KvægInfo nr.: 359 Dato: 7-8- Forfatter: Christine M. Røntved Af Christine m. Røntved, Jens Bech Andersen, Lotte Nielsen, Klaus lønne Ingvartsen Afd. for Husdyrsundhed og Velfærd, Drøvtyggere Danmarks JordbrugsForskning e-mail:christinem.rontved@agrsci.dk Foderets energikoncentration og malkningsfrekvensens effekt på malkekøers betændelsesrespons i tidlig laktation Modsat det forventede resulterede foder med en høj energikoncentration i en stigning i flere betændelsesmål i forhold til foder med en lav energikoncentration. Malknings-frekvens havde derimod ingen effekt. Køer i tidlig laktation har en høj risiko for udvikle en alvorlig E. coli mastitis sammenholdt med køer i midt- og senlaktation. Dette skyldes bl.a., at koen er mere modtagelig overfor infektioner i denne periode, men også at koens betændelsesrespons overfor bakterier er forøget i ugerne omkring kælvning. I tidlig laktation er koens energioptagelse utilstrækkelig til dækning af vedligehold og mælkeydelse. Koen mobiliserer derfor energi fra sine kropsreserver, hvilket medfører store vægttab. Fra forskning i human sundhed ved man, at sult og store vægttab medfører et forøget betændelsesrespons. Foderoptagelse og -sammensætning samt mælkeydelse kan derfor tænkes at påvirke koens betændelsesrespons. I nærværende artikel beskrives et kombineret fodrings- og malkningsforsøg med malkekøer i tidlig laktation, hvor effekten af foderets energikoncentration (høj versus lav) og malkningsfrekvens ( versus 3) på køernes betændelsesrespons blev undersøgt. De delvist overraskende resultater viser, hvor komplekst det kan være at tolke immunologiske data i relation til sundhed og understreger behovet for mere basal viden på dette område. Introduktion Malkekøer i tidlig laktation har en høj risiko for at udvikle alvorlige E. coli yverbetændelser sammenholdt med malkekøer i midt- og senlaktation. Undersøgelser af koens immunsystem har vist, at niveauet af adskillige immunkomponenter og aktiviteten af flere immunfunktioner er ændret i tiden omkring kælvning. Ændringerne i de immunologiske parametre formodes dels at bidrage til en øget modtagelighed overfor infektioner, som følge af nedsatte immunfunktioner, dels at øge sværhedsgraden af sygdomme som følge af et øget betændelsesrespons ved eksempelvis yver- og børinfektioner. I tidlig laktation er højtydende malkekøer i negativ energibalance. Indtagelsen af energi dækker ikke deres behov til vedligehold samt mælkeproduktion, de tærer på kropsreserverne og taber i vægt. Fra forsøg udført med mennesker og mus ved man at sult og store vægttab medfører et markant forøget betændelsesrespons. Ved indgivelse af E. coli endotoksin (lipopolysaccharid (LPS)) i fastede mus ses en øget følsomhed overfor LPS i form af et voldsomt betændelsesrespons samt højere dødelighed end ikke fastede mus. Det er derfor sandsynligt at foderoptagelse og -sammensætning samt mælkeydelse indirekte påvirker koens betændelsesrespons. Endvidere kan koens mælkeproduktion øges ved et stigende antal daglige malkninger uden en øget foderoptagelse. Køer, der malkes 3 gange dagligt, tærer derfor ofte mere på kropsreserverne end køer, der malkes gange dagligt. Nedenstående beskriver et kombineret fodrings- og malkningsforsøg udført på malkekøer i tidlig laktation. Effekten af foderets energikoncentration og malkningsfrekvens på immunologiske parametre af betydning for koens betændelsesrespons blev undersøgt. Forsøgsdesign og -behandlinger Forsøgsdesign Et x faktorielt design blev benyttet. Den ene faktor var energikoncentration i foderet efter kælvning, hvor der anvendtes en foderration med et lavt energiindhold (L: 5% kraftfoder) samt et foder med et højt energiindhold (H: 75% kraftfoder). Den anden faktor var malknings-frekvens, hvor køerne blev udsat for eller 3 gange daglige malkninger. Dette resulterede i forskellige behandlinger: L, L3, H og H3.
Foder Foderration H havde et 3% højere nettoenergiindhold end foderration L (se tabel appendiks). Forskellen i foderrationerne blev opnået ved at erstattet valset byg og roe pulpetter, med byghelsædsensilage. Dette resulterede i en stor forskel i indholdet af NDF, stivelse, og LHK i de to rationer. Ellers var de to foderrationer baseret på de samme ingredienser, og indeholdt lige store mængder af protein, fedt og mineraler optimeret ifølge de danske normer til malkekøer. Malkekøer SDM køer blev opdelt i hold på basis af deres forventede kælvningsdato, laktationsnummer og vægt, og fordelt tilfældigt på de behandlinger. Køerne blev opstaldet i bindestald og goldet 8 uger før forventet kælvning. I goldperioden fik alle køer tildelt foderration L. Efter kælvning fortsatte halvdelen af køerne på ration L, den anden halvdel fik ration H. Fodring foregik individuelt, og efter ædelyst. Tre dage efter kælvning blev vs. 3 daglige malkninger påbegyndt. Fra uge 9 efter kælvning til forsøgets afslutning i uge 6 blev alle køer igen malket gange dagligt (markeret med lodret stiplet linie på figurerne). Dyrlægebesøg og - behandling af køerne blev registreret. Immunologiske målinger Blodprøver blev udtaget en gang ugentligt i uge 3 og før kælvning samt uge, 3, 5, 9 samt 3 efter kælvning. Blodprøverne blev analyseret for deres totale antal af hvide blodlegemer (leukocytter) samt antallet af celler i undergrupper af leukocytter (neutrofile og eosinofile granulocytter, monocytter (herunder CD positive monocytter) og lymfocytter). Derudover blev blodet analyseret for dets indhold af to immunologiske parametre benævnt serum amyloid A (SAA) samt tumor nekrose faktor alfa (TNF-α) ex vivo. Hvor blod fra en syg ko kan indeholde meget TNF-α, er blodniveauet af TNF-α i en sund og rask ko så lavt, at vores analysemetoder ikke kan måle det direkte i blodet (in vivo). For at måle koens evne til at producere TNF-α tages en blodprøve, som så stimuleres med E. coli LPS i laboratoriet, hvorefter leukocytterne udskiller TNF-α i blodprøven (ex vivo). De immunologiske parametres funktion - Neutrofile og monocytter er centrale i bekæmpelsen af bakterier. F.eks. forekommer de i meget i store mængder i yveret, når dette er inficeret med bakterier, og udgør langt størstedelen af pusset (betændelsesklumperne) i mælken. Af samme grund har vi valgt at kalde disse to cellepopulationer for betændelsesceller i det efterfølgende. - CD sidder på overfladen af betændelses-cellerne og gør, at cellerne er i stand til at genkende og reagere på bakterier, når de trænger ind i kroppen. CD er også kendt som endotoksin-receptoren, fordi den binder sig til endotoksin fra gram-negative bakterier som eksempelvis E. coli. - TNF-α er det man kalder et proinflammatorisk cytokin. Proinflammation kan oversættes til igangsætter af betændelse. Cytokiner opfattes som immunsystemets hormoner, og er de stoffer som immunsystemet celler producerer, når de skal kommunikere med hinanden. - SAA er et akut fase protein, der produceres i leveren, når koen udsættes for infektion og vævsbeskadigelse. SAA binder sig til endotoksin, og formodes at hjælpe til med inaktivering af dette toksin. I modsætning til TNF-α, som forekommer i lav koncentration og kortvarigt i blodbanen (få timer), så er høje koncentrationer af SAA tilstede i blodet i flere dage. SAA har derfor et stort potentiale som betændelsesmarkør. TNF-α frigives fra betændelsescellerne, når CD og andre cellereceptorer kommer i kontakt med cellevægsdele fra bakterierne. Når TNF-α produceres lokalt af betændelsesceller, fortæller det cellerne i det omgivende væv, at der er fare på færde. Sammen med en række andre vigtige stoffer tiltrækker TNF-α flere betændelsesceller fra blodet (og knoglemarven) til stedet og gør cellerne mere aktive i deres bekæmpelse af bakterierne. Hvis TNF-α (og andre proinflammatoriske cytokiner) produceres i store mængder, føres de med blodet til hjernen og leveren, hvor de igangsætter et akut fase respons. I hjernen resulterer TNF-α i feber, og er derfor også kendt som et af kroppens egne feberfremkaldende stoffer. I leveren stimulerer cytokinerne levercellernes produktion af immunproteiner, herunder SAA. TNF-α spiller således en central rolle i aktiveringen af immun-systemet. Høje koncentrationer af TNF-α resulterer desværre i alvorlige bivirkninger som fald i blodtrykket og nedsat vævsperfusion, dannelse af talrige små blodpropper, og svære stofskifteforandringer, som kan udvikle sig til kredsløbskollaps og død. Ekstremt høje TNF-α niveauer ses bl.a. hos malkekøer med en akut E. coli mastitis i tidlig laktation, og formodes her at være årsag til dyrets død.
Resultater Energioptagelse, mælkeydelse og kropsvægt (se tabel i appendiks) Køer tilbudt foderration H havde en 3% højere nettoenergioptagelse, samt en 5% højere mælkeydelse end køer fodret med ration L. Køer malket 3 gange om dagen (L3 og H3) havde en 8% højere mælkeydelse en køer malket gange dagligt (L og H) uden en tilsvarende signifikant stigning i køernes foderoptagelse. Som forventet havde foderet og malkningsfrekvensen en markant effekt på mobiliseringen af energi fra koens kropsdepoter. Køer fodret med ration L og malket 3 gange dagligt havde et vægttab på 7 kg i de første 8 uger, hvilket var 9-35% mere end køerne i de øvrige grupper. Sygdomsregistrering (se tabel 3 i appendiks) To køer gik ud af forsøget undervejs som følge af mælkefeber: en ko (fra L3) døde en anden ko (fra H) var syg i en længere periode. Ellers var der en lige høj forekomst af mælkefeber i de behandlingsgrupper. Ketose blev observeret hos dyr i gruppe H og H3. Forekomsten af behandlede infektiøse sygdomme (børbetændelse og yverbetændelse) i de første 8 uger var tilnærmelsesvis lige høj hos køer på foderration L (5/9), som køer på foderrationen H (/9) samt hos køer malket (/9) og 3 gange dagligt (5/9). I uge 9-6 efter kælvning var der en tendens til mere mastitis hos køer malket gange dagligt (7/9) end gruppen af køer, der tidligere blev malket 3 gange dagligt (/9). Immunparametre Som forventet, så ændrede niveauet af de immunologiske parametre sig betydelig i ugerne tæt ved kælvning i (Figur -). I blodet steg antallet af leukocytter, herunder neutrofile granulocytter samt monocytter signifikant i denne periode (Figur ), hvorimod antallet af lymfocytter og eosinofile faldt (ikke vist). Disse fund er velkendte, og beskrevet i litteraturen. Antallet af CD positive monocytter (Figur ), samt antallet af CD molekyler på den enkelte celle (ikke vist) var ligeledes højest i ugerne tæt på kælvning. Endelig var køernes evne til at producere TNF-α ved stimuli med E. coli LPS ex vivo markant forøget i ugerne tæt ved kælvning, specielt ved brug af en høj dosis af LPS (Figur 3). Koncentrationen af SAA steg derimod først signifikant efter kælvning, og forblev højere en koncentrationerne målt før kælvning i de efterfølgende 9 uger (Figur ). Foderration H viste sig at have en markant effekt på blodbilledet, da køer på denne ration havde et signifikant højere indhold af blodleukocytter, som primært skyldes en stigning i antallet af neutrofile og monocytter (betændelsesceller) (Figur a). Derimod havde H-rationen ingen effekt på antallet af lymfocytter (ikke vist). Køer på foderration H havde også et signifikant større antal af monocytter, der var positive for CD receptoren end køer på foderration L (Figur a). Derimod var der ingen statistisk forskel på TNF-α responset på køer for de to foderrationer (Figur 3a). Endelig var der en signifikant højere blodkoncentration af SAA i køer på foderration H i forhold til køer på foderration L (Figur a). I modsætning til energikoncentrationen i foderet, så havde malkningsfrekvensen ingen effekt på de immunologiske parametre (Figur b-b). Diskussion Høj energikoncentration påvirker immunparametre Forsøget viser, at et foder med en høj energikoncentration (foderration H) øger niveauet af nogle af de immunparametre, der indgår i koens betændelsesrespons. Som tidligere nævnt er et meget højt TNF-α respons uønsket, derimod ved vi ikke om stigninger i de øvrige immunologiske parametre er til gavn eller skade for malkekøer i tidlig laktation, og om de ændringer vi kan registrere er biologisk relevante? Men hvad er årsagen til de signifikante stigninger i betændelsesceller og betændelses-markøren SAA hos køer fodret med ration H? Mulige årsager til et forøget betændelsesrespons - Infektioner: En forklaring kunne være, at køerne på ration H havde flere infektioner end køerne på ration L. Sygdoms-registreringer viste dog, at der var et lige stort antal kliniske infektioner blandt køerne på de to rationer, så derfor måtte der i så fald være tale om subkliniske infektioner. Endvidere blev der observeret forholdsvis lige mange infektioner hos køer malket og 3 gange dagligt i de første 8 uger, men mere mastitis hos køer malket gange dagligt end køer malket 3 gange i uge 9-6, hvilket afspejlede sig svagt i nogle af i de immunologiske parametre. - Høj mælkeydelse: Fra større udenlandske studier ved man, at køer med en høj mælkeydelse har et større antal betændelsesceller i blodet end køer med en moderat mælkeydelse. Dette skyldes formentlig en større
rekruttering af blod leukocytter til yveret /mælken. Den 5% større mælkeydelse, der blev målt hos køer foderet med ration H kan derfor godt tænkes at bidrage til et større antal betændelsesceller i blodet hos disse køer. - Syredannende foder: Ration H er et mere syredannende foder end ration L. Hvorvidt det kan have haft nogen indflydelse på forekomsten af subkliniske acidose, herunder en evt. optagelse af bakterielle komponenter fra vommen med efterfølgende virkning på koens immunsystem vides ikke. - Ændrede hormon- og metabolit-koncentrationer i blodet: Endelig har forsøg med hormoner (væksthormon, IGF-, insulin) vist, at de kan påvirke dannelsen af leukocytter i knoglemarven samt leukocytternes aktivitet. Metabolitterne har stor betydning for den enkelte celles stofskifte, og formodes derfor at påvirke celleaktiviteten. Da det tidligere er vist, at niveauet af IGF-, insulin og glukose var højere hos køer på foderration H end køer på foderration L (Andersen et al., ), er det muligt at foderration H via disse ændrede hormon- og metabolit-koncentrationer indirekte medvirkede til en større produktion og frigivelse af leukocytter fra knoglemarven. Immunologiske parametre er komplekse Set fra et immunologisk synspunkt er det ikke muligt at konkludere om køer på foderration H var bedre eller dårligere stillet end køer på foderration L. På trods af, at 3 daglige malkninger førte til en 8% højere mælkeydelse end daglige malkninger, så havde malkningsfrekvens ingen effekt på de immunologiske parametre. Dette tyder på, at ydelsesforskellen ved behandlingen var for lille til at have en biologisk effekt i modsætning til den 5% store ydelsesforskel ved fodring med høj vs. lav energi-koncentration. For at man kan udtale sig om, hvorvidt og i hvilket niveau en immunologisk parameter er til gavn/skade for koens sundhed, er det vigtigt, at den relateres til sygdomsforekomst og -grad. I dette forsøg er sygdomsforekomsten (dyrlægebesøg), men ikke sygdomsgraden blevet registreret. Umiddelbart, resulterede foderkoncentration og malkningsfrekvens ikke i forskelle i antallet af klinisk registrerede infektioner (i uge -8 efter kælvning); men med det meget lave antal af dyr i opgørelsen (dårlig statisk power), skal man være varsom med tolkning af data. På basis af de fremkomne resultater, kan der ikke gives nogle klare eller nye anbefalinger med hensyn til foderkoncentration og malkningsfrekvens. Forsøget illustrerer derimod, hvor komplekst, det er at måle og tolke immunologiske parametre hos malkekøer. Af samme grund er det vigtigt, at der bliver forsket i de grundlæggende immunologiske komponenter og mekanismer. Dels står vi overfor en stor opgave i at finde ud af hvilke immunologiske parametre, der kan relateres til sygdoms-modtagelighed og -respons. Dels ligger der et stort arbejde i at forstå, hvordan fodring, management, stress og arvbarhed påvirker de immunologiske parametre. Figurer Immunologisk Foderration Malkningsfrekvens parameter L (stiplet) vs. H (linie) (stiplet) vs. 3 (linie) per dag (a) (b) Figur Det totale antal af: - leukocytter - neutrofile - monocytter Millioner celler/ml blod 8 6 P=. P=. P=.7 Millioner celler/ml blod 8 6 NS, NS, NS
Figur Det totale antal af CDpositive monocytter Figur 3 TNF-α respons ex vivo ved stimuli af fuldblod med E.coli endotoksin - høj dosis - lav dosis millioner CD+ celler/ml blod TNF-α, ng/ml.8 P=.3.6.. 7 NS, NS 6 5 3 millioner CD+ celler/ml blod TNF-α, ng/ml.8 NS.6.. 7 NS, NS 6 5 3 Figur Koncentrationen af SAA i blod SAA, ln ng/ml 5 3 P<. SAA, ln ng/ml 5 3 NS Yderligere information vedrørende forsøget: Jens Bech Andersen, Nicolas Friggens, Torben Larsen & Klaus Lønne Ingvartsen. Effekten af energikoncentration i foderet og malkningsfrekvens hos malkekøer i tidlig laktation: Foderoptagelse, mælkeproduktion og mobilisering. DJF rapport, Husdyrbrug nr.,. Andersen, J. B., Larsen, T., Nielsen, M. O., and Ingvartsen, K. L.. Effect of energy density in the diet and milking frequency on hepatic long chain fatty acid oxidation in early lactating dairy cows. J. Vet. Med. A. Physiol. Pathol. Clin. Med. 9:77-83. C. M. Røntved, J. B. Andersen, L. Nielsen, J. Dernfalk and K. L. Ingvartsen Effects of Diet Energy Density and Milking Frequency in early laction on Tumor Necrosis-alpha Responsiveness in Dairy Cows. (Submitted til Veterinary Immunology and Immunopathology, april ). Andersen, J. B., Friggens, N. C., Sejrsen, K., Sorensen, M. T., Munksgaard, L., and Ingvartsen, K. L. 3. The effects of low vs. high concentrate level in the diet on performance in cows milked two or three times daily in early lactation. Livest. Prod. Sci. 8:9-8. Andersen, J. B., Friggens, N. C., Larsen, T., Vestergaard, M., and Ingvartsen, K. L.. Effect of energy density in the diet and milking frequency on plasma metabolites and hormones in early lactating dairy cows (Accepteret i J. Vet. Med. A. Physiol. Pathol. Clin. Med). KvægInfo nr.: 359 Dansk Kvæg
KvægInfo nr.: 359 tabeller Dato: 7-8- Forfatter: Christine M. Røntved et al. Foderets energikoncentration og malkningsfrekvens effekt på malkekøers betændelsesrespons i tidlig laktation tabeller til kvæginfo 359 Tabel Den kemiske sammensætning af foderration L og H samt beregnet energi indhold i disse (mean ± SD af foderprøver (n = 5)). Tilpasset fra Andersen et al. (3). Kemisk sammensætning Foderration L Foderration H Indhold (i % af tørstof) Råfedt 5, ±, 5, ±, NDF 35, ±,5,6 ±,6 Træstof 9,7 ±,3, ±, Sukker 5,7 ±, 6, ±, LHK 3, ±, 3,7 ±, Stivelse 7,8 ±, 6,7 ±, Råprotein 8,8 ±,6 9, ±, Ca (g/kg),8±,5,9±,3 P (g/kg) 3,9±, 3,9±, Mg (g/kg),7±,,9±, Fordøjelig energi (MJ/ kg ts) 3, ±,,8 ±, Nettoenergi (FE / kg ts),86 ±,,6 ±. Estimeret stivelsesindhold = LHK - sukker. FE = 789 KJ nettoenergi/kg ts = -,369 +,989 x fordøjelig energi (MJ/kg ts),37 x træstof (kg/kg ts)
Tabel Effekten af foderrationens energikoncentration (lav vs. høj) og malkningsfrekvens (x vs. 3x) på foderoptagelse, mælkeproduktion, kropsvægt og huld de første 8 uger af laktationen. Forsøgsbehandlinger 3 Model P-værdi L L3 H H3 S.E. F M FxM Antal af køer 9 9 Foderoptagelse Tørstof, kg/dag 5,7 6,8 6,9 7,5,7,6,8,99 Nettoenergi, FE/dag 3,5, 7,9 8,5,7 <,,8,88 Mælkeproduktion Mælk, kg/dag 3, 36, 39,,,5 <,,3,5 Energikorr. mælk, kg/dag 33, 36,9 38,,7, <,,6,99 Fedt, %,8,5 3,83,3,6 <,,,5 Protein, % 3, 3,7 3,3 3,7,6 <,,79,97 Laktose, %,73,7,83,86,,3,66,86 Kropsvægt og huld Vægt ved kælvning, kg 655 663 6 68 8,9,3,3 Vægt, uge to 8, kg -5 a -7 c -53 a -59 b, <, <, Huld ved kælvning 3, 3,5 3,3 3,5,,68,68,36 Huld, uge til 8 -, a -, b -, bc -, c,3,5, <, F = foderration. M = malkningsfrekvens. 3 De små bogstaver indenfor række viser signifikante forskelle (P <,5), hvor der er en signifikant vekselvirkning, FxM. Tabellen er oversat til dansk fra Andersen et al. (3).
Tabel 3 Metaboliske og infektiøse lidelser registreret hos malkekøer på en foderration med en lav (L) eller høj (H) energikoncentration og udsat for eller 3 daglige malkninger i tidlig laktation. Forsøgsbehandlinger L L3 H H3 Antal af køer 9 9 Metaboliske lidelser Mælkefeber (uge -8 efter kælvning) 3 Ketose (uge -8 efter kælvning) Infektiøse lidelser Børbetændelse/tilbageholdt efterbyrd (uge -8 efter kælvning) Yverbetændelse (uge -8 efter kælvning) 3 Yverbetændelse (uge 9-6 efter kælvning) 3 KvægInfo nr.: 359 tabeller Dansk Kvæg