 0,7 0,4 0,9 0,4-5,9 3,5 Citrat 3 2,1 0,2 0,5 0,5-3,3 Citrat 4 2,3 0,3 0,7 1,0-6,4 2,1 Citrat 5 2,6 0,2 0,1 0,3-5,2 2,0 *Skema 5 viser forskellen i % ved analysering af 5 prøver på henholdsvis serum og citrat stabiliseret plasma, i prøve 3 var der en M-komponent, hvilket gjorde det umuligt at adskille β-fraktionerne. Rådata kan ses på bilag 3. Metodevalidering af Capillarys 2 Jesper Østrup Nielsen 19
Figur 8: Figur 9: Figur 8 viser et elektropherogram af en prøve analyseret på citrat-plasma Figur 9 viser et elektropherogram af den tilhørende serum prøve fra figur 8 Skema 6: Interferens Enhed % Difference (Serum EDTA) Prøve Albumin α1 α2 β1 β2 γ EDTA 1 4,3 0,0 0,5 0,7-7,9 2,4 EDTA 2 4,3 0,3 0,1 0,5-6,8 1,6 EDTA 3 3,7 0,1 0,2 0,4-8,2 3,8 EDTA 4 2,3 0,5 0,4 0,6-6,7 2,9 EDTA 5 3,2 0,0 0,0 0,6-5,4 1,6 *Skema 6 viser forskellen i % ved analysering af 5 prøver på henholdsvis serum og EDTA stabiliseret plasma. Rådata kan ses på bilag 3. Figur 10: Figur 11: Figur 10 viser et elektropherogram af en prøve analyseret på EDTAplasma. Figur 11 viser et elektropherogram af den tilhørende serum fra figur 10. Metodevalidering af Capillarys 2 Jesper Østrup Nielsen 20
Skema 7: Interferens Enhed % CRP Prøve Albumin α1 α2 β1 β2 γ CRP = 52g/l 51,8 7,4 17,0 6,6 5,6 11,6 CRP = 19g/l 54,4 5,5 12,8 7,4 5,2 14,7 CRP = 22g/l 50,4 4,8 10,3 7,4 4,1 23 CRP = 84g/l 45,5 7,2 16,9 7,9 7,0 15,5 CRP = 28g/l 38,9 5,2 11,8 7,6 7,3 29,2 *Skema 7 viser resultaterne for analyseringen af 5 prøver med en forhøjet koncentration af CRP. 3.5 Interseriel impræcision: Skema 8: Enhed: % Albumin α1 α2 β1 β2 γ Middelværdi 60,6 4,5 9,2 6,5 4,3 14,9 SD 0,4 0,1 0,2 0,2 0,2 0,2 CV % 0,7 2,2 2,1 2,6 3,7 1,5 Acceptinterval 59,8 61,5 4,3 4,7 8,8 9,6 6,2 6,8 4,0 4,6 14,5 15,4 *Skema 8 viser det samlede resultat for den interserielle impræcision af 8 kapillærer. Resultater for hvert enkel kapillær kan ses på bilag 4. 3.6 Intraseriel impræcision: Skema 9: Enhed: % Albumin α1 α2 β1 β2 γ Middelværdi 41,2 7,3 14,0 5,6 2,2 29,8 SD 0,3 0,1 0,2 0,1 0,2 0,2 CV % 0,6 1,1 1,1 1,5 9,1 0,7 *Skema 9 viser resultaterne for prøve 1 anvendt til den intraserielle impræcision, prøver er analyseret i kapillær 1. Rådata kan ses på bilag 5. Skema 10: Enhed: % Albumin α1 α2 β1 β2 γ Middelværdi 40,5 5,2 7,7 3,1 5,0 38,6 SD 0,3 0,1 0,1 0,1 0,1 0,2 CV % 0,6 2,2 1,4 2,9 2,4 0,4 *Skema 10 viser resultaterne for prøve 2 anvendt til den intraserielle impræcision, prøven er analyseret i kapillær 2. Rådata kan ses på bilag 5. Metodevalidering af Capillarys 2 Jesper Østrup Nielsen 21
Skema 11: Enhed: % Albumin α1 α2 β1 β2 γ Middelværdi 47,6/47,0 5,2/5,2 7,5/7,3 5,5/5,7 5,4/5,5 28,8/29,3 SD 0,5/0,6 0,2/0,2 0,2/0,2 0,1/0,1 0,2/0,2 0,5/0,3 CV % 1,0/1,3 4,1/3,1 2,7/2,9 1,7/2,3 3,7/2,8 1,7/1,2 *Skema 11 viser et udvalgt resultat af den intraserielle impræcision udført af Sebia (14), hvor en serumprøve er analyseret på 2 forskellige lot nr af buffer. 3.7 Præanalytiske forhold/holdbarhed: Skema 12: Holdbarhed Enhed: % Frisk Prøve Analysering Albumin α1 α2 β1 β2 γ 02.11.2009 61,1 3,6 7,9 6,4 5,3 15,7 06.11.2009 60,6 3,7 8 6,8 5,5 15,4 10.11.2009 60,1 3,8 8,3 7,1 5,1 15,6 13.11.2009 60,3 3,8 - - - - 17.11.2009 60,5 3,8 - - - - *Skema 12 viser resultaterne for de 5 analyseringer af den friske prøve. Figur 12: Figur 13: Figur 12 viser et elektropherogram af analyseringen af den friske prøve d. 13.11.2009 Figur 12 viser et elektropherogram af analyseringen af den friske prøve d. 17.11.2009 Skema 13: Holdbarhed Enhed: % Gammel Prøve Analysering Albumin α1 α2 β1 β2 γ 02.11.2009 58,3 3,7 8,9 6,6 2,7 19,8 01.12.2009 59,3 3,7 8,7 6,5 2,3 19,5 *Skema 13 viser resultaterne for de 2 analyseringer af den gamle prøve. Metodevalidering af Capillarys 2 Jesper Østrup Nielsen 22
4. Diskussion: 4.1 Kontroller: Udfra skema 2 & 3 ses det, at alle kontroller ligger indenfor Sebia s acceptinterval. Det betyder at vi kan godkende vores kontroller, og dermed stole på de resultater vi har fået i dette projekt. Det skal dog bemærkes at Sebia s acceptintervaller for normal kontroller er meget store, derfor er det vigtig for afdelingen at få udarbejdet deres egne acceptintervaller, der opfylder deres krav til denne analyse. 4.2 Metrologisk sporbarhed: M-komponent analysen er sporbar til gelelektroforesen. Havde vi også skulle afgive et kvantitativt svar, ville analysen være sporbar til total protein analysen. 4.3 Metodesammenligning: For at vurdere Capillarys 2 identifikationskraft er der indsamlet 150 serum prøver, der på KPLL har indgået i rutinen til M-komponent analyse ved gelelektroforese. Prøverne er herefter analyseret i en tilfældig rækkefølge på Capillarys 2, og derefter sammenlignet med rutine svaret. Resultatet kan ses i skema 4. I skema 4 ses det, at der er 143 prøver, hvor de 2 analysemetoder har fundet samme svar. 113 af disse var negative og 30 var positive. 3 af prøverne blev fundet positive på Capillarys 2, men ikke ved gelelektroforese, og 1 prøve blev fundet positiv ved gelelektroforese men ikke på Capillarys 2. 3 prøver gik tabt under analyseringen. Et af tilfældene, hvor Capillarys 2 har fundet serum prøven positiv, men gelelektroforesen har fundet den negativ, er illustreret på figur 6 under skema 4. Her kan vi se, at der tydeligt ses en M-komponent i γ- fraktionen på prøven. Her skal vi dog tage højde for prøvernes prøvetagningsdato, da vores positive prøver kan have overtrådt holdbarheds krav fastsat af Sebia. Som tidligere nævnt kan en overskridelse af holdbarhedskravet have indflydelse på den visuelle vurdering af Capillarys 2 resultaterne. Da vi ikke har stor erfaring med at tolke resultaterne fra Capillarys 2 skal disse 3 tilfælde, hvor der findes en forskel dog tages med forbehold. Dog mener jeg, at det er tydeligt at se, at der forefindes en M-komponent i disse 3 prøver. Dog skal disse 3 prøver typebestemmes, før man kan drage en endelig konklusion. Den ene prøve, hvor gelelektroforesen har fundet den positiv, men Capillarys har fundet den negativ, er illustreret på figur 5 under skema 4. Her er den visuelle vurdering dog noget vanskeligere, derfor rådførte jeg mig med Conni Larsen, som er afdelingsbioanalytiker på KPLL. Hun mente, at hvis hun skulle afgive et kvalitativt svar på Metodevalidering af Capillarys 2 Jesper Østrup Nielsen 23
denne prøve, ville det være, at den var M-komponent negativ. Dog blev vi enige om, at denne prøve ville blive sendt til typebestemmelse, hvis vi sad med prøven i rutinen. Alle tilfældene, hvor vi fandt en forskel i analysesvaret blev konfereret med overlæge Bent Lind. Han mente ikke det var nødvendigt, at indkalde de berørte patienter eller ændre det opgivne analyse resultat. Vi burde dog i de tilfælde hvor vi fandt en forskel have reanalyseret prøverne, men dette blev ikke gjort så uoverensstemmelserne først blev opdaget sent i projektperioden. Ifølge en valideringsrapport fra Slagelse anvendte de 129 M-komponent negative prøver og 58 M- komponent positive prøver til metodesammenligningen. Reference resultaterne var opnået med hhv. Capillarys Minicap, agarose gelelektroforese og Hydrasys, alle metoder, der er i stand til at finde M- komponenter. 123 af de 129 M-komponent negative prøver fik samme analysesvar ved analysering på Capillarys 2. Forskellen i analysesvaret for de sidste seks prøver skyldtes i ét tilfælde en forbytning af prøverne, at prøven kom for samme patient, skjulte M-komponenter i β2-fraktionen, og i ét tilfælde, at en meget svag M-komponent var tilstede. Sidst nævnte blev verificeret efter analysering på Hydrasys, som ligeledes fandt en svag M-komponent. Af de 58 positive M komponent prøver gav Capillarys 2 i 56 af tilfældene samme resultat. Her var der ét tilfælde hvor Hydrasys fandt en M-komponent, hvilket Capillarys 2 ikke gjorde, denne prøve havde dog en stærk oligoklonal baggrund. I det andet tilfælde indeholdt prøven 2 M-komponenter, hvor Capillarys 2 kun fandt den ene (8). Slagelses resultater af metodesammenligning stemmer fint overens med vores resultater, da de ligeledes finder få afvigelser i forhold til deres reference metoder. Kun Hydrasys apparat synes at være mere følsomt, når der skal screenes for M-komponenter. Uoverensstemmelserne mellem Hydrasys og Capillarys 2 ses primært ved tilstedeværelse af en stærk oligoklonal baggrund. En følsom gelelektroforese metode som Hydrasys anvender synes mindre påvirket af dette. Dette understøttes yderligere af artiklen af Yang, Z som sammenligner Capillarys 2 og Hydrasys identifikationskraft. Her har de fundet, at Hydrasys kunne finde 43 og Capillarys 39 M-komponent positive prøver ud af 48 mulige. Her har de anvendt immunofixation på Hydrasys, som det sande svar (18). At de i dette forsøg har flere tilfælde, hvor Capillarys 2 ikke kan detektere M-komponent kan skyldes at de anvender immunofixation som reference metode. Denne metode er meget mere sensitiv end en normal kapillærelektroforese, da den anvender specifikke antistoffer rettet imod antistofferne i M-komponent prøven, på denne måde kan selv lave koncentrationer af M-komponent detekteres. Men i vores tilfælde, hvor vores reference metode er gelelektroforese, kan det formodes, at Capillarys 2 er mere følsom til at detektere M-komponenter, idet vi har fundet 3 positive prøver, som var gelelektroforese negative. Dog med det forbehold at de 3 prøver som før nævnt bliver typebestemt, som positive af Hvidovre hospital. Metodevalidering af Capillarys 2 Jesper Østrup Nielsen 24
Vi kan derfor konkludere, at der er god overensstemmelse mellem de resultater vi har opnået i forhold til de resultater, der er opnået ved andre undersøgelser. 4.4 Måleinterval: Da vi kun afgiver analyseresultatet kvalitativt, er måleintervallet fra 0-100%. 4.5 Detektionsgrænse og linearitet: Figur 7 viser resultaterne af detektionsgrænse undersøgelsen. Vi kan ud fra figuren se, at detektionsgrænsen af M-komponenter for Capillarys 2 er ved koncentrationer af M-komponent på omkring 2g/l, og hvis vi kigger på bilag 2, kan vi se, at detektionsgrænsen må ligge imellem 1 og 2g/l. Dog skal der tages højde for, at denne undersøgelse er udført vha. en fortyndingsrække, dvs., at den anvendte serum prøve er blevet fortyndet med buffer. Da den oprindelige koncentration af M-komponenten i prøven var 18g/l og totalproteinen var 82g/l, skal man for at kunne opnå en koncentration af M-komponent på 1g/l have en fortyndingsfaktor på 18. Denne fortyndingsfaktor kan tænkes at have indvirket på matrixet i serum og derved gøre, at prøven ikke er målbar af Capillarys 2. Det betyder, at vi ikke entydigt kan konkluderer, hvor detektionsgrænsen ligger. For at vurderer den reelle detektionsgrænse, skal man anvende en serum prøve, der i forvejen har en lav koncentration af M-komponent, altså en M-komponent på ca. 5g/l eller derunder. Dog mener jeg, at detektionsgrænsen på 2g/l er et fornuftigt resultat, da man også skal tage højde for den polyklonale baggrund (immunoglobiner), der er tilstede, når man skal kvantiteter M- komponenter på Capillarys 2. Ifølge artiklen af Bergón, Enrique, er detektionsgrænsen for Capillarys 2 3,5g/l (1). Her anvendte de 3 serum prøver med totalprotein koncentrationer på 94,5 115 g/l, som herefter blev poolet. I forsøget var de i stand til at måle koncentrationer på henholdsvis 0,76, 0,76 og 1,09 g/l, for hver af de anvendte prøver. Men da den teoretiske koncentration skulle være 0,43, 0,33, og 0,89 g/l, kan disse resultater ikke anvendes, da usikkerheden er for stor. Endvidere er det oplyst af Sebia, at detektionsgrænsen af M-komponenter kan findes ned til koncentrationer på 0,27g/l (14). Dette er fundet vha. en fortyndingsrække af en serumprøve med en oprindelig koncentration af M-komponent på 4,3g/l. Men da vi kun skal anvende Capillarys 2 til at afgive et kvalitativt svar, bliver koncentrationer af M- komponenter på 2g/l eller mindre til en vurderingssag, hvorvidt vi er i stand til at se en M-komponent af denne størrelse eller ej, da vi kun afgiver analysesvaret som positivt eller negativt. Figur 7 viser ligeledes resultatet af linearitet undersøgelsen. Her kan vi ud fra linjens ligning og R 2 værdien vurderer Capillarys 2 linearitet i det valgte måle område (2 10g/l M-komponent). Her kan vi se at R 2 værdien, 0,9996, ligger meget tæt på 1, hvilket bevidner om en god proportionalitet mellem, de teoretiske Metodevalidering af Capillarys 2 Jesper Østrup Nielsen 25
og målte resultater i vores måleområde. I artiklen af Bergón, Enrique, har de dog fundet, at Capillarys 2 linearitet er god fra 15g/l og op til 115g/l totalprotein, og fra 3,5 til 56,91g/l M-komponent (1). Ved totalprotein værdier lavere end 15g/l har de fundet, at det målte analysesvar kan blive falsk forhøjet (1). Vi har dog ikke kunne bekræfte dette resultat ved vores forsøg. Endvidere er det oplyst fra Sebia, at Capillarys 2 er lineær ved koncentrationer af albumin op til 52g/l og koncentrationer af gammaglobiner op til 31g/l (14). Derfor vurderes det, at Capillarys 2 er lineær i området 15-115 g/l, når vi kigger på totalproteinen af serum prøverne og i intervallet 2-56 g/l, når vi kigger på koncentrationen af M-komponenter. Da vi, som tidligere nævnt, kun afgiver svaret som positivt eller negativt er den øvre grænse for lineariteten dog af mindre betydning, da vi selv ved høje koncentrationer af M-komponenter (>56,91g/l) vil være i stand til at vurderer hvorvidt M-komponenten er tilstede eller ej. Denne M-komponent kvantiteres af Hvidovre hospital. Ud fra vores detektionsgrænse og linearitets forsøg kan vi derfor konkluderer, at detektionsgrænsen for Capillarys 2 er ca. 2,0g/l af M-komponent, og at der er lineær sammenhæng mellem analyseresultaterne op til 56,91g/l af M-komponent. 4.6 Interferens/analytisk specificitet: Skema 5-7 viser resultaterne af interferens undersøgelsen. Analyseringen af de 5 EDTA og 5 citrat stabiliserede plasma prøver skulle vise fibrinogens indvirkning på migrationen i β2-fraktionen og dermed den visuelle vurdering. Da der ikke er opgivet en β2 fraktion for citrat prøve 3 skyldes det, at der var en M- komponent i β2-fraktionen, hvilket gjorde det umuligt at afgrænse denne. Skema 5 viser at β2 fraktionen øges med 5,2-6,4 %, hvis der analyseres på citrat stabiliseret plasma. I skema 6 kan vi se, at β2 fraktionen er øget med 5,4-8,2 %, når der analyseres på EDTA-stabiliseret plasma, i forhold til serum. Skema 5 og 6 viser også, hvorledes procenterne i den øgede β2 er taget fra. Resultaterne viser klart, at fibrinogenen i plasmaprøverne påvirker β2-fraktionen til at blive falsk forhøjet. Derfor mener jeg, at serum er prøvematerialet at foretrække, når der skal screenes for M-komponenter. Koncentrationen af CRP skulle teoretisk set også påvirke β2 fraktionen til at blive falsk forhøjet, men kigger vi på skema 7, kan vi se, at der ikke er sammenhæng mellem CRP koncentration, og andelen af β2- fraktionen. Da vi ikke har fundet noget entydigt svar på, om hvorvidt CRP har en indflydelse på β2- fraktionen, kan det skyldes, at de prøver vi har anvendt ikke har en meget forhøjet koncentration af CRP. Endvidere oplyser Lars Bendix fra Sebia, at CRP koncentrationen først vil spille ind på β2-fraktionen ved CRP koncentrationer over 375g/l. Dermed kan vi næsten udelukke, at koncentrationen af CRP vil påvirke analyseresultatet på Capillarys 2, dog bør man ved tvivl omkring M-komponenter fundet i β2-fraktionen undersøge, hvorvidt CRP koncentrationen er forhøjet eller ej. Metodevalidering af Capillarys 2 Jesper Østrup Nielsen 26
Resultaterne der opnået ved analysering på plasma prøverne understøttes af Sebias oplysninger. Sebia angiver, at β2-fraktionen kan blive falsk forhøjet pga. fibrinogen (14). Sebia angiver endvidere, at hæmolyserede prøver kan skabe en ekstra skulder i α2-fraktionen, ligeledes er det oplyst, at haptoglobin fænotypen kan have samme virkning på α2-fraktionen, dette er ikke undersøgt, men accepteres uden forsøg. Ydermere kan prøver med høje koncentrationer af lipoproteiner og triglycerid påvirke albuminfraktionen, så det kan forveksles med en person, der har bisalbuminæmi. En person med bisalbuminæmi, påvirker albumin-fraktion til at blive splittet, så der dannes to toppe (14). Derfor vurderes det at analysering for M-komponenter bør foretages på serum, da plasma prøver vil give en falsk forhøjet β2-fraktion, og at CRP koncentrationen ikke spiller noget rolle, så længe denne er under 84g/l. 4.7 Interseriel impræcision: I skema 8 ser vi resultaterne for den interserielle impræcision. Det kan ses, at det beregnede acceptinterval for hver af fraktionerne er langt mere snæver end acceptintervallerne opgivet af Sebia, som kan ses i skema 1 (16). Eksempelvis 55,2 66,2 % mod 59,8 61,5 % for albumin. Dette betyder, at vi kan sætte større krav til Capillary 2 s præcision, og dermed kan eventuelle fejl i analysen hurtig opdages og udbedres. Vi kan også ud fra CV % i skema 8 se, at den ligger langt lavere end de CV %, Sebia har opnået (Skema 1), 0,7-3,4 % mod 5,0-15,9 %. Den store forskel i CV %, kan skyldes, at Sebia også leverer kontroller til andre apparater end Capillarys 2, det omfatter bl.a. Capillarys 1 og Minicap. Det betyder, at deres kontroller skal skulle benyttes på alle deres apparater, hvilket medfører at deres acceptinterval og CV % bliver større. Sebias resultater er baseret på flere forskellige lot nr af buffer, som også påvirker acceptinterval og CV % til at blive større. Endvidere opløste vi kun kontrolmateriale efter behov. Dette medfører en højere CV %, end hvis vi havde valgt at opløse alt kontrolmaterialet ved projektets start, og derefter poolet det. CV % stiger, fordi der anvendes en pipette til at opløse kontrol materialet, og ved hver afpipettering er der en usikkerhed. Man kan derfor korrigere for denne usikkerhed ved at poole kontrolmaterialet. Herefter kunne man have nedfrosset det poolede kontrolmateriale ved -18 C i mindre mængder, så det kunne optøs efter behov. Men ved projektets start vidste vi ikke præcist, hvor meget kontrolmateriale vi skulle bruge. Ud fra resultaterne vi har opnået ved vores interserielle undersøgelse, vurderer vi, at Capillarys 2 har en acceptabel interseriel impræcision. 4.8 Intraseriel Impræcision: Skema 9 & 10 viser resultaterne af vores intraserielle impræcisions undersøgelse. Der er kun foretaget 17 analyseringer af hver prøve på grund af mangel på prøve materiale (Se Bilag 5). Udfra resultaterne i skema Metodevalidering af Capillarys 2 Jesper Østrup Nielsen 27
9 & 10 ses det, at CV %, som er et udtryk for Capillarys 2 analytiske usikkerhed, er lavere end ved analyseringen af den interserielle impræcision, 0,6-2,4 % mod 0,7-3,4 %. Der er to undtagelser hvor CV % er højere ved den intraserielle impræcision. β2 fraktionen for prøve 1 og β1 fraktionen i prøve 2. Det skyldes at middelværdien for disse 2 fraktioner (2,2 og 3,1 %) i den intraserielle impræcision, er markant lavere end for dem i den interserielle impræcision (3,7 og 2,6 %), og selv en lille spredning vil medføre, at CV % stiger hurtigt. CV % på 9,1, markeret med gult i skema 9, kan forklares med samme begrundelse. At CV % generelt er lavere for den intraserielle impræcision er forventet, da analysen er udført på en dag, hvor analyseringen af den interserielle impræcision er foregået over 14 dage. En anden faktor, er sammensætningen af komponenter i serum i forhold til kontrolmateriale. Da vi ikke præcist ved hvad kontrol materialet indeholder, kan dette også bidrage til en forskel i den analytiske usikkerhed. Men jeg mener, at man med fordel kan anvende serum prøver, da det samtidig giver et bedre billede af Capillarys 2 s reelle impræcision, end ved analysering af kontrolmateriale. Hvis vi sammenligner CV % for vores intraserielle analyse (0,6-2,4 %), med den CV % Sebia har opnået (0,4-4,0 %) (14), kan vi se, at disse resultat stemmer fint overens, dog har vi opnået en smule lavere CV %. Der er dog også enkelte steder, hvor Sebia har opnået en lavere CV %, men det skyldes igen den lavere middelværdi vi har, og dermed vokser vores CV % hurtigere ved mindre afvigelser fra middelværdien. Ud fra disse resultater vurderer vi, at Capillarys 2 har en acceptabel intraseriel impræcision. 4.9 Robusthed: Oprindeligt ville vi besvarer robustheden litterært, men da vi skulle analyserer vores sidste serum prøve, skulle der skiftes buffer lot nr. Den sidste kontrol, der er analyseret i skema 2 & 3, er analyseret med et andet buffer lot nr. Vi kan ud fra kontrollerne se, at de stadig ligger inden for Sebias acceptintervaller. Men hvis vi kigger på de opstillede acceptintervaller i skema 8, som er vores acceptintervaller omkring kontrollen, kan vi se, at den kontrol, der er analyseret på et andet buffer kit nr. flere steder ligger lige udenfor acceptintervallerne. Derfor må vi ud fra vores forsøg konstatere, at der sker en ændring, i analyse resultaterne. Hvis vi kigger på resultaterne Sebia oplyser i deres indlægsseddel, kan vi se, at der også her er en lille forskel i analyseresultaterne (14), se skema 11. Derfor bør man vurdere, hvorvidt man ved skift af buffer lot nr. skal bestemme nye acceptintervaller for kontrollen. Dette er dog ikke nødvendigt, hvis afdelingen fastlægger acceptintervallet for kontrollen, hvor der er anvendt flere buffer (minimum 2) lot numre, men da dette ikke er gældende i vores projekt, skal man fastlægge nye acceptintervaller omkring kontrollen fra Sebia ved skift af buffer lot nr. Da vi i vores interserielle undersøgelse ikke har fastlagt vores acceptinterval, hvor vi har anvendt buffere med forskellige lot nr., kan der ikke drages en entydig konklusion, dog kan vi se, at der sker en ændring i Metodevalidering af Capillarys 2 Jesper Østrup Nielsen 28
kontrol resultatet når buffer lot nr. ændres. Endvidere kan vi se ud fra Sebias resultater se (skema 11), at der sker en ændring på analyseresultatet af serumprøver, når der ændres buffer lot nr (14). 4.10 Afsmitning: Intet er oplyst fra producenterne, og pga. analysemetoden anses afsmitning som usandsynligt. 4.11 Præanalytiske forhold/holdbarhed: Der er selvfølgelig mange forskellige præanalytiske forhold, som kan have indflydelse på analyseresultatet, vi har i denne rapport valgt at fokuserer på holdbarhed. Sebia oplyser, at en serum prøve er holdbar ved 2-8 C i 10 dage og én måned ved -18 C (14). Skema 12 viser 5 analyseresultater af den friske prøve, der første gang blev analyseret på prøvetagningsdatoen (02.11.2009), og herefter analyseret ca. hver 4 dag. Den friske prøve er opbevaret ved 2-8 C mellem analyseringerne. Ud fra skema 12 kan vi se, at der ikke sker nogen markant ændring i fraktionerne, men ved den 4. analysering den 13.11.2009, var det ikke længere muligt at afgrænse de forskellige fraktioner korrekt, det samme var tilfældet den 17.11.2009, dette er illustreret på figur 12 og 13. Da der ud fra figur 12 ses, at resultatet er opdelt i de 6 fraktioner skyldes det, at opdelingen i α2 ikke er korrekt. Denne afgrænsning skulle have været mellem β2 og γ fraktionen. Sebia oplyser, at prøver der henstår ved 2-8 C, over tid, vil få en højere β1/γ-fraktion (14). Dette viser skema 12 også, da β1-fraktionen er stødt stigende over tid. Dog ses ingen systematisk ændring i γ- fraktionen. Derfor kan det konstateres, at serum prøver der henstår ved 2-8 C vil efter 8-12 dage være uanvendelige til screening af M-komponent. Dog skal der tages højde for at protein og specielt complement (C3, C4) nedbrydningen er forskellig serumprøver imellem. Skema 13 viser 2 analyseresultater fra den gamle prøve (prøvetagningsdato 05.10.2009), der er opbevaret ved -18 C, og som er analyseret første gang den 02.11.2009, dvs. lige inden holdbarhedskravet fra Sebia på 1 måned overskrides, og anden gang ca. en måned efter. Resultaterne viser, at der ikke er sket en betydelig ændring i resultaterne for serumprøven. Vi kan se at β2-fraktionen er faldet en smule fra 2,3 til 2,7g/l, men dog ikke signifikant for svar afgivelsen. Prøver, der er henstået ved -18 C i længere tid end en måned, skulle ifølge Sebia have en lavere β2-fraktion (14). Som følge af vores forsøg har vi ikke med sikkerhed kunne påvise dette, og derfor vurderer jeg, at serum prøver godt kan henstå ved -18 C i 2 måneder uden det påvirker svarafgivelsen. Ud fra resultaterne vurderer jeg derfor, at prøver der opbevaret ved 2-8 C, skal analyseres indenfor 8-12 dage, og prøver opbevaret ved -18 C kan analyseres op til 2 måneder efter prøvetagningsdatoen, uden det påvirker analysesvaret. Metodevalidering af Capillarys 2 Jesper Østrup Nielsen 29
5. Konklusion: Resultaterne vi har opnået i dette projekt viser, at man godt kan flytte P- M-komponent; arb.k.(0,1) fra den i dag anvendte gelelektroforese til kapillærelektroforese på Capillarys 2. Metodesammenligningen har vist, at Capillarys 2 kan påvise de samme M-komponenter som gelelektroforesen, og måske flere. Andre punkter undersøgt i metodevalideringen, herunder detektionsgrænse, linearitet, interferens, impræcision, og præanalytiske forhold, har alle givet acceptable resultater. Når den nødvendige erfaring er opnået af P- M-komponent; arb.k.(0,1) på Capillarys 2 s metodeansvarlige, mener jeg derfor, at man med fordel kan anvende Capillarys 2, da denne metode er klart mere tidsbesparende end gelelektroforesen. Dette gælder dog kun så længe, at analysesvaret fra Capillarys 2 afgives kvalitativt. Skal analysesvaret afgives kvantitativt, skal nye undersøgelser udføres, for at teste Capillarys 2 til dette. 6. Perspektivering: Fremtidige forsøg bør omfatte flere interferens analyser, da vi kun har udført en lille del af disse. Man kunne bl.a. undersøge, hvorledes hæmolyserede serumprøver påvirker analysesvaret. Endvidere kunne endnu en undersøgelse af Capillarys 2 s detektionsgrænse anbefales. Her bør man anvende en serum prøve med en kendt lav koncentration af M-komponent. Den lave koncentration af M- komponent medfører, at man ikke behøver fortynde prøven med store volumer buffer, som det har været tilfældet i vores forsøg. Man bør også vurdere Capillarys 2 identifikationskraft på serumprøver med stærk oligoklonal baggrund, da dette ved andre forsøg har vist sig at vanskeliggøre fundet af M-komponenter. Dette forsøg bør også omfatte serum prøver, som indeholder mere end en M-komponent. Når Capillarys 2 interserielle impræcision skal vurderes næste gang, bør man poole det kontrolmateriale man skal anvende, så man ikke får en falsk forhøjet CV %. Endvidere bør der anvendes buffere med forskellige lot nr så man undgår, at skulle fastlægge nye acceptintervaller for kontrollen, hver gang der skiftes kit eller buffer lot nr. Metodevalidering af Capillarys 2 Jesper Østrup Nielsen 30
7. Litteraturliste: 1. Bergón, Enrique. et. al; Linearity and detection limit in the measurement of serum M-protein with the capillary zone electrophoresis system Capillarys. Clinical Chemistry Lab Med 2005;43(7):721-723. (2005). 2. Bird, Jenny. et. al; Guidelines for the investigation of newly detected M-proteins and the management of Monoclonal Gammopathy of Undetermined Significance (MGUS). 3. DANAK; Validering af måleprocedurer (metodevalidering) i klinisk biokemiske laboratorier. Nr: RL 6 (2005) 4. Danske bioanalytikere; Dbio nr 11. November (2009). 5. Gimsing, Peter. et. al; M-komponenter med og uden sygdom. Månedsskrift praktiserende læger 79. årgang. (2001) 6. Grome, Margit; Analysevejledning P- M-komponent; arb. stofk. (0-1) og massek.; Udgave 1; Kinisk Biokemisk Afdeling, KB 3-01-1; Diagnostisk Center; Rigshospitalet; (2007) 7. Grome, Margit; Valideringsrapport af Capillarys 2 til P- M-komponent; arb. stofk. (0-1) og massek.; Udgave 1; Kinisk Biokemisk Afdeling, KB 3-01-1; Diagnostisk Center; Rigshospitalet; (2007) 8. Jørgensen, Mikala klok; Valideringsrapport af Capillarys 2 til P- M-komponent; arb. stofk. (0-1) og massek.; Udgave 1; Kinisk Biokemisk Afdeling, Slagelse Hospital (2009) 9. KPLL; udleveret note; Elektroforese. 10. Larsen, Conni; Analyseforskrift, P-M-komponent; arb.k.(0,1) dok nr: 10088-06, KPLL. (2009) 11. Lind, Bent; Statistik; KPLL (2008) 12. Nilsson, Lone; Hettich Rotanta 460 R Centrifuge, apparatvejledning dok nr: 20057-01 (2005) 13. Olsen, Vibeke; Apparatvejledning, ADVIA 2400. Dok nr: 20055-03. KPLL (2009). 14. Sebia; Indlægsseddel til Capillarys protein(e) 6. (2008) 15. Sebia; Phoresis instruktionsmanual Capillarys 2. 6. Udgave, Ref nr 1222, (2007) 16. Sebia; Indlægsseddel til kontrolmateriale lot nr: 19039/01, Capillarys 2. 17. Sygeplejeskolen; Sygepleje info om myelomatose 4. 18. Yang, Z. et. al; Preformance of the Sebia Capillarys 2 for Detection and Immunotyping of Serum Monoclonal Paraproteins; American Journal of clinical pathology; 2007;128:293-299. 19. http://www.denstoredanske.dk/krop,_psyke_og_sundhed/sundhedsvidenskab/blodsygdomme/mkomponent Alle eletropherogrammer er scannet fra egne resultater. Metodevalidering af Capillarys 2 Jesper Østrup Nielsen 31
8. Bilag: Bilag 1: Bilag 1 viser alle resultaterne for analyseringen af patientprøverne. M-komponent positive prøver benævnes med 1 og negative med 0. Prøver markeret med rødt er hvor prøven er fundet positiv på Capillarys 2, men negativ ved gelelektroforesen. Prøver markeret med blåt er hvor prøven er fundet positiv ved gelelektroforesen, men negativ ved analysering på Capillarys 2. Prøver markeret med gråt medtages ikke, da der ikke er opnået svar fra begge analysemetoder. Prøve Capillarys 2 Gelelektroforese 1 0 0 2 0 0 3 0 0 4 0 0 5 0 0 6 0 0 7 0 0 8 0 0 9 0 0 10 1 1 11 0 0 12 1 0 13 0 0 14 0 0 15 0 0 16 0 0 17 0 0 18 0 0 19 0 0 20 0 0 21 0 0 22 0 0 23 0 0 24 0 0 25 0 0 26 0 0 27 0 0 28 0 0 29 1 0 30 0 0 31 0 0 32 0 0 33 0 0 34 1 1 35 1 1 36 0 0 Metodevalidering af Capillarys 2 Jesper Østrup Nielsen 32
37 0 0 38 0 0 39 0 0 40 1 1 41 0 0 42 0 0 43 0 0 44 1 1 45 1 1 46 0 0 47 0 0 48 0 0 49 0 0 50 0 0 51 1 1 52 1 1 53 0 0 54 0 0 55 0 0 56 0 0 57 0 0 58 0 0 59 1 1 60 0 0 61 0 0 62 0 0 63 Intet Svar 1 64 0 0 65 0 0 66 0 0 67 1 1 68 Intet Svar 1 69 0 0 70 0 0 71 1 1 72 0 0 73 0 0 74 0 0 75 0 0 76 1 1 77 0 0 78 0 0 79 0 0 80 0 0 81 1 1 82 1 1 83 0 0 84 0 0 85 0 0 86 0 0 Metodevalidering af Capillarys 2 Jesper Østrup Nielsen 33
87 0 0 88 1 1 89 0 0 90 0 0 91 0 0 92 0 0 93 0 0 94 0 0 95 1 1 96 0 0 97 0 0 98 0 0 99 0 0 100 0 0 101 0 0 102 0 0 103 0 0 104 1 1 105 1 1 106 1 1 107 0 0 108 1 0 109 1 1 110 0 0 111 1 1 112 1 1 113 0 0 114 0 0 115 0 0 116 1 1 117 0 0 118 0 1 119 0 0 120 0 0 121 0 0 122 1 1 123 1 1 124 0 0 125 0 0 126 1 1 127 0 0 128 1 1 129 0 0 130 0 0 131 0 0 132 1 1 133 1 1 134 1 1 135 0 0 136 Intet Svar 1 Metodevalidering af Capillarys 2 Jesper Østrup Nielsen 34
137 0 0 138 0 0 139 0 0 140 0 0 141 0 0 142 0 0 143 0 0 144 0 0 145 0 0 146 0 0 147 0 0 148 0 0 149 0 0 150 0 0 Metodevalidering af Capillarys 2 Jesper Østrup Nielsen 35
Bilag 2: Bilag 2 viser de samlede resultater for linearitetsundersøgelsen. Forventet M- komponent konc Målt M- komponent Konc Prøvemateriale i μl Buffer i μl Samlet volume Fortyndings faktor Totalprotein i prøven Start 720,0 0,0 720,0 0,0 82,0 18g/l 0,5 g/l 20,0 700,0 720,0 36,0 2,3 0,5 Intet svar 1,0 g/l 40,0 680,0 720,0 18,0 4,6 1,0 Intet svar 2,0 g/l 80,0 640,0 720,0 9,0 9,1 2,0 2,0 2,5 g/l 100,0 620,0 720,0 7,2 11,4 2,5 2,4 3,0 g/l 120,0 600,0 720,0 6,0 13,7 3,0 2,9 3,5 g/l 140,0 580,0 720,0 5,1 15,9 3,5 3,4 4,0 g/l 160,0 560,0 720,0 4,5 18,2 4,0 3,9 4,5 g/l 180,0 540,0 720,0 4,0 20,5 4,5 4,4 5,0 g/l 200,0 520,0 720,0 3,6 22,8 5,0 5,0 10,0 g/l 400,0 320,0 720,0 1,8 45,6 10,0 9,9 Eksempel på beregning af volume: C 1 x V 1 = C 2 x V 2 C 1 = 18g/l V 1 = Volume prøvemateiale C 2 = Den ønskede koncentration af M-komponent. V 2 = Total volume = 720μl = 0,00072l Beregning ved C 2 = 4,5g/l: 18g/l x V 1 = 4,5g/l x 0,00072l (4,5g/l x 0,00072l) / 18g/l = 180μl prøvemateriale 720μl 180μl = 540μl buffer. Beregning af fortyndingsfaktor ved 4,5g/l: Total volume/prøvemateriale volume = 720μl/18μl = 4,0 Beregning af total protein ved 4,5g/l: Total protein i oprindelig prøve/fotyndingsfaktor = 82g/l / 4g/l = 20,5g/l Metodevalidering af Capillarys 2 Jesper Østrup Nielsen 36
Bilag 3: Bilag 3 viser resultaterne for interferens undersøgelserne. Interferens Enhed % Citratplasma Prøve Albumin A1 A2 B1 B2 Y Citrat 1 60,3 3,6 8,8 5,5 10,6 11,2 Citrat 2 59,7 4,1 9,0 5,0 9,4 12,8 Citrat 3 46,5 4,1 10,3 5,0 34,1 Citrat 4 59,4 3,9 9,1 6,2 11,5 9,9 Citrat 5 58,3 4,0 10,6 6,2 9,6 11,3 Interferens Enhed: % Serum (Citrat) Prøve Albumin A1 A2 B1 B2 Y Citrat 1 62,1 3,8 9,8 6,1 5,2 13,0 Citrat 2 60,4 4,5 9,9 5,4 3,5 16,3 Citrat 3 48,6 4,3 10,8 5,5 30,8 Citrat 4 61,7 4,2 9,8 7,2 5,1 12,0 Citrat 5 60,9 4,2 10,7 6,5 4,4 13,3 Interferens Enhed % EDTA-Plasma Prøve Albumin A1 A2 B1 B2 Y EDTA 1 50,0 5,7 12,9 6,0 13,7 11,7 EDTA 2 51,1 4,7 13,4 5,7 14,0 11,1 EDTA 3 46,1 5,7 12,2 6,3 16,5 13,2 EDTA 4 57,7 4,7 11,4 5,3 11,3 9,6 EDTA 5 56,0 4,1 10,6 6,3 11,1 11,9 Interferens Enhed % Serum (EDTA-Plasma) Prøve Albumin A1 A2 B1 B2 Y EDTA 1 54,3 5,7 13,4 6,7 5,8 14,1 EDTA 2 55,4 5,0 13,5 6,2 7,2 12,7 EDTA 3 49,8 5,8 12,4 6,7 8,3 17,0 EDTA 4 60,0 5,2 11,8 5,9 4,6 12,5 EDTA 5 59,2 4,1 10,6 6,9 5,7 13,5 Metodevalidering af Capillarys 2 Jesper Østrup Nielsen 37
Bilag 4: Bilag 4 viser resultaterne af den interserielle impræcision for hver enkelt kapillær. Enhed er i %. Beregning af CV %: SD / Middelværdi Beregning af acceptinterval: Middelværdi ± 2 x SD Interseriel impræcision Kapillær 1 Analysering Albumin α1 α2 β1 β2 γ 1 60,2 4,5 9,0 6,7 4,5 15,1 2 59,9 4,6 9,3 6,5 4,3 15,4 3 59,9 4,6 9,3 6,6 4,4 15,2 4 60,6 4,5 9,2 6,5 4,4 14,8 5 60,5 4,5 9,2 6,6 4,4 14,8 6 60,7 4,5 8,8 7,0 4,0 15,0 7 60,8 4,5 8,7 6,9 4,3 14,8 8 60,5 4,4 9,1 6,6 4,4 15,0 9 60,3 4,7 8,9 7,1 4,1 14,9 10 59,9 4,6 9,3 6,4 4,3 15,5 Middelværdi 60,3 4,5 9,1 6,7 4,3 15,1 SD 0,3 0,1 0,2 0,2 0,2 0,3 CV % 0,6 1,9 2,4 3,5 3,5 1,7 Acceptinterval 59,7-61,0 4,3-4,7 8,7-9,5 6,3-7,1 3,9-4,7 14,5-15,7 Interseriel impræcision Kapillær 2 Analysering Albumin α1 α2 β1 β2 γ 1 60,2 4,6 9,2 6,6 4,5 14,9 2 60,0 4,5 9,3 6,5 4,6 15,1 3 59,8 4,5 9,4 6,6 4,4 15,3 4 60,5 4,5 9,2 6,7 4,3 14,8 5 60,3 4,5 9,3 6,6 4,5 14,8 6 61,1 4,4 9,1 6,4 4,2 14,8 7 60,8 4,4 9,0 6,7 4,2 14,9 8 60,9 4,4 9,3 6,2 4,4 14,8 9 60,6 4,6 9,1 6,7 4,3 14,7 10 60,7 4,6 9,2 6,4 4,2 14,9 Middelværdi 60,5 4,5 9,2 6,5 4,4 14,9 SD 0,4 0,1 0,1 0,2 0,1 0,2 CV % 0,7 1,8 1,3 2,5 3,3 1,2 Acceptinterval 59,7-61,3 4,3-4,7 9,0-9,4 6,2-6,9 4,2-4,6 14,5-15,3 Interseriel impræcision Kapillær 3 Analysering Albumin α1 α2 β1 β2 γ 1 61,0 4,4 9,0 6,6 4,2 14,8 Metodevalidering af Capillarys 2 Jesper Østrup Nielsen 38
2 61,2 4,3 9,2 6,3 4,2 14,8 3 61,4 4,3 9,1 6,3 4,2 14,7 4 61,3 4,4 9,2 6,3 4,2 14,6 5 60,8 4,4 9,3 6,4 4,4 14,7 6 60,9 4,4 9,2 6,5 4,0 15,0 7 61,6 4,2 9,2 6,4 4,1 14,5 8 61,1 4,3 9,4 6,1 4,3 14,8 9 60,9 4,4 9,2 6,6 4,3 14,6 10 61,4 4,3 9,1 6,3 4,2 14,7 Middelværdi 61,2 4,3 9,2 6,4 4,2 14,7 SD 0,3 0,1 0,1 0,2 0,1 0,1 CV % 0,4 1,6 1,2 2,4 2,6 1,0 Acceptinterval 60,6-61,8 4,1-4,5 9,0-9,4 6,0-6,8 4,0-4,4 14,5 14,9 Interseriel impræcision Kapillær 4 Analysering Albumin α1 α2 β1 β2 γ 1 61,5 4,4 8,9 6,5 4,4 14,3 2 60,4 4,5 9,3 6,3 4,6 14,9 3 61,4 4,3 9,0 6,3 4,3 14,7 4 60,7 4,4 9,2 6,6 4,5 14,6 5 61,4 4,7 9,0 6,4 4,4 14,1 6 61,6 4,4 9,0 6,5 4,2 14,3 7 62,3 4,4 8,9 6,3 4,0 14,1 8 61,3 4,4 9,2 6,3 4,3 14,5 9 60,8 4,5 9,3 6,6 4,1 14,7 10 61,4 4,4 9,2 6,1 4,1 14,8 Middelværdi 61,3 4,4 9,1 6,4 4,3 14,5 SD 0,5 0,1 0,2 0,2 0,2 0,3 CV % 0,9 2,4 1,7 2,5 4,5 2,0 Acceptinterval 60,3-62,3 4,2-4,6 8,7-9,5 6,0-6,8 3,9-4,7 13,9-15,1 Interseriel impræcision Kapillær 5 Analysering Albumin α1 α2 β1 β2 γ 1 61,1 4,3 9,0 6,6 4,3 14,7 2 60,4 4,3 9,3 6,3 4,6 15,1 3 60,8 4,5 9,4 6,2 4,1 15,0 4 61,4 4,3 9,2 6,2 4,2 14,7 5 62,0 4,2 9,2 6,2 4,1 14,3 6 61,2 4,4 9,2 6,4 3,9 14,9 7 61,7 4,3 8,7 6,6 4,1 14,6 8 61,2 4,3 9,2 6,3 4,2 14,8 9 62,0 4,3 8,8 6,6 4,0 14,3 10 61,0 4,5 9,2 6,2 4,1 15,0 Middelværdi 61,3 4,3 9,1 6,4 4,2 14,7 SD 0,5 0,1 0,2 0,2 0,2 0,3 CV % 0,8 2,2 2,4 2,8 4,6 1,9 Acceptinterval 60,3-62,3 4,1-4,5 8,7-9,5 6,0-6,8 3,8-4,6 14,1-15,3 Metodevalidering af Capillarys 2 Jesper Østrup Nielsen 39
Interseriel impræcision Kapillær 6 Analysering Albumin α1 α2 β1 β2 γ 1 60,6 4,4 9,0 6,8 4,2 15,0 2 59,4 4,6 9,4 6,7 4,4 15,5 3 59,7 4,6 9,5 6,5 4,2 15,5 4 59,4 4,7 9,6 6,5 4,6 15,2 5 60,3 4,5 9,1 6,9 4,2 15,0 6 60,2 4,4 9,4 6,5 4,2 15,3 7 60,6 4,4 8,9 6,7 4,4 15,0 8 60,3 4,4 9,7 6,2 4,4 15,0 9 60,5 4,5 8,9 6,9 4,1 15,1 10 60,0 4,6 9,2 6,7 4,1 15,4 Middelværdi 60,1 4,5 9,3 6,6 4,3 15,2 SD 0,5 0,1 0,3 0,2 0,2 0,2 CV % 0,8 2,4 3,1 3,3 3,8 1,4 Acceptinterval 59,1-61,1 4,3-4,7 8,7-9,9 6,2-7,0 3,9-4,7 14,8-15,6 Interseriel impræcision Kapillær 7 Analysering Albumin α1 α2 β1 β2 γ 1 61,1 4,3 9,2 6,4 4,5 14,5 2 60,4 4,5 9,3 6,4 4,3 15,1 3 61,3 4,3 9,0 6,4 4,3 14,7 4 61,0 4,5 9,1 6,4 4,2 14,8 5 61,0 4,5 8,9 6,6 4,4 14,6 6 60,9 4,3 9,3 6,4 4,3 14,8 7 60,8 4,4 9,2 6,5 4,2 14,9 8 61,2 4,3 9,1 6,3 4,4 14,7 9 60,7 4,5 9,4 6,4 4,3 14,7 10 61,1 4,3 9,0 6,4 4,3 14,9 Middelværdi 61,0 4,4 9,2 6,4 4,3 14,8 SD 0,3 0,1 0,2 0,1 0,1 0,2 CV % 0,4 2,3 1,7 1,2 2,1 1,2 Acceptinterval 60,4-61,6 4,2-4,6 8,8-9,6 6,2-6,6 4,1-4,5 14,4-15,2 Interseriel impræcision Kapillær 8 Analysering Albumin α1 α2 β1 β2 γ 1 59,6 4,6 9,4 6,6 4,6 15,2 2 58,8 4,7 9,9 6,5 4,5 15,6 3 59,5 4,7 9,5 6,6 4,2 15,5 4 58,5 4,9 10,0 6,4 4,7 15,5 5 59,7 4,5 9,6 6,5 4,8 14,9 6 60,8 4,5 9,2 6,3 4,4 14,8 7 60,2 4,6 9,3 6,5 4,2 15,2 8 60,0 4,4 9,7 6,3 4,3 15,3 9 59,2 4,7 9,5 6,7 4,5 15,4 Metodevalidering af Capillarys 2 Jesper Østrup Nielsen 40
10 59,1 4,7 9,6 6,8 4,2 15,6 Middelværdi 59,5 4,6 9,6 6,5 4,4 15,3 SD 0,7 0,1 0,2 0,2 0,2 0,3 CV % 1,1 3,1 2,6 2,5 4,9 1,8 Acceptinterval 58,1-60,9 4,4-4,8 9,2 10,0 6,1-6,9 4,0-4,8 14,7-15,9 Metodevalidering af Capillarys 2 Jesper Østrup Nielsen 41
Bilag 5: Bilag 5 viser alle resultaterne for prøve 1 & 2 anvendt til den intraserielle impræcision. Enheden er %. Intraseriel impræcision Prøve 1 Analysering Albumin α1 α2 β1 β2 γ 1 41,8 7,2 13,6 5,6 2,5 29,3 2 41,2 7,4 13,9 5,7 2,2 29,6 3 41,1 7,3 14,0 5,6 2,0 30,0 4 41,5 7,3 13,8 5,6 2,1 29,7 5 41,1 7,2 13,8 5,7 2,1 30,1 6 41,4 7,3 14,0 5,6 2,0 29,7 7 41,1 7,3 13,9 5,6 2,4 29,7 8 40,8 7,3 13,9 5,8 2,1 30,1 9 40,9 7,3 14,2 5,6 2,0 30,0 10 41,6 7,2 14,0 5,5 1,9 29,8 11 41,1 7,3 14,1 5,7 1,9 29,9 12 41,1 7,3 14,2 5,6 2,3 29,5 13 41,4 7,2 14,0 5,6 2,0 29,8 14 40,9 7,3 14,0 5,8 2,2 29,8 15 41,2 7,4 14,0 5,6 2,2 29,6 16 41,2 7,1 14,1 5,5 2,4 29,7 17 41,4 7,2 13,8 5,6 2,5 29,5 Middel 41,2 7,3 14,0 5,6 2,2 29,8 SD 0,3 0,1 0,2 0,1 0,2 0,2 CV % 0,6 1,1 1,1 1,5 9,1 0,7 Intraseriel impræcision Prøve 2 Analysering Albumin α1 α2 β1 β2 γ 1 40,6 5,0 7,5 3,2 4,9 38,8 2 39,8 5,3 7,8 3,2 5,2 38,7 3 40,5 5,0 7,6 3,0 5,1 38,8 4 40,8 5,1 7,4 3,0 5,0 38,7 5 40,6 5,2 7,7 3,1 4,9 38,5 6 40,4 5,1 7,6 3,2 4,8 38,9 7 40,5 5,2 7,7 3,1 4,9 38,6 8 40,4 5,1 7,7 3,2 4,9 38,7 9 40,3 5,1 7,7 3,1 5,0 38,8 10 40,2 5,3 7,8 3,1 5,2 38,4 11 40,8 5,1 7,8 3,0 4,8 38,5 12 40,7 5,1 7,7 3,2 4,9 38,4 13 40,7 5,3 7,7 3,0 4,9 38,4 14 40,3 5,1 7,7 3,2 5,0 38,7 15 40,3 5,4 7,8 3,1 5,0 38,4 16 40,6 5,2 7,7 3,1 4,9 38,5 17 40,2 5,3 7,6 3,3 4,9 38,7 Middel 40,5 5,2 7,7 3,1 5,0 38,6 SD 0,3 0,1 0,1 0,1 0,1 0,2 CV % 0,6 2,2 1,4 2,9 2,4 0,4 Metodevalidering af Capillarys 2 Jesper Østrup Nielsen 42