DX CT/NG/MG ASSAY 1 x Direkte detektering af Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae og Mycoplasma genitalium ved hjælp af realtids-pcr

Transkript

1 DX CT/NG/MG ASSAY 1 x Direkte detektering af Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae og Mycoplasma genitalium ved hjælp af realtids-pcr * /12 1- FORMÅL Dx CT/NG/MG Assay er et kvalitativt testkit til in vitro-amplifikation af multiplekse nukleinsyrer, der åbner mulighed for direkte detektering i et enkelt rør af Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae og Mycoplasma genitalium i kliniske prøver fra symptomatiske og asymptomatiske personer. Dx CT/NG/MG Assay er beregnet til brug med klinikerindsamlede endocervikale, vaginale og anorektale (fra mænd og kvinder) podepindsprøver 1, patientindsamlede vaginale podepindsprøver 1 samt urinprøver fra mænd og kvinder. 1 Indsamlet med Dx Collection System 50-F-kit (Bio-Rad kat. # 37012), Dx Collection System-F50-kit (Bio-Rad kat. # 37007), eller ESwab (COPAN kat. # 480 CE). 2. SAMMENDRAG OG FORKLARING AF TESTEN Chlamydia trachomatis er en obligat intracellulær parasitisk bakterie, som er årsag til de mest almindelige seksuelt overførte infektioner i industrialiserede lande med omkring 89 millioner nye tilfælde hvert år ifølge WHO (1). Chlamydia trachomatisinfektioner er ofte asymptomatiske både hos kvinder og mænd og kan, hvis de ikke behandles, medføre alvorlige kliniske følger, som pelvis inflammatorisk sygdom (PID), ektopisk graviditet, tubar infertilitet (2) hos kvinder eller urethritis, som ikke skyldes gonokker, og epididymitis hos mænd (3). Molekylære diagnosetest, som har en bedre følsomhed og specificitet end andre eksisterende teknologier, anbefales nu kraftigt til detektion af Chlamydia trachomatis-infektioner (4). Neisseria gonorrhoeae er en ikke-motil gram- diplokokbakterie, som forårsager cirka 62 millioner nye tilfælde af gonoré hvert år i verden (1). Kliniske følger er de samme som ved Chlamydia trachomatis med ofte sværere symptomer. Celledyrkning, der er almindeligt brugt til detektion af N. gonorrhoeae, afhænger i høj grad af korrekt prøvehåndtering og bakteriernes levedygtighed i prøverne. Molekylære diagnosetest kan derfor med fordel kombineres med konventionelle teknikker til detektion af N. gonorrhoeae. Mycoplasma genitalium er en lille bakterie, som for nylig er blevet detekteret som et hyppigt forårsagende middel ved urethritis hos mænd samt ved infektioner hos kvinder i den nedre genitalkanal med symptomer og mikroskopiske fund, der svarer til Chlamydia trachomatis. M. genitalium-infektioner mistænkes også for at være årsag til tubar infertilitet hos kvinder (5-13). Molekylære diagnosetest er den metode, der vælges til detektion af Mycoplasma genitalium, da dyrkning af denne er meget vanskelig at udføre. 3. PROCEDUREPRINCIPPER Dx CT/NG/MG Assay omfatter to hovedtrin: prøveklargøring og amplifikation/detektering af mål-dna med realtids-pcr. Amplifikationsprodukterne detekteres ved hjælp af fluorescerende farvestoffer under PCR. Med hver prøve ekstraheres, amplificeres og detekteres systematisk en intern kontrol på samme måde som mål-dna et, hvilket åbner mulighed for kontrol af ekstraktionsproceduren og detektion af potentiel PCR-inhibering. Kittet indeholder alle nødvendige reagenser til udførelse af både prøveklargøring og amplifikation/detektion til 96 test. Prøveklargøring DNA-ekstraktion udføres på alle prøvetyper, der er anført i kapitlet "Indsamling og håndtering af prøvemateriale", ved hjælp af lysis-bufferen (1), der følger med kittet (Bio-Rad Chelex -metoden). Der tages en kontrol med under hele prøveklargøringsproceduren sammen med prøverne. Den interne kontrol (C1) tilsættes til hver prøve og til den den e kontrol ved starten på prøveklargøringen. Realtids-PCR-amplifikation/detektion Ved realtids-pcr bruges specikke fluorescerende oligonukleotidprober til detektion af DNAet under amplifikation ved hjælp af hybridisering til amplikonerne. I Dx CT/NG/MG Assay bruges fire forskellige oligonukleotidprober: C. trachomatis-probe, der er målrettet mod det kryptiske plasmid. Denne målsekvens ligger uden for området, der er deleteret i den ny variantstamme af C. trachomatis (nvct), der er karakteriseret for nylig (14). N. gonorrhoeae-probe, der er målrettet mod en sekvens i pile-genet. M. genitalium-probe, der er målrettet mod en sekvens i MgPa-genet. Intern kontroldetektionsprobe 1

2 Hvis der ikke er mål-dna til stede for en given oligonukleotidprobe, udsendes ingen tilhørende fluorescens, og der detekteres dermed ikke noget signal. Hvis mål-dnaet er til stede, øges fluorescensintensiteten, efterhånden som mængden af amplikoner øges for hver amplifikationsrunde. Under hver PCR-cyklus, på annealingstrinet, måler det optiske modul i Dx Real-Time System fluorescensen, der udsendes fra hver fluorofor, og den tilhørende Dx Real-Time Software afbilder fluorescensintensiteten i forhold til antal cykler. Ved slutningen på forsøget analyserer Dx Real-Time Software automatisk resultaterne for alle prøver og kontroller. 4. REAGENSER 4.1. Beskrivelse Der er reagenser og forbrugsmaterialer nok i kittet til udførelse af 96 test. Alle reagenser er udelukkende til in vitrodiagnosticering. Etikettering Reagenser Præsentation L1 Lysis Buffer Lysisbuffer: Chelex-resin i en lysisbuffer. Konserveringsmiddel: 0,03 % ProClin 300. Hver flaske indeholder en omrørermagnet. 2 x 21 ml Klar til brug R1 Amplification Mix Koncentreret amplifikationsblanding, 10X: DNA-polymerase i en PCR-buffer indeholdende primere, specifikke fluorescerende oligonukleotidprober, dntper, UDG og MgCl 2. Konserveringsmiddel: 0,05 % natriumazid. 2 x 150 µl Skal fortyndes ved tilsætning af R2 R2 C1 C3 Amplification Mix Diluent Internal Control Positive Control Amplifikations-blandingsfortynder: PCR-buffer indeholdende MgCl 2. Konserveringsmiddel: 0,05 % natriumazid. Intern kontrol: Ikke-infektiøst DNA i en bufferet opløsning. Konserveringsmiddel: 0,03 % ProClin 300. CT,NG,MG- kontrol: Ikke-infektiøst DNA fra CT, NG og MG i en bufferet opløsning. Gul farve. Konserveringsmiddel: 0,03 % ProClin x 900 µl Klar til brug 2 x 1050 µl Klar til brug 1 x 600 µl Klar til brug Dx 24-Well PCR Strips Termoplader: Hvide mikroplader med 24 brønde, stregkodede for entydig identifikation. 4 Dx 8-Cap Strips Hættestrimler: Strimler med 8 hætter til termoplader. 12 BEMÆRK: Negativ kontrol: Den e kontrol er en portion af L1-lysisbuffer. Et tomt 2 ml-mikrorør med skruelåg mærkes således " kontrol" og forarbejdes fra trin 5 i DNA-ekstraktionen (se kapitel 8.1) Opbevarings- og håndteringskrav Kittet skal opbevares ved 2-8 C. Ved opbevaring ved denne temperatur kan alle reagenser i Dx CT/NG/MG Assay bruges indtil udløbsdatoen, som er anført på reagensetiketten. Identifikation L1 C1 C3 R1+R2 (rekonstitueret blanding) Holdbarhed efter åbning 6 måneder ved 2-8 C. Hvis der forekommer kontaminering i én af disse reagenser, kasseres den. 2-8 C indtil udløbsdatoen. Hvis der forekommer kontaminering i reagenset, kasseres det. 4 timer ved C eller 16 timer ved 2-8 C eller 2 uger ved 20 C. Hvis den rekonstituerede blanding frysses, må den kun tøs op én gang. 2

3 5. ADVARSLER OG FORHOLDSREGLER Kun til in vitro-diagnosticering Forholdsregler i forhold til helbred og sikkerhed Bær engangshandsker, laboratoriekitler og beskyttende øjenværn ved håndtering af reagenser og prøver. Vask hænderne omhyggeligt efter håndtering af reagenser og prøver. Undgå at spise, drikke eller ryge i arbejdszonerne. Håndtér alle prøver som potentielt smittefarlige og i overensstemmelse med god laboratoriepraksis. Kemikalier skal håndteres og borskaffes i overensstemmelse med god laboratoriepraksis. Sikkerhedsdatabladet kan rekvireres hos den lokale Bio-Rad-repræsentant Forholdsregler i forbindelse med proceduren Dette kit er kun valideret til brug med Dx Real-Time System (Bio-Rad) og dets Dx Real-Time Software. Brug kun Dx Collection System 50-F-kit (Bio-Rad kat. # 37012), Dx Collection System-F50-kit (Bio-Rad kat. # 37007), eller ESwab (COPAN kat. # 480 CE).til indsamling af klinikerindsamlede endocervikale, vaginale og anorektale podepindsprøver og patientindsamlede vaginale podepindsprøver. Dette system er ikke til hjemmebrug. Brug rene polypropylen-prøveopsamlingsbægre uden konserveringsmidler til indsamling af prøver af først ladte urin. Brug ikke Dx Collection System 50-F-kit (Bio-Rad kat. # 37012), Dx Collection System-F50-kit (Bio-Rad kat. # 37007), eller ESwab (COPAN kat. # 480 CE)., hvis emballagen er ødelagt, eller hvis transportmediet er lækket fra røret. Bortskaf ubrugte, ødelagte eller lækkende systemer i overensstemmelse med god laboratoriepraksis. Hvis laboratoriet modtager en podepindsprøve, der ikke er indsamlet og transporteret med Dx Collection System 50-Fkit (Bio-Rad kat. # 37012), Dx Collection System-F50-kit (Bio-Rad kat. # 37007), eller ESwab (COPAN kat. # 480 CE).eller et transportrør til podepindsprøve, der ikke indeholder nogen podepind eller indeholder to podepinde, skal prøven afvises. Brug ikke reagenser efter udløbsdatoen. Undlad at ombytte, blande eller kombinere reagenser fra kits med forskellige lotnumre. Undlad at ændre analyseproceduren. Undgå omhyggeligt krydskontaminering under prøvehåndteringstrinene. Sørg for, at prøvebeholderne ikke kommer i kontakt med hinanden. Skift omgående handsker, hvis de kommer i kontakt med prøven. Brug en ny filterspids til hver prøve. Brug DNase- og RNase-fri mikrorør og filterspidser. Rekonstituér amplifikationsblandingen med omhu for at undgå kontaminering. Kontrollér pipetterne og andet udstyr for nøjagtighed og korrekt funktion. Undgå at spilde prøver eller opløsninger, der indeholder prøvemateriale. Spildte materialer skal skylles af med blegemiddel i en 10 %-fortynding. Materialet, der anvendes til rengøring, skal bortskaffes i en beholder til kontamineret affald. Arbejdsflader, pipetter og andet udstyr skal dekontamineres regelmæssigt med blegemiddel i en 1 %-fortynding. Arbejdszoner: på laboratoriet skal der være to dedikerede områder, som udelukkende er beregnet til prøveklargøringsog amplifikation/detektions-trinene: 1. Præ-amplifikationszonen er beregnet til: (a) klargøring af prøver og kontroller og (b) PCR-opsætning (pipettering af amplifikationsblanding, kontroller og prøver i Dx 24-Well PCR Strips). Disse to trin skal udføres i to forskellige zoner inden for præ-amplifikationszonen. 2. Amplifikationszonen er beregnet til realtids-pcr-reaktionen. Alle reagenser, udstyr og laboratoriekitler, som bruges i en af zonerne, skal blive i denne zone og må aldrig bringes ind i den anden zone. Flyt aldrig amplifikationsprodukter eller amplifikationszoneudstyr til præ-amplifikationszonen. 6. PRØVER 6.1 Prøvemateriale på podepind indsamlet med Dx Collection System 50-F eller Bio-Rad Dx Collection System-F50 Dx CT/NG/MG Assay er beregnet til brug med klinikerindsamlede endocervikale, vaginale og anorektale (fra mænd og kvinder) podepindsprøver og patientindsamlede vaginale podepindsprøver. Prøverne må kun indsamles og transporteres med Dx Collection System 50-F-kit (Bio-Rad kat. # 37012), Dx Collection System-F50-kit (Bio-Rad kat. # 37007), eller ESwab (COPAN kat. # 480 CE).. Se indlægssedlen i Dx Collection System 50-F-kit (Bio-Rad kat. # 37012), Dx Collection System-F50-kit (Bio-Rad kat. # 37007), eller ESwab (COPAN kat. # 480 CE).for flere oplysninger om prøveindsamling og - transport. Podninger opsamlet med COPAN ESwab skal behandles før 5-dage ved opbevaring ved stuetemperatur (18-30 C) 7 dage ved 2-8 C, og to måneder, når den opbevares ved - 20 C. Et transportrør, der indeholder en podepind, der ikke er leveret eller valideret af Bio-Rad, flere podepinde eller ingen podepind, kan ikke bruges med Dx CT/NG/MG Assay. Forekomst af blod, nogle sæddræbende midler og behandlinger for vaginale tilstande kan interferere med realtids-pcrreaktionen. For yderligere oplysninger om interfererende stoffer henvises til kapitlet "Karakteristika for ydeevne". Når podepindsprøverne er indsamlet, kan de opbevares i op til 28 dage ved C. 3

4 6.2. Urinprøver Dx CT/NG/MG Assay er beregnet til brug med urinprøver fra kvinder og mænd fra symptomatiske og asymptomatiske patienter. BEMÆRK: Patienten må ikke have urineret i mindst 1 time før prøvetagningen. 1. Saml ml fra den første del af urinstrålen i et rent polypropylen-prøveopsamlingsbæger uden konserveringsmiddel. 2. Luk bægeret, og mærk det med patientidentifikation og dato/klokkeslæt for indsamling. 3. Transportér prøverne til teststedet ved stuetemperatur (18-30 C). Urinprøver er holdbare i 24 timer ved stuetemperatur. Hvis analysen ikke kan udføres inden for 24 timer efter prøvetagning, skal urinprøverne opbevares ved 2-8 C og analyseres inden for 7 dage. Det er også mulig at fryse urinprøver men i dette fald ikke fryse og tø urinprøver mere end én gang. 4. Urinprøver, der analyseres på eksterne teststeder, skal transporteres til teststedet i løbet af 24 timer efter indsamling. Hvis der vælges transport ved stuetemperatur, skal prøverne opbevares ved 2-8 C før transport og ved ankomsten, så det sikres, at opbevaring ved stuetemperatur ikke overskrider 24 timer efter prøvetagning. 7. PROCEDURE 7.1. Nødvendige materialer Medfølgende materialer Dx CT/NG/MG Assay (Bio-Rad, katalognr ) Nødvendige materialer, som leveres separat Dx Real-Time System, Dx Real-Time Software, pc og tilbehør (Bio-Rad, pakke, katalognr ) Dx Strip Cap Tool (leveres i Dx Real-Time System-pakken, Bio-Rad katalognr ) Dx Collection System 50-F (Bio-Rad, katalognr ),Dx Collection System-F50 (Bio-Rad, katalognr ) eller ESwab (COPAN, cat.# 480 CE) til prøvetagning og transport af anorektale podepindsprøver fra kvinder Nødvendige materialer, der ikke medfølger Rene polypropylen-urinprøvebægre uden konserveringsmiddel Bordcentrifuge til PCR-termoplader Bordcentrifuge til 1,5 ml og 2 ml mikrorør Varmeblok, der kan nå 105 C Vortex-blander Magnetisk omrører Kalibrerede pipetter, der kan indeholde 10 til 1000 µl Sterile pipettespidser med filtre Positiv forskydnings/repeterings-pipette med sterile individuelt indpakkede 1,25 ml spidser 2 ml mikrorør med hermetiske skruelåg med rund bund (Simport katalognr. T335-6S eller lignende) Pudderfri engangshandsker 7.2. Analyseprocedure Følg disse anvisninger nøje, og anvend god laboratoriepraksis DNA-ekstraktion 1. Fastsæt antallet af prøver, der skal testes, og tag et mikrorør med skruelåg pr. prøve plus et ekstra til den e kontrol. Identificér hvert mikrorør. 2. Tilsæt 1 ml af hver prøve (til urinprøve eller prøve indsamlet med Dx Collection System 50-F / Dx Collection System-F50) eller 400μl om en prøve indsamlet med ESwab i det tilhørende mikrorør. Lad et mikrorør være tomt på dette trin til den e kontrol. 3. Centrifugér i 10 minutter ved 5000 g, og kassér supernatanten ved at vende hvert mikrorør på hovedet. 4. Ryst flasken med lysisbuffer (L1) ved at vende den på hovedet, og stil den herefter på en magnetisk omrører, så Chelex - resinen forbliver i suspension. 5. Fordel 400 µl lysisbuffer (L1) i hvert mikrorør, inklusive mikrorøret med den e kontrol. 6. Tilsæt 10 µl intern kontrol (C1) til hvert mikrorør. Skru lågene fast. Bemærk: Som alternativ er det muligt at klargøre en "L1+C1"-forblanding og derefter fordele 410 µl af denne forblanding i hvert mikrorør. Forblandingsrøret skal herefter blandes på Vortex-blander før hver pipettering, så Chelexresinen forbliver i suspension. Denne forblanding kan holde sig i 5 dage ved 2-8 C. Eksempler på forblandinger: 12 test 24 test 48 test L1 5 ml 10 ml C1 125 µl 250 µl Tilsæt 525 µl af C1 direkte i 1 flaske L1 4

5 7. Bland på Vortex-blander i sekunder. 8. Inkubér i 10 minutter ± 2 minutter ved 105 C. 9. Køl ned i 2 minutter ved stuetemperatur (18-30 C). 10. Centrifugér i 2 minutter ved 4000 g. Supernatanten indeholder det ekstraherede DNA. Dette ekstraherede DNA kan opbevares i 2 timer ved stuetemperatur. Hvis amplifikation/detektions-trinet ikke udføres i løbet af 2 timer, kan det ekstraherede DNA opbevares i op til 4 dage ved 2-8 C. Ved længere opbevaring skal det ekstraherede DNA opbevares ved -20 C i op til 6 måneder Rekonstituering af amplifikationsblanding Før rekonstituering skal hætteglassene R1 (koncentreret amplifikationsblanding, 10X) og R2 (amplifikationsblandingsfortynder) blandes på Vortex-blander i 5 sekunder og derefter centrifugeres i 15 sekunder. Tilsæt nøjagtigt 850 µl amplifikationsblandingsfortynder (R2) til et hætteglas med koncentreret amplifikationsblanding (R1). Bland på Vortex-blander i 10 sekunder, og centrifugér herefter kortvarigt. Et hætteglas med rekonstitueret amplifikationsblanding (R1+R2) er nok til 48 realtids-prc-reaktioner. Klargør så mange hætteglas med rekonstitueret amplifikationsblanding (R1+R2) som nødvendigt (for eksempel 2 hætteglas, hvis der skal udføres 96 test). Den rekonstituerede amplifikationsblanding (R1+R2) kan bruges umiddelbart eller opdeles i portioner og opbevares i op til 2 uger ved 20 C Realtime-PCR amplificering/ detektering Se brugervejledningen til Dx Real-Time System for flere detaljerede anvisninger. Hver analysekørsel skal omfatte en kontrol og en kontrol. I præ-amplifikationszonen: 1. Rekonstituér så mange hætteglas med amplifikationsblanding som nødvendigt ved at følge fremgangsmåden i kapitel 8-2 (testantal = n prøver + 1 kontrol + 1 kontrol). 2. Tag det nødvendige antal Dx 24-Well PCR Strips, anbring dem på en holder, og fordel omhyggeligt 20 µl af den rekonstituerede amplifikationsblanding (R1+R2) i hver brønd med repeteringspipetten. 3. Tilsæt 5 µl ekstraheret DNA eller ekstraheret kontrol eller ikke-ekstraheret kontrol (C3) i de tilhørende brønde ved at følge pladeoversigten. Bemærk: Pas på ikke at pipettere Chelex-kugler, når de tilsættes prøver, da Chelex-kugler kan hæmme PCRreaktionen. 4. Anbring Dx 8-Cap Strips på Dx 24-Well PCR Strips. 5. Centrifugér Dx 24-Well PRC Strips i 30 sekunder ved 400 g, for at undgå bobler i brøndene. I amplifikationszonen: 6. Tænd computeren og derefter Dx Real-Time System i denne rækkefølge. Åbn Dx Real-Time Software, indtaste dit brugernavn og login klik på Set up. Klik på create new plate og vælg PCR kit navnet i "PCR kit"-vinduet. Der henvises til din lokale support for mere information om PCR kit navn passande til Dx RTS Software version. 7. Klik på Run og Open Lid. Følg Dx Real-Time Software-anvisningerne for at oprette pladeoversigten. 8. Anbring Dx 24-Well PCR Strips i Dx Real-Time System'et. 9. Brug Dx Strip Cap Tool for at anbringe Dx 8-Cap Strips på de isatte Dx 24-Well PCR Strips, og fjern eventuel snavs fra Dx 8-Cap Strips med en optisk fnugfri klud, som angivet i brugervejledningen til Dx Real-Time System'et. 10. Klik på <Close Lid>, og klik derefter på <Start Run> for at starte realtime-pcr. 11. Fjern Dx 24-Well PCR Strips fra Dx Real-Time System, når realtids-pcr-reaktionen er afsluttet. Anbring dem i en plastikpose, der kan forsegles, og bortskaf dem i overenstemmelse med god laboratoriepraksis. 12. Klik på results at se resultater 7.3. Kalibrering Under hver PCR-cyklus, på annealingstrinet, måler det optiske modul i Dx Real-Time System fluorescensen, der udsendes fra hver fluorofor, og den tilhørende Dx Real-Time Software afbilder fluorescensintensiteten i forhold til antal cyklusser. Ved slutningen af forsøget analyserer softwaren automatisk resultaterne for alle prøver og kontroller. Dx Real-Time Software bruger en proprietær matematisk algoritme til bestemmelse af værdierne af et sæt matematiske parametre (blandt andet Ceep og F0) for hver PCR-kurve, som så vises i resultatregnearket. Estimeringen af disse parametre er baseret på den formodning, at effektivitetsraten for PCR-reaktionen er maksimal ved reaktionens start og reduceres efter et antal cykler, som varierer fra den ene prøve til den anden. Ceep-værdien (cyklus ved afslutning af den eksponentielle fase) svarer til den cyklus, hvor PCR-effektiviteten begynder at gå ned. Ceep-værdien er normalt tæt på den cyklus, hvor det fluorescerende signal begynder at vokse over baggrunden. Under ideelle PCR-betingelser (ingen inhibitorer af reaktionen, høj effektivitet) svarer Ceep-værdien til kopiantallet af målsekvensen i prøven før amplifikation: Jo højere Ceep-værdi, jo lavere kopiantal ved start. F0-værdien svarer til det ikke målbare - målspecifikke fluorescerende signal, før amplifikationen starter. F0 er proportional med kopiantallet af målsekvensen i prøven før amplifikation. Da den estimerede F0-værdi normalt er <1, viser Dx Real-Time Software for nemheds skyld -log10 (F0)-værdien. Det gælder således, at jo højere -log10 (F0)-værdien er, jo lavere er startkopiantallet. I Dx CT/NG/MG Assay er analyseresultaterne baseret på Ceep-værdierne. 5

6 7.4. Kvalitetskontrol Positive og e kontroller Alle analysekørsler skal omfatte en og en kontrol, så potentielle fejl i prøvebehandlings-, amplifikations- eller detekteringstrinene kan detekteres. Hvis kontrollernes Ceep-værdier ligger uden for deres forventede område, gør Dx Real-Time Software hele analysen ugyldig og viser en af de følgende faner: * Negativ kontrol: Fane Betydning Invalid_IC: Ugyldig intern kontrol CT_conta: Kontaminering med CT-DNA NG_conta: Kontaminering med NG-DNA MG_conta: Kontaminering med MG-DNA CTNG_conta: Kontaminering med CT- og NG-DNA CTMG_conta: Kontaminering med CT- og MG-DNA NGMG_conta: Kontaminering med NG- og MG-DNA CTNGMG_conta: Kontaminering med CT-, NG- og MG-DNA * Positiv kontrol: Fane Betydning CT_out: CT-værdi uden for interval NG_out: NG-værdi uden for interval MG_out: MG-værdi uden for interval CTNG_out: CT- og NG-værdier uden for interval CTMG_out: CT- og MG-værdier uden for interval NGMG_out: NG- og MG-værdier uden for interval CTNGMG_out: CT-, NG- og MG-værdier uden for interval Alle prøver og kontroller fra analysekørslen skal herefter behandles igen startende fra DNA-ekstraktionstrinet. Detektion af inhibering: Intern kontrol Den interne kontrol tilsættes til hver prøve og til den e kontrol ved start af DNA-ekstraktionstrinet og detekteres med en specifik probe under realtids-pcr-reaktionen. Prøver, hvis interne kontrols Ceep-værdi ligger over den forventede værdi (hvilket betyder muligvis inhiberet), tolkes af Dx Real- Time Software på følgende måde: Alle prøver med en Ceep-værdi 48 for et givent mål (CT, NG eller MG) rapporteres som "e" for dette givne mål. Alle prøver uden Ceep-værdi eller en Ceep-værdi > 48 for et givent mål rapporteres som "invalid" ("ugyldige") for dette givne mål. Alle prøver, der viser et ugyldigt resultat for et mål, skal behandles igen startende fra DNA-ekstraktionstrinet Testvalideringskriterier Analysekørslen er gyldig, hvis: Den e kontrols Ceep-værdi ligger inden for det forventede område for de tre mål CT, NG og MG og Den e kontrol ingen Ceep-værdi har eller en Ceep-værdi > 48 for de tre mål CT, NG og MG Hvis analysekørslen er gyldig, rapporterer Dx Real-Time Software kørslens status som "Passed" ("Godkendt"). Hvis ikke, rapporterer Dx Real-Time Software kørselsstatussen som "Failed" ("Mislykket"). Hvis status er "Failed" ("Mislykket"), rapporteres alle testresultater i denne kørsel som "invalid" ("ugyldige"), og alle de tilhørende prøver og kontroller skal behandles igen startende fra DNA-ekstraktionstrinet Beregning / tolkning af resultater Beregningen af resultaterne udføres af Dx Real-Time Software, som automatisk bestemmer Ceep-værdierne for CT, NG og MG og for den interne kontrol i prøver og kontroller. Hvis testen er gyldig, rapporteres alle prøver (inhiberede eller ej) med en Ceep-værdi 48 for et givent mål (CT, NG eller MG) som "e" for dette givne mål af Dx Real-Time Software. Som eksempel rapporteres resultatet som "CT_POS", hvis en prøve er for CT. Hvis testen er gyldig, rapporteres ikke-inhiberede prøver uden Ceep-værdi eller med en Ceep-værdi > 48 for et givent mål (CT, NG eller MG) som "e" for dette givne mål af Dx Real-Time Software. Som eksempel rapporteres resultatet som "CT_neg", hvis en prøve er for CT. Hvis testen er gyldig, tolkes alle inhiberede prøver uden Ceep-værdi eller med en Ceep-værdi > 48 for et givent mål (CT, NG eller MG) som "invalid" ("ugyldige") for dette givne mål af Dx Real-Time Software, som herefter rapporterer resultatet som "Failed" ("Mislykket") med fanen "Invalid_IC". Den tilhørende prøve skal derfor behandles igen startende fra DNAekstraktionstrinet. 6

7 BEMÆRK: Hvis den inhiberede prøve er en urinprøve, anbefales det at fryse den ned én nat ved -20 C, før den behandles igen, da nedfrysning kan fjerne inhibitorer i urin. Men ikke fryse og tø urinprøver mere end én gang. Hvis prøven stadig er inhiberet, anbefales det at udføre en ny test med en ny prøvetagning. 8. TESTBEGRÆNSNINGER Denne tests optimale ydeevne afhænger direkte af prøvernes kvalitet. Det er derfor vigtigt at følge anvisningerne i kapitlet "Indsamling og håndtering af prøvemateriale". Analysen bør kun udføres på de anførte prøvetyper. Andre prøvetyper er ikke valideret. Tilstedeværelsen af blod, mucus, nogle sæddræbende midler og behandlinger for vaginale tilstande kan interferere med realtids-pcr-reaktionen. For yderligere oplysninger om interfererende stoffer henvises til kapitlet "Karakteristika for ydeevne". Potentiel indvirkning fra andre faktorer som f.eks. vaginalt udflåd, brug af tamponer, vaginalskylning, er ikke fastlagt. Denne analyse må kun bruges af personale, som er oplært i brugen af Dx CT/NG/MG Assay, Dx Real-Time System og Dx Real-Time Software. Et t resultat udelukker ikke muligheden for en infektion, da resultaterne afhænger af flere variabler. Forkert prøvetagning eller håndtering af prøver, forekomst af inhibitorer eller en tekniske fejl kan føre til et falsk resultat. I sjældne tilfælde kan Dx CT/NG/MG Assay føre til falske NG-e resultater når prøven indeholder Neisseria meningitidis serogruppe som kan have delt målsekvens i pile gene. Prøvetagning af vaginale, anorektale prøver eller urinprøver må ikke erstatte cervikale undersøgelser og endocervikale prøver til diagnosticering af urogenitale infektioner hos kvinder. Patienterne kan have cervicitis, urethritis, urinvejsinfektioner eller vaginale infektioner af andre årsager eller samtidige infektioner med andre patogener. Dx CT/NG/MG Assay er ikke beregnet til evaluering af mistanke om seksuelt misbrug eller andre medicinsk-juridiske indikationer. Behandlingsmæssig succes eller fiasko kan ikke bestemmes med Dx CT/NG/MG Assay, da patogent DNA fortsat kan være til stede efter passende antimikrobiel behandling. Som ved alle andre diagnosetest bør resultaterne fra Dx CT/NG/MG Assay tolkes sammenholdt med andre laboratoriefund og kliniske fund. 9. FORVENTEDE VÆRDIER Forekomst Forekomsten af e prøver for C. trachomatis, N. gonorrhoeae og M. genitalium i de undersøgte populationer afhænger af det kliniske billede, alder, risikofaktorer, køn og testmetode. Forekomsten, som er observeret med Dx CT/NG/MG Assay under kliniske forsøg på 2 forsøgscentre, er vist i tabellen nedenfor: Center Population Køn N patient C. trachomatis N. gonorrhoeae M. genitalium Asymptomatisk Symptomatisk % 16.0% % 16.0% % 2.7% 1 Asymptomatisk Symptomatisk % 3.4% % 0.0% % 1.1% 2 Asymptomatisk Symptomatisk Asymptomatisk Symptomatisk % 8.3% 10.2% 14.8% % 16.7% 0.6% 7.4% % 12.5% 1.8% 74% 7

8 I alt på de 2 centre: Population Køn N patient C. trachomatis N. gonorrhoeae M. genitalium Asymptomatisk Symptomatisk % 14.9% % 16.1% % 4.0% Asymptomatisk Symptomatisk % 6.0% % 1.7% % 2.6% 10. SPECIFIKATIONER FOR YDEEVNE Analytisk ydeevne Analytisk følsomhed/detektionsgrænse Detektionsgrænsen for Dx CT/NG/MG Assay blev bestemt for hvert mål ved brug af: - til C. trachomatis: det internationale panel QCMD06 CTDNA06B i urin og transportmedium. - til N. gonorrhoeae: det internationale panel QCMD06 NgDNA06 i urin. - til M. genitalium: ATCC-stammen 33530D ved en koncentration på 1 ng DNA/µl i urin. For hver analyt blev fremstillet en fortyndingsserie, som blev testet 24 til 36 gange. Detektionsgrænsen blev bestemt ved hjælp af Probit-analysen ved bibeholdelse af en fortynding, der svarede til et t niveau på 95 % eller højere: - Detektionsgrænsen for C.trachomatis blev estimeret til: 73 kopier af DNA/ml i transportmedium, med et 95 % konfidensinterval på 45 til 182 kopier af DNA/ml. 158 kopier af DNA/ml i urin, med et 95 % konfidensinterval på 106 til 315 kopier af DNA/ml. - Detektionsgrænsen for N. gonorrhoeae blev estimeret til 1559 CFU/ml i urin, med et 95 % konfidensinterval på 1066 til 3283 CFU/ml. - Detektionsgrænsen for M. genitalium blev estimeret til 450 ækvivalent-genom/ml i urin, med et 95 % konfidensinterval på 250 til 1246 CFU/ml. Disse detektionsgrænser blev bekræftet ved test af 16 serovarer af C. trachomatis (A, B, Ba, C, D, E, F, G, H, I, J, K, LGV1, LGV2, LGV3, nv CT) og 19 N. gonorrhoeae-stammer isoleret fra patienter. Analytisk specificitet (krydsreaktivitet) Den analytiske specificitet for Dx CT/NG/MG Assay blev evalueret på i alt 112 bakterier, vira, gær- og mugstammer. Dette panel omfatter stammer, der kan isoleres i den urogenitale kanal, samt stammer, der repræsenterer et fylogenetisk tværsnit med Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrehoeae eller Mycoplasma genitalium: Achromobacter xerosis Haemophilus influenzae Neisseria perflava Acinetobacter calcoaceticus Hepatitis B virus (HBV) Neisseria polysaccharea Acinetobacter lwoffii Herpes simplex virus 1 Neisseria sicca Actinomyces isrealii Herpes simplex virus 2 Neisseria subflava flava Aerococcus viridans Human Immunodeficiency Virus (HIV) Neisseria subflava perflava Agrobacterium radiobacter Human Papilloma Virus HPV 16 Paracoccus denetrificans Alcaligenes faecalis Human Papilloma Virus HPV 18 Peptostreptococcus anaerobius Bacillus subtilis Kingella dentrificans Plesiomonas shigelloides Bacteriodes fragilis Kingella kingae Propionibacterium acnes Bacteroides ureolyticus Klebsiella oxytoca Proteus mirabilis Bifidobacterium adolescentis Klebsiella pneumoniae Providencia stuartii Bifidobacterium breve Lactobacillus acidophilus Pseudomonas aeruginosa Brevibacterium linens Lactobacillus brevis Pseudomonas putida Campylobacter jejuni Lactobacillus jensenii Rahnella aquatilis Candida albicans Lactobacillus vaginalis Rhodospirillum rubrum Candida glabrata Legionella pneumophila Salmonella minnesota Candida tropicalis Leuconostoc mensenteroides Salmonella typhimurium Chlamydia pneumoniae Micrococcus luteus Serracia marscence Chlamydia psittaci Moraxella (Branhamella) catarrhalis Staphylococcus aureus Chromobacterium violaceum Moraxella lacunata Staphylococcus epidermidis Citrobacter freundii Moraxella osloensis Staphylococcus saprophyticus Clostridium perfringes Morganella morganii Streptococcus agalactiae Corynebacterium genitalium Mycobacterium gordonae Streptococcus bovis Corynebacterium xerosis Mycobacterium smegmatis Streptococcus griseinus Cryptococcus neoformans Mycoplasma fermentans Streptococcus mitis Cytomegalovirus Mycoplasma hominis Streptococcus mutans Derxia gummosa Mycoplasma orale Streptococcus pneumoniae Edwardsiella tarda Mycoplasma penetrans Streptococcus pyogenes 8

9 Eikenella corrodens Mycoplasma pneumoniae Streptococcus salivarus Enterobacter cloacae Neisseria cinerea Streptococcus sanguis Enterococcus avium Neisseria elongata Treponema pallidium Enterococcus faecalis Neisseria flavescens Trichomonas vaginalis Enterococcus faecium Neisseria lactamina Ureaplasma urealyticum Escherichia coli Neisseria meningitidis 135 Veillonella parvula Flavobacterium meningosepticum Neisseria meningitidis serogroupe A Vibrio parahaemolyticus Fusobacterium nucleatum Neisseria meningitidis serogroupe B Yersinia enterocolitica Gardnerella vaginalis Neisseria meningitidis serogroupe C Gemella haemolysans Neisseria mucosa Alle stammer bortset fra 22 blev dyrket, kalibreret ved 10 8 CFU/ml i transportmedium, ekstraheret og testet med Dx CT/NG/MG Assay. For de 22 ikke-dyrkede stammer blev kommercielt DNA ved 40 µg/ml til 200 µg/ml testet direkte med Dx CT/NG/MG Assay. En stamme, Neisseria meningitidis serogruppe B, gav et t resultat med Neisseria gonorrhoeae-målet. Denne krydsreaktivitet blev også observeret under kliniske evalueringer. Interferens Potentiel interferens med Dx CT/NG/MG Assay blev bedømt med endogene eller eksogene stoffer, som kan være til stede i podepindsprøver og/eller urinprøver. Fjorten stoffer blev fortyndet til forskellige slutkoncentrationer og tilsat til en podepindspool i transportmedium eller til en urinpool, der indeholdt de 3 mål CT, NG og MG ved en koncentration på cirka 3 gange detektionsgrænsen, samt til en podepindspool i transportmedium eller til en urinpool, der ikke indeholdt nogen af de 3 mål. Hver betingelse blev testet ved 10 gentagne test. Følgende stoffer blev testet: Potentielt interfererende stof Koncentration Matrix Bilirubin 1 mg/ml Urin Blod 5% v/v Urin 5% v/v Podepind Glukose 1 mg/ml Urin ph 4 ph 9 Proteiner (human serum albumin) 5% Urin Delfen (svangerskabsforebyggende skum) 5% Podepind Betadin 5% Podepind Miconazol (anti-bakteriedræbende og svampedræbende middel) 5% Podepind Isoconazol (anti-bakteriedræbende og svanpedræbende middel) 5% Podepind Trophicrem (vaginalcreme) 5% Podepind Acyclovir (middel mod herpes) 5% Podepind Smørende KY-gel 5% Podepind Progesteron 5% Podepind Der blev ikke observeret interferens med Dx CT/NG/MG Assay med ovennævnte stoffer bortset fra: - Delfen 5 %: inhibitoreffekt på detektion af Neisseria gonorrohoeae og Mycoplasma genitalium. - Blod ved 5 %: inhibitoreffekt på detektion af Neisseria gonorrohoeae. Undersøgelse af konkurrence mellem de forskellige multiplekse analytter For at validere, at tilstedeværelse af de 3 mikroorganismer i samme prøve ikke resulterer i en konkurrenceeffekt mellem målene, som kunne føre til en detektionsfejl for en af dem, blev urin- og transportmediumprøverne tilsat lave og høje koncentrationer af hver af de tre mikroorganismer til fremstilling af alle kombinationer (1 lav/2 høje eller 2 lave/1 høj). Disse prøver blev testet med Dx CT/NG/MG Assay parallelt med prøver, der var tilsat en lav koncentration af kun en af hver mikroorganisme, for at detektere en eventuel virkning på hvert af målene. Procentdelen af e responser blev analyseret på test, der blev udført tredobbelt over 3 dage. For alle undersøgte mikroorganismer havde ingen af de testede kombinationer indvirkning på det forventede resultat. Der er således ingen konkurrence mellem målene, og tilstedeværelse af en af mikroorganismerne i høj koncentration resulterer ikke i detektionsfejl for de to andre. Tilstedeværelse af de 3 mikroorganismer ved høj koncentration i den samme prøve medfører imidlertid inhibering af den interne kontrol. Urin Urin 9

10 Præcisionsundersøgelse Der er lavet en undersøgelse til bestemmelse af præcisionen inden for en analyse, fra dag til dag, mellem instrumenter og mellem partier. Tre urinprøver (U2, U3, U4) og 3 transportmediumprøver (S2, S3, S4) fik tilsat henholdsvis lave, middel og høje koncentrationer af C. trachomatis, N. gonorrohoeae eller M. genitalium. I henhold til CLSI-anvisningerne EP5A2 blev dette panel testet 3 gange pr. dag i 21 dage på 2 forskellige Dx Real-Time Systeminstrumenter og på 2 forskellige partier af Dx CT/NG/MG Assay. Analysen på e prøver blev udført ved hjælp af Ceepværdierne. Nested ANOVA-funktionen blev brugt til måling af varianskomponenterne for hver betingelse (parti - instrument - dag -gentagne forsøg). Alle testene gav det forventede kvalitative resultat. Resultaterne er følgende: Chlamydia trachomatis CT Inden for en analyse Fra dag til dag Mellem instrumenter Mellem partier Præcision i alt PANEL N Middel SD CV% SD CV% SD CV% SD CV% SD CV% U2 (lav) ,0 1,542 5,0% 0,674 2,2% 0* NA 1,151 3,7% 2,038 6,6% U3 (middel) ,6 0,370 1,3% 1,246 4,4% 0* NA 0,872 3,0% 1,565 5,5% U4 (høj) ,0 0,197 0,9% 0,888 4,0% 0* NA 0,076 0,3% 0,913 4,2% S2 (lav) ,3 0,405 1,2% 0,484 1,5% 0* NA 0,354 1,1% 0,723 2,2% S3 (middel) ,9 0,196 0,6% 0,582 1,9% 0* NA 0,246 0,8% 0,661 2,1% S4 (høj) ,9 0,166 0,6% 0,176 0,7% 0* NA 0,177 0,7% 0,300 1,1% * Variansværdien er og fastsat til 0. Neisseria gonorrhoeae NG Inden for en analyse Fra dag til dag Mellem instrumenter Mellem partier Præcision i alt PANEL N Middel SD CV% SD CV% SD CV% SD CV% SD CV% U2 (lav) ,1 1,487 4,8% 1,095 3,5% 0* NA 1,076 3,5% 2,137 6,9% U3 (middel) ,3 1,466 5,2% 0,866 3,1% 0* NA 0,148 0,5% 1,710 6,0% U4 (høj) ,2 0,693 3,4% 1,127 5,6% 0,25 1,2% 1,062 5,3% 1,715 8,5% S2 (lav) ,1 0,221 0,7% 0,233 0,7% 0,133 0,4% 0* NA 0,348 1,1% S3 (middel) ,7 0,346 1,1% 0,429 1,4% 0,089 0,3% 0* NA 0,558 1,8% S4 (høj) ,1 0,382 1,4% 0,708 2,6% 0* NA 0* NA 0,805 3,0% * Variansværdien er og fastsat til 0. Mycoplasma genitalium MG Inden for en Mellem Fra dag til dag analyse instrumenter Mellem partier Præcision i alt PANEL N Middel SD CV% SD CV% SD CV% SD CV% SD CV% U2 (lav) ,6 0,322 1,0% 0,344 1,1% 0* NA 0,257 0,8% 0,537 1,6% U3 (middel) ,1 0,414 1,4% 1,216 4,2% 0* NA 0,220 0,8% 1,303 4,5% U4 (høj) ,8 0,408 1,8% 0,851 3,7% 0* NA 0* NA 0,943 4,1% S2 (lav) ,9 0,481 1,3% 0,630 1,8% 0* NA 0,427 1,2% 0,901 2,5% S3 (middel) ,2 0,439 1,3% 0,658 2,0% 0* NA 0,252 0,8% 0,831 2,5% S4 (høj) ,5 0,389 1,4% 0,213 0,8% 0* NA 0,162 0,6% 0,472 1,7% * Variansværdien er og fastsat til 0. 10

11 10.2. Klinisk ydeevne Karakteristika for den kliniske ydeevne af Dx CT/NG/MG Assay blev fastlagt under et forsøg, der blev udført ved 2 kliniske centre i Frankrig symptomatiske og asymptomatiske patienter, der konsulterede STI-forebyggelsescentre og anonyme åbne screeningcentre, blev rekrutteret til dette forsøg. 12 patienter opfyldte ikke de i forvejen definerede inklusionskrav og blev ekskluderet. De øvrige 1408 patienter blev inkluderet i forsøget (821 kvinder og 587 mænd). Der blev i alt analyseret 2361 prøver: 430 vaginale patientindsamlede prøver. 407 endocervikale prøver. 386 vaginale klinikerindsamlede prøver. 540 først ladte urinprøver fra kvinder. 532 først ladte urinprøver fra mænd. 57 anorektale prøver. 9 urethraprøver. Blandt disse prøver: blev 381 vaginale, endocervikale og først ladte urinprøver taget fra de samme patienter. blev 26 vaginale og endocervikale prøver taget fra de samme patienter. afleverede 151 kvinder en selvindsamlet først ladte urinprøve og en vaginalprøve. var en først ladte urinprøve og den tilhørende urethraprøve til rådighed for 6 mænd. Alle prøverne blev taget ved hjælp af Dx Collection System-F50 (Bio-Rad, katalognr ) og Dx Collection System-M15 (Bio- Rad, katalognr ). Endvidere blev 60 frosne prøver (10 først ladte urinprøver, 22 anorektale prøver, 16 vaginale prøver, 1 endocervikal prøve og 11 urethraprøver), som havde været opbevaret i 2SP-medium og først var testet e for en af de 3 mikroorganismer (20 pr. mikroorganisme), testet retrospektivt ved hjælp af Dx CT/NG/MG Assay. Ydeevnen af Dx CT/NG/MG Assay for målet C. trachomatis blev fastsat ved sammenligning med to EU-registrerede realtids- PCR-test. Ydeevnen af Dx CT/NG/MG Assay for målet N. gonorrhoeae blev fastsat ved sammenligning med en EU-registreret PCR-test eller med dyrkningen. Ydeevnen af Dx CT/NG/MG Assay for målet M. genitalium blev fastsat ved sammenligning med en intern PCR-test ved hjælp af TaqMan-teknikken i henhold til protokollen, der er beskrevet af Jensen (15). På et af forsøgscentrene blev kun prøver, der var testet e med Dx CTNG/MG Assay, testet med den interne PCR-test. Chlamydia trachomatis-ydeevne: 1361 prøver fra de 2 centre blev analyseret parallelt ved hjælp af Dx CT/NG/MG Assay og PCR 1-testen: Center PCR 1-test PCR 1-test Prøver Dx CT Dx CT Dx CT Dx CT selvindsamlet vaginal endocervikal vaginal først ladte urin anorektal først ladte urin anorektal urethral I alt Inv IC I alt Den relative specificitet af Dx CT/NG/MG Assay med hensyn til PCR 1-testen er 1223/1229 = 99,5 % CI 95 [98,9 % 99,8 %]. Den relative følsomhed af Dx CT/NG/MG Assay med hensyn til PCR 1-testen er 112/114 = 98,2 % CI 95 [93,8 % 99,8 %]. 11

12 På et af de 2 centre blev 1014 prøver analyseret parallelt ved hjælp af Dx CT/NG/MG Assay og endnu en realtids-pcr-test: Center 1 PCR 2-test PCR 2-test Prøver Dx CT Dx CT Dx CT Dx CT selvindsamlet vaginal endocervikal vaginal først ladte urin først ladte urin anorektal I alt * * To af disse prøver (1 vaginal og 1 først ladte urin) er faktisk sande e prøver fra patienter, hvor de andre prøver var e ved Dx CT/NG/MG Assay og PCR 2-testen. Den relative specificitet af Dx CT/NG/MG Assay med hensyn til PCR 2-testen er 950/954 = 99,6 % CI 95 [98,9 % 99,9 %]. Den relative følsomhed af Dx CT/NG/MG Assay med hensyn til PCR 2-testen er 51/57 = 89,5 % CI 95 [78,5 % 96,0 %]. Efter analyse af de uoverensstemmende prøver blev 2 prøver fjernet fra beregningerne. Det var prøverne fra de 2 patienter, hvorfra de andre tilknyttede prøver var e ved Dx CT/NG/MG Assay og PCR 2-testen. Den relative følsomhed efter udelukkelse er 51/55 = 92,7 % CI 95 [82,4 % 98,0 %]. Neisseria gonorrhoeae-ydeevne: 1012 prøver blev analyseret parallelt med Dx CT/NG/MG Assay og en realtids-pcr-test. 712 andre prøver blev analyseret parallelt med Dx CT/NG/MG Assay og kulturen. Resultaterne er vist nedenfor: Sammenligning med en realtids-pcr-test Inv IC I alt Center 1 PCR NG-test PCR NG-test Prøver Dx NG Dx NG Dx NG Dx NG selvindsamlet vaginal endocervikal vaginal først ladte urin anorektal først ladte urin anorektal I alt Inv IC I alt Den relative specificitet af Dx CT/NG/MG Assay med hensyn til PCR-testen er 997/998 = 99,9 % CI 95 [99,4 % 100 %]. Den relative følsomhed af Dx CT/NG/MG Assay med hensyn til PCR-testen er 10/11 = 90,9 %. 12

13 Sammenligning med dyrkningen Center 1 NG-kultur NG-kultur Prøver Dx NG Dx NG Dx NG Dx NG selvindsamlet vaginal endocervikal vaginal først ladte urin anorektal først ladte urin anorektal urethral I alt Inv IC I alt Den relative specificitet af Dx CT/NG/MG Assay med hensyn til dyrkningen er 675/677 = 99,8 % CI 95 [98,9 % 100 %]. Den relative følsomhed af Dx CT/NG/MG Assay med hensyn til dyrkningen er 30/30 = 100 %. Mycoplasma genitalium-ydeevne: På center 2 blev 656 prøver analyseret parallelt ved hjælp af Dx CT/NG/MG Assay og den interne TaqMAN MG-PCR-test: Center 2 PCR MG-test PCR MG-test Prøver Dx MG Dx MG Dx MG Dx MG først ladte urin endocervikal vaginal først ladte urin anorektal urethral I alt Inv IC I alt Den relative specificitet af Dx CT/NG/MG Assay med hensyn til den interne TaqMan-PCR-test er 616/617 = 99,8 % CI 95 [99,1 % 100 %]. Den relative følsomhed af Dx CT/NG/MG Assay med hensyn til den interne TaqMan-PCR-test er 10/11 = 90,9 %. 25 prøver fra 20 patienter, som var testet e for M. genitalium med Dx CT/NG/MG Assay på center 1, blev sendt til center 2 til analyse med den interne TaqMan MG-PCR-test. 22/25 prøver blev testet e med Dx CT/NG/MG Assay på center 2, de resterende 3 prøver var tæt på detektionsgrænsen. Ud af disse 22 prøver blev 2 testet e med den interne TaqMan MG-PCR-test. Overensstemmelsen mellem Dx CT/NG/MG Assay og den interne TaqMan-PCR-test er derfor 20/22 = 90,9 % for prøverne, der kom fra center 1. Mindst én af de to uoverensstemmende prøver er imidlertid en sand, da den stammede fra en patient, for hvem alle de tilknyttede prøver blev testet e for M. genitalium med Dx CT/NG/MG Assay. Den endelige overensstemmelse mellem Dx CT/NG/MG Assay og den interne TaqMan-PCR-test, som opnåedes efter sammenlægning af resultaterne fra center 1 og center 2, er således 626/629 = 99,5 %. Retrospektiv undersøgelse (center 2) Tres prøver (10 først ladte urinprøver, 22 anorektale prøver, 16 vaginale prøver, 1 endocervikal prøve og 11 urethraprøver), som havde været opbevaret ved -80 C i 2SP-medium og oprindeligt var testet e for en af de 3 mikroorganismer med testen, der rutinemæssigt bruges på laboratoriet (20 pr. mikroorganisme), blev testet retrospektivt ved hjælp af Dx CT/NG/MG Assay. For C. trachomatis var 19/19 prøver overensstemmende e, og den tyvende viste en ugyldig intern kontrol. For N. gonorrhoeae var 19/20 prøver overensstemmende e, og den tyvende var tidligere fundet ved dyrkning med kun 1 koloni. 13

14 For M. genitalium var 16/20 prøver overensstemmende e. Ud af de 4 uoverensstemmende (urin) prøver blev 2 testet e efter kontrol med rutinetesten. 11. LITTERATURHENVISNINGER 1. WHO. Global prevalence and incidence of selected curable sexually transmitted infections. Overview and estimates. Geneva: WHO; Cates W Jr, Rolfs RT Jr, Aral SO. Sexually transmitted diseases, pelvic inflammatory disease, and infertility: an epidemiologic update. Epidemiol Rev 1990; 12: Stamm WE. Chlamydia trachomatis infections of the adult. In: Holmes KK, Sparling P F, Mardh PA, eds. Sexually Transmitted Diseases, 3rd ed. New York: McGraw-Hill, Centers for Disease Control and Prevention. Screening tests to detect Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae infections. MMWR 2002; 51 (No. RR-15) : Taylor-Robinson D. Mycoplasma genitalium: an update. Int J STD AIDS 2002; 13: Simms I, Eastick K, Mallinson et al. Associations between Chlamydia trachomatis, Mycoplasma genitalium, and pelvic inflammatory disease. Sex Transm Infect 2003; 79: Cohen CR, Manhart LE, Bukusi EA et al. Associations between Mycoplasma genitalium and acute endometritis. Lancet 2002; 359: Clausen H F, Fedder J, Drasbek M et al. Serological investigation of Mycoplasma genitalium in infertile women. Human Reprod 2001; 16: Falk L, Fredlund H, Jensen JS. Symptomatic urethritis is more prevalent in men infected with Mycoplasma genitalium than with Chlamydia trachomatis. Sex Transm Infect 2004; 80: Moi H, Reinton N, Moghaddam A. Mycoplasma genitalium in women with lower genital tract inflammation. Sex Transm Infect 2009; 85: Moi H, Reinton N, Moghaddam A. Mycoplasma genitalium is associated with symptomatic and asymptomatic nongonococcal urethritis in men. Sex Transm Infect 2009; 85: Haggerty CL, Totten PA, Astete SG, Lee S, Hoferka SL, Kelsey FL, Ness RB. Failure of cefoxitin and doxycycline to eradicate endometrial Mycoplasma genitalium and the consequence for clinical cure of pelvic inflammatory disease. Sex Transm Infect 2008; 84: Falk L, Fredlund H, Jensen JS. Signs and symptoms of urethritis and cervicitis among women with or without Mycoplasma genitalium or Chlamydia trachomatis infection. Sex Transm Infect 2005; 81: Ripa T, Nilsson PA. A Chlamydia trachomatis strain with a 377-bp deletion in the cryptic plasmid causing false-e nucleic acid amplification tests. Sex Transm Dis 2007:34: Jensen J S, Björnelius E, Dohn B, Lidbrink P. Use of TaqMan 5 Nuclease Real-Time PCR for quantitative detection of Mycoplasma genitalium DNA in males with and without urethritis who were attendees at a Sexually Transmitted Disease clinic. J.Clin. Microbiol : Køb af dette produkt giver køberen lov til at bruge det til udførelse af diagnostisk service i forbindelse med human in vitrodiagnosticering. Ved købet overdrages ikke et generelt patent eller anden licens af nogen artend denne specifikke ret til brug. Alle andre beskyttede varemærker, der eventuelt måtte blive nævnt i denne indlægsseddel, tilhører de respektive ejere. * Dx CT/NG/MG Assay er CE-IVD-mærket med henblik på påvisning af Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae ogmycoplasma genitalium. CT-parametren på listen i bilag IIB af 98/79/EF direktivet, er den eneste parameter evalueret af 0459, det bemyndigede organ i henhold til bilag IV.3 herom. * Bio-Rad 3, boulevard Raymond Poincaré Marnes-la-Coquette France Tel.: +33 (0) /12 Fax : +33 (0) code: