PBP Undersøgelse af kvaliteten af analysen af total t3 og total t4 på Centaur XPT Afleveringsdato: 09-06-2016 Udarbejdet af: Mia Kærgaard Larsen (197388@via.dk) Jameela Safi (167133@via.dk) Faisal Mohamud Jama (197312@via.dk) Vibeke Kyster Søgaard (197377@via.dk) Antal tegn m. mellemrum: 49.385 Vejledere: Gitte Meyer Larsen, klinisk vejleder (gml@rn.dk) Jakob Tovbjerg Simonsen, lektor, cand. Scient. (jts@via.dk)
Tak til Vi vil gerne sige tak til Klinisk Biokemisk Afdeling på Aalborg Universitetshospital, for hjælp med indsamling og analyse af patientprøver under projektet. Der skal også rettes en tak til Klinisk Biokemisk Afdeling Regionshospitalet Horsens, for hjælp ved indsamling af patientprøver, som blev anvendt til bestemmelse af Intermediær præcision. Desuden rettes der en stor tak til personalet på Klinisk Biokemisk Afdeling Regionshospitalet Nordjylland Hjørring, for den stor hjælp som vi modtog under arbejdet med projektet. Resume Der rekvireres stigende antal analyser af Tt3 og Tt4 på Regionshospitalet Nordjylland Hjørring. De bliver herefter sendt til Regionshospitalet Nordjylland på Klinisk Biokemisk Afdeling (KBA) Aalborg, som foretager analysering af Tt3 og Tt4. Afdelingen vil derfor undersøge, om det vil være muligt at hjemtage analyserne. Deres kriterier for hjemtagelse af analyserne er, at metodesammenligning og intermediær præcision analyseret på li-heparin-plasma, skulle overholde kravene, som afdelingen har sat ved validering foretaget før nye analysemetoder tages i brug. Det blev undersøgt, hvilken betydning det har for analysens kvalitet, at analysen af Tt3 og Tt4 foretages på Siemens Centaur XPT på KBA Hjørring i forhold til Cobas 8000 på KBA Aalborg, og hvilken betydning det har for analyseresultatet at analyserne udføres på plasma i stedet for serum? Til sidst blev Intermediær præcision bestemt gennem gentagne målinger på poolprøver med høj, normal og lav koncentration af Tt3 og Tt4 Ved metodesammenligningen viste resultatet store procentvise differencer mellem målinger af Tt3 eller Tt4 på de samme patientprøver, analyseret på Centaur XPT og Cobas 8000. Det samme gælder forsøget, hvor analyseresultaterne fra hhv. plasma og serum sammenlignes. Også her er differencerne mellem serum- og plasma-prøverne store. Ved beregning af den intermediære præcision viste resultaterne, at kravene fra Westgard ikke blev overholdt. Hvis analysen af Tt3 og Tt4 foretages på Li-heparin plasma på Centaur XPT, vil det ikke være muligt for KBA Hjørring at hjemtage analysen af Tt3 og TT4. 1
Indhold Tak til... 1 Resume... 1 Indledning... 4 Baggrund og formål... 4 Problemformulering... 4 Målformulering... 5 1. Metodesammenligning... 5 2. Intermediær præcision... 5 3. Plasma vs. serum... 5 Teori... 6 Thyreoidea... 6 Analyse princip ADVIA Centaur XP... 8 Analyse princippet Roche Cobas 8000... 10 Plasma og serum... 10 Interferens i immunoassays... 11 Materialer... 12 Apparatur... 12 Reagenser Siemens ADVIA Centaur XPT... 12 Reagenser Roche Cobas 8000... 13 Kalibrator... 14 Fremstilling... 14 Anvendelse... 14 Kontroller... 15 Fremstilling HK12... 15 Anvendelse HK12 og HK11... 15 Anvendelse Liquid Assayed Multiqual level 1 og 3... 15 Prøverør... 16 Prøvemateriale... 16 Utensilier... 16 Utensilier til Siemens Centaur XPT... 16 Andre apparaturer... 16 Pipetter... 16 Metode... 17 2
Etiske overvejelse... 17 Anvendt referenceinterval for Tt3 of Tt4... 17 Metodesammenligning... 18 Design og indsamling af prøver... 18 Resultatbehandling... 18 Intermediær præcision... 19 Design og indsamling af prøver... 19 Fremstilling af pools... 20 Analysering af prøver... 21 Resultatbehandling... 21 Tt3 og Tt4 i Plasma vs. Serum... 22 Design og indsamling af prøver... 22 Resultatbehandling... 22 Resultater... 23 Metodesammenligning... 23 Intermediær præcision... 25 Plasma vs. Serum... 26 Diskussion... 27 Perspektivering... 30 Konklusion... 31 Referenceliste... 32 3
Indledning Baggrund og formål Skjoldbruskkirtlen (Thyreoidea) producerer stofskiftehormonerne trijodthyronin (T3) og thyroxin (T4), kirtlens produktion af hormonerne styres af hypofysen, som udskiller det thyreoideastimulerende hormon (TSH). Måling af T3, T4 og TSH anvendes ved mistanke om og til kontrol af thyreoideasygdomme(1). Stofskiftehormonerne T3 og T4 måles på to måder, en total værdi (T), hvor koncentrationen af både protein-bundne og frie hormoner i patient-blodprøven medtages, og en fri værdi (F), hvor kun koncentrationen af frie hormoner er medtaget(2). På KBA Regionshospitalet Nordjylland Hjørring afdeling (KBA Hjørring) analyseres Ft4 og TSH, mens analyserne af Tt3 og Tt4 sendes til KBA på Aalborg Universitetshospital (KBA Aalborg). Lægerne på Regionshospitalet Nordjylland Hjørring og de praktiserende læger rekvirerer et stigende antal analyser af Tt3 og Tt4. I 2014 blev der sendt 1920 stk. Tt4 og 1850 stk.tt3 til KBA Aalborg. Det første halve år af 2015, blev der sendt det samme antal prøver, som i hele 2014. På grund af det stigende antal rekvireringer, ønsker KBA Hjørring at undersøge, om det vil være muligt for afdelingen, at hjemtage analyserne i stedet for at sende prøverne. På nuværende tidspunkt foretages alle analyserne af Tt3 og Tt4 i Region Nordjylland på KBA Aalborg Hvis KBA Hjørring hjemtager analyserne, vil prøverne fremover blive analyseret på Siemens ADVIA Centaur XPT (Centaur XPT), som anvender kompetitivt kemiluminescensimmunoassays (CLIA) (bilag 1 og 2). Inden analyserne hjemtages skal der foretages en validering af analyserne, hvor der bla. bestemmes en intermediepræcision og der foretages en metodevalidering (3). Metodesammenligning foretages mellem Roche COBAS 8000 (Cobas 8000) på KBA Aalborg, som anvender elektrokemiluminescensimmunoassay (ECLIA) til analyse af Tt3 og Tt4, og Centaur XPT (bilag 3 og 4). På KBA Aalborg udføres analyserne Tt3 og Tt4 på plasma fra li-heparin-rør. På Centaur XPT anbefaler Siemens at analyserne af Tt3 og Tt4 bliver udført på serum (bilag 1 og 2). At analysere Tt3 og Tt4 på serum vil være uhensigtsmæssigt for KBA Hjørring da det ville kæve at der under prøvetagning tages et ekstra separat serum-rør, som efterfølgende skal henstå en time inden analyse, hvor li-heparin-rør kan centrifugeres og analyseres lige efter prøvetagning (4). Derfor ønsker KBA Hjørring at undersøge, om det er muligt at udføre analyserne Tt3 og Tt4 på Centaur XPT, med plasma i stedet for serum. Problemformulering Hvilken betydning har det for analysens kvalitet, at analysen af Tt3 og Tt4 foretages ved anvendelse af Liheparin-plasma som prøvemateriale på Siemens Centaur XPT på KBA Hjørring, i forhold til Cobas 8000 på KBA Aalborg, og hvilken betydning har det for analyseresultatet at analyserne udføres på plasma i stedet for serum? 4
Målformulering 1. Metodesammenligning Metodesammenligning af analysen af Tt3 og Tt4 på Centaur XPT på KBA Hjørring og Cobas 8000 på KBA Aalborg. Der analyseres et større antal plasma-patientprøver, >40, som inddeles i tre intervaller, høj, normal og lav koncentration. Resultatet vurderes ved fremstilling af et Bland-Altman plot. Her vurderes det om en evt. forskel har betydning for analyseresultaterne ved måling af henholdsvis Tt3 og Tt4. 2. Intermediær præcision For at bestemme den intermediære præcision fortages der gentagne målinger, >30, på pool-prøver med høj, normal og lav koncentration af Tt3 og Tt4. o Normal: Tt3 1,1-2,5 nmol/l og Tt4 60-140 nmol o Høj Tt3: >2,5 nmol/l o Lav Tt3: <1,1 nmol/l o Høj Tt4: >140 nmol/l o Lav Tt4: <60 nmol/l Hver pool fremstilles ud fra 15 plasma-patientprøver, som blandes for at opnå en helt ny koncentration og en stor nok volumen til mindst 30 analyser. Analysen foretages over 13 dage, hvor der måles tre gang om dagen, morgen, middag og eftermiddag, i alt 39 målinger. Der beregnes en CV% for de enkelte pools, som vurderes i forhold til intermediær præcisions CV% fundet på http://www.westgard.com/, som er et international kvalitets kontrol firma (5). 3. Plasma vs. serum For at vurdere om det er muligt at udføre analyserne af Tt3 og Tt4 på plasma i stedet for serum på Centaur XPT, sammenlignes analyseresultaterne af analysen af Tt3 og Tt4 udført på plasma og serum fra samme patient. Analyseresultaterne sammenlignes ved hjælp af et Bland-Altman plot, som anvendes til at vurdere om der er signifikant forskel mellem resultaterne, og om en evt. forskel har klinisk relevans. 5
Teori Thyreoidea Thyreoidea har mange forskellige funktioner i kroppen. Det er en kirtel som bl.a. danner thyreoideahormonerne t4 (thyroxin) og, t3 (trijodthyronin), der styrer kroppens stofskifte (metabolisme), varmeproduktion og stimulation af knoglernes længdevækst før epifyserne lukker til. Glandula Thyreoidea findes på den øverste del af trachea nederst på larynx. Den består af 2 lapper på hver side heraf. Den er ca. 5 cm. i højden og kirtelvævet er rødbrunt. Kirtlen er opbygget af follikler der består af follikelceller omkransende kolloid. Folliklerne er adskilt af bindevæv og er den funktionelle enhed. Glandula Figur 1: Glandula Thyreoideas placering og opbygning. thyreoidea er en karfyldt kirtel, hvor de mange kapillærer sørger for, at de producerede hormoner transporteres videre til hele kroppen (Se figur 1) (6) (7). I folliklerne produceres thyroglobulin som forstadie til stofskiftehormonerne t3 og t4. Thyroglobulin lagres i follikelcellernes kolloid. Follikelcellerne virker som transportmedium for iod-atomer fra vævsvæske til kolloid gennem aktiv transport. I kolloidet iodiseres thyroglobulin, der transporteres tilbage til follikelcellerne gennem dannelse af endocystiske vesikler. Når disse er i follikelcellerne sker den endelige dannelse af t4 og 20 % af t3(se figur 2), de øvrige 80 % af t3 dannes i leveren gennem at t4 deiodisering, fraspaltes et iodatom (6) (7). Da t3 og t4 er fedtopløselige proteiner og koncentrationen er lavere i kapillærerne end i follikelcellerne, transporteres de nemt ved hjælp af transport radianten(7). Den videre transport i blodet foregår blandt andet ved hjælp af det thyroxinbindende protein TBG, TTR og Albumin(7). Langt den største del af t3 og t4 i blodet er bundet til transportproteinerne(6) (8). Figur 2: Produktion og udskillelse af hormoner fra thyreoida. Produktionen af t3 og t4 reguleres gennem negativ feedback, idet koncentrationen af t3 og t4 i blodet påvirker produktionen af TRH (thyreoida regulerende hormon) og TSH (thyreoidea stimulerende hormon). Det betyder, at når blodkoncentrationen af t3 og t4 er høj, så falder produktionen af henholdsvis TSH og TRH, - og omvendt hvis koncentrationen af t3 og t4 er lav. TRH produceres i hypothalamus og TSH produceres i hypofyseforlappen(6) (7). 6
Ved at analysere patientprøver, kan der stilles diagnose om patienten har hypo- eller hyperthyreose (se figur 3). Til diagnosticering af thyreoideasygdomme anvendes analyse af TSH og t4, t3 (total eller frit), og antistof rettet mod t3 og t4 (6) (1) (8). Figur 3: Udredningen af thyreoidea sygdomme foregår ved, at man først starter med at få målt patientens TSH. Hvis værdien viser sig være forhøjet eller for lav, bliver der målt t4. Er den til gengæld normal mens TSH var høj, måles der t3 (1). 7
Analyse princip ADVIA Centaur XP ADVIA Centaur XPT er et fuldautomatisk apparatur som kan udføre rutiner og specialiserede tests. Den kan køre op til 240 tests i timen. Efter at prøvematerialerne er sat på båndet (se figur 4, 17), vil de, sammen med reagenserne blive afpipetteret i kuvette, som er placeret i inkubationsringen (se figur 4, 3). Inkubationstiderne varierer for de enkelte assays med op til 8 min. Der sidder en magnet i inkubationsringsystemet, som sørger for, at holde fast på paramagnetiskepartikler, under vask af kuvetten (se figur 4, 9). Tilsætning af syre, base, Figur 4: Skematisk opbygning af Centaur XPT vaskesystem og aflæsning af fotometer foregår alt sammen i denne ring (se figur 4, 3). Apparaturet er tilkoblet til et softwaresystem, som styrer hele processen (se figur 4, 21). ADVIA Centaur XPT benytter sig af paramagnetiskepartikler og acridiniumester. Paramagnetiskepartikler sørger for, under afvaskning af det overskydende reagens, at holde på det antigen eller antistof, som man måler på i kuvetten. Det er billigt og nemt, da magneten kan genbruges i forhold til coatede brønde eller kuvetter. Acridiniumester udsender lys (ved excitation), når der tilsættes syre og base. Lyssignalet excitation af acridiniumester er kort, og dermed er analysetiden kort. En anden fordel er, at den ikke har betydningen for specificiteten af analysen (bilag 5) (9). Lyssignalet måles i Relative light unit (RLU). Inden en ny analyse eller et nyt reagens-lot tages i brug skal analyserne kalibres. Der følger en masterkurve med hver reagens lot-nr. som skannes ind via softwaresystemet. Ved kalibrering af analyserne på Centaur XPT, foretages der en to-punkts kalibrering, hvor producenten har udvalgt to punkter på masterkurven som skal genfindes ved denne kalibrering, HIG og LOW (bilag 5 og 6). Ved kalibrering fastlægges hvilke koncentrationer som den målte RLU svarer til. Ved anvendelse af et komparativt immunoassay, bliver den målte RLU omvendt eksponentiel med koncentrationen af Tt3 og Tt4 i prøven, dvs. jo støre lysmængde, der måles, jo mindre koncentration af Tt3 og Tt4 (bilag 1, 2 og 6) (10). For at overvåge apparatur og kalibreringer, køres der interne og eksterne kontroller, som minimum analyseres i 2 niveauer (lavt og højt), disse køres hver dag, inden der analyseres patientprøver. Kontrollerne indføres i kontrolkort, hvor de skal falde inden for et acceptabelt kontrolområde (se bilag 7), som ofte er bestemt af Westgard-reglerne (11) (5). Hvis kontrollerne ikke overholder de fastlagte regler, kontrollerer man: Om materialerne er udløbet, om der er udført den nødvendige vedligeholdelse, om man har udført analysen iht. forskriften. Evt. analyseres kontrollen igen, og det kan også være nødvendigt at kalibrere på ny. Hvis det er nødvendigt, kontaktes teknisk support. De eksterne kontroller anvendes til at sammenligne med andre sygehuse(11) (12) (bilag 1, 2og 8). 8
T3-parallel fra fast fase reagenset, som er kovalent bundet til paramagnetiskepartikler og T3 fra patientprøven, konkurrerer om de begrænsede monoklonale anti-t3- antistoffer, som er mærket med acridiniumester. Resultatet på et lavt signal vil være tegn på, at koncentrationen er høj og modsat vil et højt signal vise at koncentrationen på T3 i prøven er lav (se figur 4) (bilag 1 og 2). T4 fra fast fase reagenset, som er kovalent bundet til paramagnetiskepartikler og T4 fra patientprøven, konkurrerer om de begrænsede monoklonale museanti-t4-antistoffer, som er mærket med acridiniumester. Resultatet på et lavt signal vil være tegn på, at koncentrationen er høj og modsat vil et højt signal vise at koncentrationen på T4 i prøven er lav (se figur 4) (bilag 1 og 2). Figur 5: Grafisk beskrivelse af analyse metoden for Tt3 og Tt4 på Centaur XPT 9
Analyse princippet Roche Cobas 8000 Cobas 8000 anvender det samme analyseprincip for henholdsvis Tt3 og Tt4. Der anvendes et kompetitivt princip, hvor specifikt antistof er rettet mod t3 eller t4. Ved hjælp af 8-anilino-1-naphthalen-sulfonsyre(ANS) frigives endogent t3 eller t4, som konkurrerer med biotinylerede t3 eller t4-derivater om bindingspladserne på de rutheniumkompleksmærkede anti-t3 eller -t4 (bilag 3 og 4). Plasma og serum Serum fremstilles ved at lade blodet i prøve-røret koagulere efter prøvetagning. Koagulationen opbruger koagulationsfaktorerne og danner et clot, som består af fibrin og blodcellerne. Ved centrifugering adskilles clotet fra serum (13). Plasma fremstilles ved at benytte prøve-rør tilsat antikoagulans. Det kan være Li-heparin, K-ETDA, Na-citrat eller flere andre. Fælles for alle antikoagulanser er, at de forhindrer blodet i at koagulere. I nogle tilfælde kan man genstarte koagulationsprocessen. Ved centrifugering adskilles plasmaet fra blodcellerne. (13) Til udførsel af forsøgene i denne opgave blev der anvendt Li-heparin plasma. Li-heparin stanser koagulationen ved at øge antitrombin III s virkning og desuden hæmmer enzymet ALP (14). Forskellen mellem serum og plasma er således, om der er koagulationsfaktorer og fibrin til stede eller ej (13). Der kan dog godt forekomme fibrin i plasmaprøver, hvis prøve-rørene ikke er korrekt fyldt eller henstår mere end 2 timer uden at bliver centrifugeret efter prøvetagning(15). Også nedfrysning kan resultere i dannelse af fibrin i plasmaprøver(13). 10
Interferens i immunoassays Interferens i et immunoassay er defineret som effekt af en substans i prøven, der ændrer resultatet, sædvanligvis koncentrationen eller følsomheden for analysen. Substanser som kan forårsage interferens, kan findes i prøver fra både raske og syge patienter.(16) Interferens kan enten give positiv interferens, hvor analyseresultatet vil blive falsk forhøjet, eller negativ interferens, hvor resultatet bliver falsk for lavt(16). Der er mange forskellige ting som kan være årsag til interferens. Årsagerne inddeles i to grupper, analyt afhængige og analyt uafhængig(16). Analyt afhængig interferens er når der er en reaktion mellem komponenter i prøven, det kan være tilstedeværelse af heterofile antistoffer, human anti-animal-antistoffer, auto-analyt antistoffer, rheumatoid faktor og andre proteiner(16). Analyt uafhængig interferens er interferens forårsaget af hæmolyse, ikterus og lipæmi, samt antikoagulans og prøveopbevaring (16). Hvor kraftig interferensen er, afhænger af koncentrationen af de stoffer, som forårsager interferensen, men det er ikke nødvendigvis direkte proportionalt. Interferens resulterer ofte i afvigende resultater ved sammenligning mellem immunoassay metoder(16). Oplyste interferensgrænser for analyserne af Tt3 og Tt4 på Centaur XPT fra Siemens Serum prøver som er, Har en ubetydelig effekt på analyserne op til Enhed Tt3 Tt4 Hæmolyserede 250 500 mg/dl Lipæmiske 1000 1000 mg/dl Ikteriske 20 20 mg/dl Skema 1: Oversigt over interferensgrænser forsaget af hæmolyse, lipæmi og ikterus (HIL) (bilag 1 og 2) Heterofile antistoffer kan interferer med analyserne af Tt3 og Tt4, da de kan reagere med reagensimmunglobulinerne (se bilag 1 og 2). Det krampestillende medikament fenytoin kan interferer i analyserne af Tt4 ved at konkurrere om bindingsstederne på TBG (se bilag 2). 11
Materialer Apparatur Siemens ADVIA Centaur XPT Roche Cobas 8000 Reagenser Siemens ADVIA Centaur XPT Reagens pakke T3 og T4, som begge indeholder: 1. Lite-reagens, som er monoklonalt T3-antistof fra mus mærket med acridiniumester 2. Solid-phase-reagens, som er T3-parallel kovalent bundet til paramagnetiskepartikler Ancillary, hjælpe reagens til T3/T4/VB12 Syre/Base reagens til visualisering Wash til rens af maskinen Cleaning solution Reagenser Lot-nr. Ref-nr. Firma Fremstilling Opbevaringsste d/opbevaringst emperatur/hold barhed Holdbarhed efter åbning/på apparaturet T3 reagens 80 tests 59428193 04779671 Siemens Brugsklar (vend grundigt inden påsætning) Kølerum 28/ 2-8 C o / se datoen på indpakning 28 dage på apparatur T4 reagens 100 tests 46038170 & 77542172 08074354 Siemens Brugsklar (vend grundigt inden påsætning) Kølerum 28/ 2-8 C o / se datoen på indpakning 4 dage på apparatur Ancillary hjælpe reagens T3/T4/VB1 2 70880 03644012 (110328) Siemens Klar til brug Kølerum 28/ 2-8 C o / se datoen på indpakning 14 dage på apparatur Acidreagent 6A069 03852677 (112219) Siemens Klar til brug Skab ved Cobas /Stuetemperatu r/se indpakning Base- Reagent 6A070 03852677 (112219) Siemens Klar til brug Skab ved Cobas /Stuetemperatu r/se indpakning 12
Wash 1 754398 0405618 Siemens Klar til brug Skab ved Cobas /Stuetemperatu r/se indpakning Cleansolution 754392 09908593 (112748) Siemens Fortyndes med demineralise ret vand Kølerum 28/ 2-8 C o / se datoen på indpakning Skema 2: Viser en oversigt over anvendte reagenser på Centaur XPT (bilag 1 og 2) Reagenser Roche Cobas 8000 Reagenspakke til T3 og T4, som begge indeholder 3 reagenser Reagens M Reagens 1 Reagens 2 Firma Holdbarhed uåbnet/opb evaringstemperatur Holdbarhed åbnet/ temperatur Holdbarhed på apparaturet T3 Reagens Streptavidincoatede mikropartikler Polyklonalt anti-t3-antistof (får) mærket med et rutheniumkompleks Biotinyleret T3 Roche Se indpakning/ 2-8 C o 12 uger / 2-8 C o 8 uger T4 Reagens Streptavidincoatede mikropartikler Polyklonalt anti-t4-antistof (får) mærket med et rutheniumkompleks Biotinyleret T4 Roche Se indpakning/ 2-8 C o Skema 3: Viser en oversigt over reagenser anvendt på Cobas 8000 (bilag 3 og 4) 12 uger / 2-8 C o 8 uger 13
Kalibrator Reagenser Lot-nr. Ref-nr. Firma Opbevaringssted/opbevaringstemperatur/hold barhed Kalibrator A Hig CA89 04800646 Siemens Kølerum 28/ 2-8 C o / se datoen på indpakning Kalibrator A Low CA89 04800646 Siemens Kølerum 28/ 2-8 C o / se datoen på indpakning Skema 4: Viser en oversigt over anvendte kalibratorer (bilag 6) Fremstilling Det frysetørrede materiale opløses med 5,0 ml demineraliseret vand. Henstå i 15-20 min. Vendes forsigtigt til indholdet er homogent Udportioneres i 2 ml sarsted rør (bilag 6) Mængde Opbevaringssted/opbevaringstemperatur Holdbarhed på apparaturet 400 µl Fryser 7, lab. 7/ - 80 C o 4 timer Skema 5: Opbevaring af kalibratorer (bilag 6) Anvendelse Tages ud af fryseren en halv time før anvendelse, vendes grundigt inden påsætning. 14
Kontroller HK12 Biokemi Human langtidskontrol fremstillet af frysetørret humant serum for DEKS af Aalto Scientific, CA, USA. HK11 human 1000 donor pool, serum, intern kontrol fremstillet til KBA Hjørring. Liquid Assayed Multiqual level 1 & 3 Kontroller Lot-nr. Firma Materiale Opbevaringssted/o pbevaringstemper atur/holdbarhed Opbevaringssted/opb evaringstemperatur/h oldbarhed i anvendelse Kontrol HK12 120028 AA DEKS Frysetørr et humant serum Fryser 12, lab 7/-20 C o /se indpakning Køleskab 6, lab 7/ 2-8 C o / 7 dage Kontrol HK11 1000 donor pool, serum Fryser 12, lab 7/-20 C o /flere år Køleskab 6, lab 7/ 2-8 C o / 7 dage Liquid Assayed Multiqual Level 1 45701v BIO-RAD Humant serum Fryser 12, lab 7/-20 C o /se indpakning Køleskab 6, lab 7/ 2-8 C o / 5 dage Liquid Assayed Multiqual Level 3 45703v BIO-RAD Humant serum Fryser 12, lab 7/-20 C o /se indpakning Skema 6: Viser en oversigt over de anvendte kontroller (17) (bilag 8) Fremstilling HK12 HK12 tages ud at fryser og henstilles ved stuetemperatur i 5-10 min. Proppen fjernes forsigtigt Glasset anbringes på vægten, der 0-stilles. Der afpipetteres 5,00 ml 4 C o sterilt H2O (4,98-5,02g H2O) Proppen sættes i, låget skrues på og glasset pakkes ind i stanniol. Glasset anbringes i vendeapparat i ca. 30 min. (17) Køleskab 6, lab 7/ 2-8 C o / 5 dage Anvendelse HK12 og HK11 Afpipetter 500 µl i Siemens sampel Cups Anvendelse Liquid Assayed Multiqual level 1 og 3 Udtages af fryser og anbring på vendeapparat ca. 30 min. Afpipetter 500 µl i Siemens sampel Cups 15
Prøverør Type Lot-nr. Producent 4 ml Li-Heparin plasma-rør 6040833 BD Vacutainer 6 ml Clot activator serum-rør 5352685 BD Vacutainer Skema 7: Viser en oversigt over anvendte prøve-rør Prøvemateriale Patient serum og patient Li-heparin plasma indsamlet på Regionshospitalet Nordjylland, samt patient Liheparin plasma indsamlet på Regionshospitalet Horsens. Utensilier 2 ml Sarstedt rør 2 ml Sarstedt rør låg Forsendelsesrør Hvide propper med sort inder ring Utensilier til Siemens Centaur XPT Produkt Producent Ref-nr. Sampel Cups Siemens 10309545 (078-k137-01) Kuvetter Siemens 10309546 (078-k138-01) Pipettespidser Siemens 10309547 (07413317) Skema 8: Viser en oversigt over anvendte utensilier på Centaur XPT Andre apparaturer Eppendorf Centrifuge 5702R nr. 1 og nr. 2 Program 1, (10 min, 20c, 2,2 rcf) Køleskab nr. 12 og 6, + 2-8 C o Kølerum nr. 28, + 2-8 C o Fryser nr. 7, -80 C o Fryser nr. 6, -20 C o Zebra GK420d (stregkode maskine) Zebra KDU Plus (stregkode maskine) Pipetter Thermo scientific 100-1000ul Eppendorf Multipipette plus Eppendorf 2,5ml 1=50ul 16
Metode Etiske overvejelse I forbindelse med plasma vs. serum-forsøget, blev der under den almindelige prøvetagning taget to ekstra rør, hvis patienterne indvilligede. Patienterne blev oplyst om, at disse prøver, ligesom alle andre _ patientprøver anvendt i projektet, blev behandlet anonymt. Anvendt referenceinterval for Tt3 of Tt4 Tt3 Tt4 1 mdr. - 6 år: 1,3-4,0 nmol/l 68-200 nmol/l 6 år - 18 år: 1,3-3,4 nmol/l 68-185 nmol/l > 18 år: 1,1-2,5 nmol/l 60-140 nmol/l Skema 9: Viser det anvendte referenceinterval (18) (19) Søgestrategi Den anvendte søgestrategi findes i bilag 9 17
Metodesammenligning Design og indsamling af prøver Metodesammenligning anvendes til at vurdere, om et nyt apparatur (Centaur XPT) måler samme koncentration som reference-apparaturet (Cobas 8000). Det antages at værdier målt på referenceapparaturet er sande (3) (11). Til metodesammenligning af analyserne af Tt3 og Tt4, var det nødvendigt at måle på patientprøver med henholdsvis lave, normale og høje værdier. Dette gøres ved at indsamle patientprøver fra Regions Hospitalet Nordjylland og de praktiserende læger, som både analyseres på Siemens Centaur XPT KBA Hjørring og på Cobas 8000 KBA Aalborg. Prøverne blev centrifugeret ved program 1, (10 min, 20 C o, 2200 G), og plasmaet afpipetteres til forsendelsesrør med samme prøvenummer. Inden prøverne blev sendt til KBA Aalborg, blev koncentrationen af Tt3 og Tt4 målt på Centaur XPT. Efter analyse på Cobas 8000 på KBA Aalborg, blev resultaterne fundet ved opslag i Labka II. Ekstraprøver Ud over de ovenstående patientprøver, blev også 13 patientprøver i Li-heparin rør, indsamlet på KBA Horsens (se metodeafsnittet til intermediær præcision), anvendt til metodesammenligning. De blev anvendt for at opnå resultater med værdier uden for referenceintervallet. Prøverne havde været opbevaret ved -80 C o og blev inden analyse, optøet, opblandet, centrifugeret og afpipetteret over i nye forsendesrør, pga. fibrindannelse. Inden prøverne blev sendt til KBA Aalborg, blev koncentrationen af Tt3 og Tt4 analyseret på Centaur XPT. De indsamlede prøvers fordeling Over en periode på 3 uger, blev der indsamlet 88 patientprøver i Li-heparin rør, inklusiv ekstraprøverne, de fordelte sig: 52 prøver i normalområdet, målt på begge apparaturer, Tt3 1,1-2,5 nmol/l og Tt4 60-140 nmol/l 7 prøver med høje værdier af Tt3, målt på begge apparaturer, Tt3> 2,5 nmol/l 7 prøver med høje værdier af Tt4, målt på begge apparaturer, Tt4> 140 nmol/l 8 prøver med lave værdier af Tt3, målt på begge apparaturer, Tt3 <1,1 nmol/l 2 prøver med lave værdier af Tt4, målt på begge apparaturer, Tt4 <60 nmol/l Derudover var der også 12 prøver, hvor der kun på et af apparaterne blev målt koncentrationer uden for referenceintervallet. Resultatbehandling Resultaterne vurderes ved hjælp af en Bland-Altman plot, hvor det vurderes, om en eventuel forskel har klinisk relevans ved anvendelse af analyseresultaterne for Tt3 og Tt4. 18
Intermediær præcision Design og indsamling af prøver Intermediær præcision anvendes til at bestemme apparaturets (Centaur XPT), samlede analyseusikkerhed over en periode. I denne usikkerhed inkluder usikkerhedsfaktorer, som skiftende personale, reagensskift, forskellige tidspunkter for analysen m.m. Til bestemmelse af intermediær præcision måles koncentrationen af Tt3 og Tt4 mindst 20 gange, på patientplasma (3) (11). Til bestemmelse af intermediær præcision fremstilles pools med høje, normale og lave koncentrationer (konc.) af Tt3 og Tt4. Normal konc. af Tt3 1,1-2,5 nmol/l og Tt4 60-140 nmol Lav konc. af Tt3, konc. <1,1 nmol/l Høj konc. af Tt3, konc. >2,5 nmol/l Lav konc.af Tt4, konc. <60 nmol/l Høj konc. af Tt4, konc. >140 nmol/l For at få prøvemateriale nok til fremstilling af pools med høje og lave koncentrationer, blev der indsamlet patient-li-heparin-plasmaprøvemateriale på KBA Regionshospitalet Horsens. Plasmaprøverne blev indsamlet over en periode på 14 dage, en måned inden bachelorprojektets start. På KBA Horsens måles der Ft3 og Ft4. Under indsamling blev de prøver, som havde en koncentration uden for referenceintervallet for Ft3 og Ft4 udvalgt (8). Referenceintervallet for Ft3 = 3,9-6,7 pmol/l Referenceintervaller for Ft4 = 10-26 pmol/l De udvalgte prøver blev afpipetteret, og delt i to forsendelsesrør, med ca. 1 ml i hvert rør, og frosset ved - 80 C o. Ud fra procentdelen som Ft3 og Ft4 udgør af den totale koncentration, og den målefrie koncentration, beregnedes den estimerede koncentration af Tt3 og Tt4. Dette tal anvendes til at vurdere, hvilke prøver som, mest sandsynligt, havde koncentrationer som lå uden for referenceværdierne for henholdsvis Tt3 og Tt4 (bilag 10 og 11). Frit t3 udgøre 0,2-0,4 % af den total t3 Frit t4 udgøre 0,03 % af den totale t4 Formlerne til beregning af de estimerede værdier for Tt3 og Tt4: Total t3 nmol/l = ((frit t3 pmol/l x100 %) / (0,3%)) / 1000 Total t4 nmol/l= ((frit t4 pmol/l x100 %) / (0,03%)) / 1000 19
Det resulterede i at der var samlet: 20 prøver med en estimeret lav koncentration af Tt3, konc. <1,1 nmol/l 9 prøver med en estimeret høj koncentration af Tt3, konc. >2,5 nmol/l 14 prøver med en estimeret lav koncentration af Tt4, konc. <60 nmol/l 2 prøver med en estimeret høj koncentration af Tt4, konc. >140 nmol/l (bilag 12) Det blev vurderet at der skulle anvendes ca. 20 ml prøvemateriale til hver pool, hvis der skulle være et volumen stor nok til mindst 30 analyser. Det blev vurderet, at der ikke var samlet prøvemateriale nok, og derfor blev der taget kontakt til KBA Aalborg, for at få dem til at hjælpe os med at samle Li-heparin-plasmaprøver med koncentrationer uden for referenceintervallet. På KBA Aalborg blev der på 5 dage samlet: 12 prøver med en lav koncentration af Tt3, konc. <1,1 nmol/l 14 prøver med en høj koncentration af Tt3, konc. >2,5 nmol/l 7 prøver med en lav koncentration af Tt4, konc. <60 nmol/l 12 prøver med en høj koncentration af Tt4, konc. >140 nmol/l Til fremstilling af en pool med normal værdi, anvendte vi patient-li-heparin plasmaprøver indsamlet på Regionshospitalet Nordjylland, som også blev anvendt til sammenligning mellem plasma og serum. Alle plasmaprøverne blev opbevaret ved -80 C o inden analyse. Fremstilling af pools Der fremstilles 5 pools: Normal: Tt3 1,1-2,5 nmol/l og Tt4 60-140 nmol Høj Tt3: >2,5 nmol/l Lav Tt3: <1,1 nmol/l Høj Tt4: >140 nmol/l Lac Tt4: <60 nmol/l De 5 pools blev fremstillet ved at optø 15 udvalget prøverør til hver pool (14 til Høj Tt4, da der ikke var flere) Efter optøning blev prøverne til høje og lave pools centrifugeret, grundet fibrindannelse. De blev centrifugeret ved 20 C o, i 10 min, med 2200 G. Der var ingen fibrindannelse i prøverne til normal pool, derfor blev de ikke centrifugeret. Prøverne blev afpipetteret over i 50 ml kolber og blandet grundigt. Herefter blev 400 µl prøvemateriale, til normal pool, og 200 µl prøvemateriale, til høje og lave pools udportionering i 200 µl sarstedsrør, hvorefter de igen blev frosset ved -80 C o, indtil de skulle analyseres. Ved udportionering blev der taget højde for, den mængde prøvemateriale en analyse på Centaur XPT kræver. 20
Analysering af prøver Inden analysering blev de 5 pools optøet, således at de fik stuetemperatur (ca. ½ time). Inden kørsel blev prøverne mærket med 12 cifrede individuelle nr. Normal: 0420160800 (00-36) Høj Tt3: 0420160500 (00-36) Lav Tt3: 0420160400 (00-36) Høj Tt4: 0420160700 (00-36) Lav Tt4: 0420160600 (00-36) Analyse af pool prøverne, til bestemmelse af intermedier præcision, blev foretaget: 3 gange dagligt (morgen ca. kl. 08:00, middag ca. kl. 12:00 og eftermiddag ca. kl. 15:00) Analyser af poolprøver foregik over en periode på 3 uger. Den første uge blev poolprøverne analyseret fra tirsdag til fredag, den anden uge fra mandag til torsdag og den sidste uge fra mandag til fredag, i alt 13 dag. I alt blev poolprøverne analyseret 39 gange. Resultatbehandling Der beregnes en CV% for de enkelte pools, som vurderes i forhold til en intermedier præcisions CV% fundet på http://www.westgard.com/, som er et international kvalitetskontrol firma (5). 21
Tt3 og Tt4 i Plasma vs. Serum Design og indsamling af prøver For at vurdere om der var forskel mellem analyseresultater på Centaur XPT, når koncentrationen af Tt3 og Tt4 blev målt på plasma frem for serum, blev der analyseret patient-li-heparin-plasmaprøver og serumprøver fra samme patient. Til sammenligning af analysen af Tt3 og Tt4, i hhv. plasma og serum, blev der af bioanalytikeren på ambulatoriet på Regionshospital Nordjylland Hjørring taget to ekstra rør på patienter, der i forvejen skulle have taget blodprøver. Der blev ikke gjort overvejelse over stikprøverne så som køn, alder mm. Til serumprøver blev der taget et clot activator serum-rør (rør med rød prop), og til plasma blev der taget et li-heparin-rør (rør med grøn prop) I alt tog vi 25 serum-rør og 25 plasma-rør, som var det antal det blev vurderet, at der var mulighed for at samle i løbet af en dag, samt analyseret i én omgang, så tidsforskel og reagensskift blev undgået. Prøve-rørene blev mærket med unikke 12 cifrede numre. Plasma rør fik numrene mellem 000000000201 og 000000000225. Serum rør fik numrene mellem 000000000301 og 000000000325. Således at 201 og 301 var taget på samme patient. Efter prøvetagning henstilles begge prøverør i 60 min ved stuetemperatur, for at serumprøven kan nå at koagulere. Efterfølgende blev prøverne centrifugeret ved 20 c, i Program 1, (10 min, 20 C o, 2200 G) og afpipetteret i forsendelsesrør med samme numre, som den oprindelige prøve. De indsamlede prøver blev opbevaret ved stuetemperatur indtil analyse, hvor Tt3 og Tt4 har en holdbarhed på 1 døgn (8) Prøverne blev analyseret på Siemens Centaur XPT samme dag, som de blev indsamlet. Resultatbehandling Resultaterne vurderes ved hjælp af en Bland-Altman plot, hvor det vurderes om en eventuel forskel, har klinisk relevans ved anvendelse af analyseresultaterne for Tt3 og Tt4. 22
Resultater Metodesammenligning Bland-Altman plottene viser den procentvise forskel mellem målinger af henholdsvis Tt3 og Tt4 på den samme patientprøve, foretaget på Centaur XPT og Cobas 8000 På nedenstående differensplots er analyseresultaterne for de enkelte prøver vist som grønne mærker. Nuldifferencen er vist som en lys blå streg og de røde stiplede linjer marker Total Error Allowed (TEA). Ved metodesammenligning mellem Centaur XPT og Cobas 8000 blev der generelt målt lavere koncentrationer af Tt3 og Tt4 på Centaur XPT, hvilket resulterer i en generel negativ differens. Der var dog enkelte prøver, hvor koncentrationen af Tt3 og Tt4 var højere, når de blev analyseret på Cobas 8000. Den procentvise differens mellem analyserne af prøve på Centaur XPT og Cobas er meget forskellig. Ved analyse af Tt3 var den procentvise differens fra +2% til -35%, men der ses ikke noget klart mønster i differencen (noter i statistik). TEA for Tt3 er +/-9,22%. Der var kun 17 ud af 86 analyser af Tt3 der overholder TEA. Ved analyse af Tt4 var der stor forskel på den procentvise differens, +13% og -45% og igen var der ikke et klart mønster (noter i statistik). TEA for Tt4 er +/-7,00%. Der var kun 37 ud af 86 analyser som overholder TEA. Rådata til metodesammenligning findes i bilag 13 23
Differens: Centarur XPT - cobas 8000 i % Differens: Centarur XPT - cobas 8000 i % Metodesammenligning Tt3 20,00 10,00 0,00-10,00 0 1 2 3 4 5 6 7 8-20,00-30,00-40,00 Middel af konc. Tt3 mellem centaur XPT og cobas 8000 nmol/l Figur 6: Bland-Altman plot som viser de opnåede resultater for Tt3 ved metodesammenligning mellem Centaur XPT og Cobas 8000. Metodesammenligning Tt4 20,00 10,00 0,00-10,00 0 50 100 150 200-20,00-30,00-40,00-50,00 Middel af konc. Tt4 mellem centaur XPT og cobas 8000 nmol/l Figur 7: Bland-Altman plot som viser de opnåede resultater for Tt4 ved metodesammenligning mellem Centaur XPT og Cobas 8000. 24
Intermediær præcision Ud fra 39 målinger på de 5 pools beregnes en intermediær præcision for hver enkelt pool, henholdsvis Normal, Tt3 høj, Tt3 lav, Tt4 Høj og Tt4 lav. Pool Normal Høj Lav Tt3 Tt4 Tt3 Tt4 Tt3 Tt4 CV % 8,21 6,24 6,54 6,26 13,54 9,87 Skema 10: Opnået CV% CV% for de enkelte pools sammenlignes med den ønskelige intermediær præcision CV%, der for serum Tt3 er 3,45% og for serum Tt4 er 2,5% (5). Rådata til intermediær præcision findes i bilag 14 25
Differens mellem plasma og serum i % Differns mellem plasma og serum i % Plasma vs. Serum Bland-Altman plottene viser den procentvise forskel mellem målinger af henholdsvis Tt3 og Tt4 på plasma og serum prøver fra samme patient, foretaget på Centaur XPT. Analyseresultaterne for de enkelte prøver vises som blå mærker. Alle differenser er negative. Den røde stiplede linjer marker Total Error Allowed (TEA), som er den procentvise afvigelse, som der max må være mellem to målinger på prøver fra samme patient, her er kun vist den negative TEA (5). For Tt3 må der max være en afvigelse på -9,22% og for Tt4 må afvigelsen max være på -7,00%. Rådata til plasma vs. Serum findes i bilag 15. Plasma vs. serum Tt3 0,00 0,5-2,00 1 1,5 2 2,5 3-4,00-6,00-8,00-10,00-12,00-14,00 Middelværdi mellem plasma og serum nmol/l Figur 8: Opnåede resultater for Tt3 ved sammenligning mellem plasma og serum på Centaur XPT Plasma vs. serum Tt4 0,00 60 70 80 90 100 110 120 130 140-5,00-10,00-15,00-20,00 Middeværdi mellem plasma og serum nmol/l Figur 9: Opnåede resultater for Tt4 ved sammenligning mellem plasma og serum på Centaur XPT 26
Diskussion Ved metodesammenligning var der store differencer mellem analyserne foretaget på Centaur XPT og Cobas 8000. Desuden er variationen af differencerne tilfældig (figur 6 og 7), ved vurdering af et Bland-Altman plot vurderer man bla. om der er et mønster i variationen, som kan indikere om variationen er koncentrationsafhængig (11). Kun ved sammenligningen af analysen af Tt4 på de to apparaturer, ser det ud som om der kunne være tendens til at variationen måske er koncentrationsafhængig (figur 7). Til metodesammenligning blev der indsamlet patientprøver, som ideelt skulle have koncentrationer, der dækkede hele analysemetodens måleområde, men det viste sig vanskeligt at finde prøver med høje og lave værdier for både Tt3 og Tt4. Vi forsøgte at modvirke dette ved at indsamle patientprøver med høje og lave koncentrationer forud for forsøgsperioden og desuden få hjælp af KBA Aalborg til at indsamle yderlige patientprøver under forsøgsperioden. Grundet manglen på prøver i yderområderne af måleområdet, er vurderingen af disse områder lidt svagere. Vi vurderer dog, at der ikke er en mindre differens mellem analyserne på Centaur XPT og Cobas 8000 i yderområderne. Grundet de få prøver i yderområderne af måleområdet, er det heller ikke muligt, at sige med sikkerhed, om variationen er koncentrations afhængig ved analysen af Tt4. Klinisk vil man ikke kunne anvende resultater analyseret på Li-heparin-plasma på Centaur XPT på KBA Hjørring, fordi de fleste af differencerne overskrider TEA og variationen er tilfældig (3) (11). I den del af forsøget, hvor analyseresultater på henholdsvis plasma og serum blev sammenlignet, var der også store differencer mellem analyseresultaterne. Der er en klar tendens til at der blev målt højere koncentrationer på serumprøverne. Der er dog også stor tilfældig variation i differencerne mellem analyserne. Da de fleste af differencerne overskrider TEA må det vurderes at forskellen mellem analyserne har klinisk relevans (figur 8 og 9). Da differencerne er store og varierer så meget og tilfældigt i såvel metodesammenligning og sammenligning mellem plasma og serum, mistænkes det, at der måske er noget i Li-heparin-plasma-prøver, som interfererer med analyserne af Tt3 og Tt4 på Centaur XPT. Hvis man går ud fra at interferensen stammer fra valget af prøvemateriale, kan det f.eks. være selve antikoagulansen eller koagulationsfaktorer, som stadig findes i plasma, der er årsag til interferensen. Begge dele er kendt for at kunne skabe interferens i immunoassays (16) (20). Hvis antikoagulanten var årsag til interferensen, burde differencen mellem analyseresultaterne være en konstant. Der ville således have været den samme procentvise differens mellem alle analyseresultaterne. Vores resultater viser ikke en konstant differens, der er i stedet stor forskel (se figur 6 til 9). Dette peger på, at det ikke er selve antikoagulanten, som er årsag til interferensen. Dette understøttes også af bestemmelse af intermediær præcision. Denne blev bestemt gennem analyse af 5 pools, fremstillet af Li-heparin-plasma. Ved analysen af pools er det i princippet den samme prøve, som analyseres mange gange. For at opnå samme resultat, bør det derfor ikke have betydning, at poolprøverne er fremstillet af plasma, frem for serum. Mængden af antikoagulans vil også have været den samme ved alle analyserne af de 5 pools og skulle således ikke være årsag til variation, uanset om det har interfereret med analysen. På trods af dette var der stor variation i de analyseresultater, som vi opnåede, og det resulterer i at den intermediær præcision ikke lever op til kravene fra Westgard, som er en CV% for Tt3, der ikke overskrider 3,45%, og for Tt4 en CV% på under 2,5% (5). 27
Hvis årsagen til den store difference i analyseresultaterne ikke er antikoagulanten kan det muligvis have været koagulationsfaktorer. Fordi en plasmaprøve indeholder antikoagulans, er de cellulære bestanddele ikke fanget i et koagel, som under den normale koagulationsproces i en serumprøve. Efter centrifugering kan plasmaprøver stadig indeholde spormængder af cellulært materiale, såvel som latent fibrin. Disse faktorer kan forårsage uspecifik binding af antistofferne, hvilket fører til fejlagtige resultater. (21). Der var en del fibrindannelse i de frosne li-heparin-plasmaprøver, som blev anvendt til fremstillingen af pools. For at undgå at få fibrinen med over i poolprøverne blev prøverne centrifugeret og afpipetteret, men der kan stadig have været rester af fibrin i nogle af udportioneringerne. Vi valgte ikke at centrifugere poolprøverne efter de var blevet blandet, da vi ikke med det blotte øje kunne se mere fibrin, men hvis der har været fibrinrester i nogle af poolprøverne, kan det have været årsag til interferens og dermed variation i resultaterne og således årsag til, at der er opnået en dårlig intermediær præcision. Hvis fibrin har været årsag til interferensen, giver det også en forklaring på, at der er meget stor forskel på de opnåede analyseresultater både ved metodesammenligning og sammenligning mellem plasma og serum, fordi koncentrationen af fibrin i de anvendte patient li-heparin-plasma prøver vil have været forskellig grundet biologisk variation. Fibrin kan maskere antigen fra patientprøven, som det er beskrevet i artiklen Interferences in Immunoassay (22) således at der ikke kan ske en antigen antistof binding, mellem antigen fra patientprøven og antistof mærket med acridiniumester. Det vil resultere i at en større mængde af det acridiniumester mærkede antistof vil binde sig til antigen kovalent bundet til paramagnetiskepartikler (se figur 10). Dette vil give et større lyssignal, RLU, som vil resulterer i at der måles for lave koncentrationer af Tt3 og Tt4 i plasmapatientprøver, som det også er tilfældet i vores undersøgelse, hvor der måles lavere koncentrationer på plasma i forhold til serum (se figur 8 og 9). Også ved sammenligning af analyser foretaget på Centaur XPT og Cobas 8000 måles der i de fleste tilfælde en lavere koncentration ved analyse på Centaur XPT (se Figur 6 og 7). En anden årsag til at analyser på serum resulterer i højere koncentrationer end analyser foretaget på plasma, kan være at koagulationsaktivator som anvendes i serum-rør. I artiklen 25OHD analogues and Figur 10: Grafisk beskrivelse af analyse metoden for Tt3 og Tt4 på Centaur XPT, hvor nogle af T3 fra patientprøven er maskeret med fibrin. vacuumblood collection tubes dramatically affect the accuracy of automated immunoassays (23) har man undersøgt to forskellige rør. Et Vacuette 4-ml additiv-frit rør og vacuette 4-ml rør med gel og Koagulationsaktivatorer. Alle prøver blev analyseret ved brug af fem immunoassays og LC-MS / MS. Resultater viste, at prøver opsamlet i vacuette 4-ml rør med gel og Koagulationsaktivator udviste tilsyneladende højere værdier end prøver i rør uden tilsætningsstoffer. Årsagerne til disse observationer er ikke helt forstået. Det er muligt, at Koagulationsaktivator, adskillende gel, eller nogle andre elementer i 28
vacuette 4-ml røret med gel og Koagulationsaktivator er med til at øge ikke-specifik krydsreaktivitet mellem magnetisk partikel-mærkede antistoffer og acridiniumester, hvilket har ført til øget kemiluminescensværdier. De fleste af de patientprøver, der anvendes i forsøget viste normale Tt3 og Tt4 værdier. Dog kender vi ikke patienternes øvrige sygdomshistorier. Dette kunne være relevant, idet forskellige sygdomme kan medføre interferens i patientprøver. Det er for eksempel påvist i artiklen Negative Interference by Rheumatoid Factor of Plasma B-Type Natriuretic Peptide in Chemiluminescent Microparticle Immunoassays (24), at nogle autoimmune antistoffer, bl.a. rheumatoid faktor (RF) ved rheumatoid artritis, kan give interferens på målinger af B-type natriuretic peptide (BNP). I samme artikel påvises desuden, at andre potentielt endogene interfererende substanser kan være til stede. I en anden artikel Negative interference by rheumatoid factor in alpha- fetoprotein chemiluminescent microparticle immunoassay (25), baseret på et forsøg, hvor Kemiluminescens metoden anvendes til at måle på mængden af alpha- fetoprotein (AFP) i serum-patientprøver, ses bl.a., at tilstedeværelsen af rheumatoid faktor (RF) er årsag til negativinterferens, som derfor medfører falsk lave resultater. Ligeledes er det kendt, at autoantistoffer kan give interferens på både fri og total T3 og T4 målinger(16). På samme vis kan man forestille sig, at de lavere målte værdier i vores forsøg kan skyldes, at patienterne kan have haft andre sygdomme. En anden årsag til den dårlige intermediære præcision, kan have været usikkerhed på kontrollerne (se bilag 7). Da analysen af Tt3 og Tt4 er nye analyser, var der ikke etableret kontrolkort, før påbegyndelsen af forsøget. Under forsøget blev 4 kontroller analyseret, og ud fra resultaterne, blev der efter forsøget etableret kontrolkort (bilag 7). Først efter vi havde indsamlet alle data, blev det muligt at undersøge om kontrollerne havde overholdt Westgard reglerne (bilag 7). Dette er en stor usikkerhedsfaktorer, da der var dage hvor kontrollerne ikke havde overholdt Westgard reglerne. For at opklare om de dage hvor kontrollerne ikke overholdt Westgard reglerne havde haft indflydelse på resultaterne, især den intermediær præcision, blev der beregnet en intermediær præcision, hvor analyseresultaterne af pools fra dage med kontroller som ikke overholder Westgard reglerne blev udeladt. Ved denne udelukkelse anvendes Westgard reglerne 1:3SD (Hvis en måling ligger mere end 3 standardafvigelser fra middelværdien, skal kontrollen forkastes) og 2:2SD (Hvis 2 på hinanden følgende målinger ligger 2 standardafvigelser fra middelværdien, skal kontrollen forkastes). (bilag 7) Denne udelukkelse resulterede i, at der kun var 18 analyser af pools, som var analyseret på dage hvor kontrollerne overholdt de foreliggende regler. Resultatet af fravalget resulterede dog ikke i en bedre intermediær præcision, tværtimod (se skema 11). Dette understøtter igen at der muligvis er en interferens ved anvendelse af plasmaprøver til analyserne Tt3 og Tt4 på Centaur XPT, og at interferensen er forskellig, også selv om det er den samme prøve, som analyseres gentagne gange. Pool Normal Høj Lav Tt3 Tt4 Tt3 Tt4 Tt3 Tt4 CV % 9,5 5,4 7,9 8,7 16,4 12,8 Skema 11: Opnået CV% hvor kontroller som ikke overholder Westgard reglerne er udelukket. Dage hvor kontrollerne ikke overholdt de foreliggende regler, kan også have været medvirkende årsag til at der er stor differens mellem analyser foretaget på, Centaur XPT og Cobas 8000 i metodesammenligningsforsøget. Men da vi inden forsøgsstart foretog et pilotforsøg, hvor der blev analyseret 20 plasma- 29
patientprøver på samme dag og samme tid, fik vi et resultat der ligner resultatet som vi opnåede ved metode sammenligning, kan kontrollerne ikke have haft betydning det overordnede billede, (se bilag 16). Hvis man vælger at analysere ved brug af serumprøver, får man den reneste prøve set fra interferens side. De er mere stabile og det betragtes som den gyldne standard for analyser. Til gengæld bliver der problemer med at kunne behandle prøven i tide. Siden man ikke kan analysere hasteprøver lige efter prøvetagning. Plasmaprøver er blevet den foretrukne prøvetype og er den er meget udbredt, siden det giver den bedste mulighed for at opnå den ønskede svartid, men til gengæld, som vi har oplevet, medfører det risiko for interferens, som man skal tage højde for og som der skal kontrolleres(20), den interferens som vi ser ved analysen af Tt3 og Tt4 på Li-heparin-plasma på Centaur XPT er dog tilfældig og derfor svær at tage højde for og kontrollere. Perspektivering Da KBA Hjørring ikke påtænker at tage analyserne, Tt3 og Tt4 hjem med mindre analysen kan foretages på plasma, var det ikke relevant at undersøge om Centaur XPT og Cobas var sammenlignelige, hvis det var serum som blev anvendt som prøvemateriale. Men eftersom resultaterne af vores forsøg peger på, at det ikke kan lade sig gøre at anvende plasma som prøvemateriale til analysen af Tt3 og Tt4 på Centaur XPT, mener vi at det kunne være interessant, at undersøge om Centaur XPT og Cobas 8000 er sammenlignelige, hvis det anvendte prøvemateriale var serum. Vi ved at producenten Siemens har testet analyserne ved brug af serum og at det er det prøvemateriale, der anbefales til analysen. Det kunne være interessant at lave nogle bekræftende forsøg, også for at sammenligne med vores resultater. Det kunne muligvis også være med til at opklare, hvad der forårsager interferensen, og om det er interferens der er årsag til de afvigende resultater vi har opnået. I tilføjelse til dette kunne det være en mulighed at undersøge hvilken intermediær præcision det var muligt at opnå hvis man anvendte kontrollerne eller serum pools som prøvemateriale. En anden måde at undersøge hvad der muligvis er årsag til interferensen er at anvende Citrat-plasma som prøvemateriale. Citrat-plasma anvendes normalt til koagulationsanalyser, da koagulationsprocessen kan genstartes hvis der tilsættes calcium til prøven. Calcium er det man kalder en Co-faktor i koagulations processen. Citrat binder calcium i blodprøven, men hvis der efterfølgende tilsættes mere calcium end citrat kan binde, vil koagulations processen genstarte (26) (14). Dette vil kunne udnyttes til at undersøge om det er koagulationsfaktorer som er årsag til interferens. Ved først at analysere koncentrationen af Tt3 og Tt4 på citat-plasmaprøver, herefter tilsættes calcium til prøverne og derved genstartes koagulationen, for efterfølgende at analysere Tt3 og Tt4 på det omdannede serum. Ved denne metode har man undersøgt evt. forskel i den fundne koncentration på den samme prøve. Denne måde at undersøge forskelle mellem analyser foretaget på henholdsvis plasma og serum, minder meget om det vi gjorde ved at tage serum og plasmaprøver fra samme patient og holde disse resultater op mod hinanden. Ideen med at anvende citatplasma og ænder det til serum, ved at tilsætte calcium, har vi fra en af underviserne på KBA Hjørring, som er ved at undersøge om Centaur XPT kan anvendes til analyse af D-vitamin. 30