Vejledere. Af Sara Sass Majlund (175846) Antal tegn: Bioanalytikerunderviser Dorte Paulmann, Lektor Turi Neubauer,

Transkript

1 Vurdering af Sensititre YeastOne, EUCAST bouillonfortynding og screenings azolagar til hhv. resistensbestemmelse og screening for nedsat azolfølsomhed hos Aspergillus spp. Af Sara Sass Majlund (175846) Antal tegn: Vejledere Bioanalytikerunderviser Dorte Paulmann, Lektor Turi Neubauer,

2 Forord Dette professionsbachelorprojekt er udført på Klinisk Mikrobiologisk afdeling på Aarhus Universitetshospital i foråret Projektet er planlagt i samarbejde med bioanalytikerunderviser Dorte Paulmann og afdelingslæge Jan Berg Gertsen. Der skal lyde en speciel tak til afdelingslæge Jan Berg Gertsen for hans store interesse til dette projekt. Je vil gerne takke ham for hans ekspertise og gode råd samt vejledning, der har været med til at gøre dette projekt muligt. Jeg vil desuden gerne takke mine vejledere Dorte Paulmann og Turi Neubauer for deres meget brugbare og konstruktive vejledning i forbindelse med rapportens udarbejdelse gennem hele projektet. Slutteligt vil jeg gerne takke mine medstuderende Anna Aaberg, Nathalie Holmer Jensen og Dorthe Møller Andersen for et godt samarbejde i forbindelse med projektets udførelse i laboratoriet. 1

3 Resumé Baggrund Forekomsten af resistente Aspergillus spp. stiger, hvorved en hurtig og korrekt resistensbestemmelse kan have stor betydning for patientens morbiditet og mortalitet. På KMA AUH udføres der kun screening for nedsat azolfølsomhed, men afdelingen vil gerne have implementeret metoder til resistensbestemmelse. Herværende projekt undersøger anvendeligheden af Sensititre YeastOne og EUCAST bouillonortynding til resistensbestemmelse samt screenings azolagar til screening for nedsat azolfølsomhed med formålet at vurdere disse til brug på KMA AUH. Metode Til projektet blev to metoder til resistensbestemmelse vurderet; Sensititre YeastOne og EUCAST bouillonfortynding. Screenings azolagar blev desuden vurderet til screening for nedsat azolfølsomhed. 49 Aspergillus spp. isolater samt en intern kvalitetskontrol blev anvendt. Til tolkning af resultaterne blev de aflæsningerne for de tre metoder blev sammenlignet. Resultaterne af den interne kontrol blev desuden vurderet i forhold til opstillede MIC-ranges. Resultater Resultaterne for de 40 Aspergillus fumigatus isolater viste en gennemsnitlig essentiel og kategorisk overensstemmelse mellem Sensititre YeastOne og EUCAST bouillonfortynding på hhv. 35,8 % og 61,7 % i alt. En essentiel overensstemmelser mellem de to metoder for de fire isolater af andre Aspergillus spp. sås i gennemsnit på 41,7 %. Denne overensstemmelse mellem screenings azolagar og Sensititre YeastOne/EUCAST bouillonfortynding sås på hhv. 97,5 % og 93,75 %. Resultaterne for den interne kontrol viste, at 66,6 % og 83,3 % af resultaterne for hhv. Sensititre YeastOne og EUCAST bouillonfortynding lå inden for de fastsatte MIC-ranges. Desuden sås en 100 % overensstemmelse mellem screenings azolagar og de fastsatte SIR-værdier. Konklusion Implementering af ovenstående metoder vil have positive konsekvenser for patienten, idet en hurtig og korrekt screening samt MIC-bestemmelse udføres. Dermed kan patienten hurtigt komme i behandling med det rette antimykotika, hvilket kan øge helbredelseschancerne. Implementeringen vil også have konsekvenser for personalet i form af både negative såsom større arbejdsbyrde, samt positive i form af viden og dermed en udvikling som bioanalytiker. Konklusionen er dog, at metoderne ikke kan implementeres, før disse er grundigt valideret. 2

4 Indhold Forord... 1 Resumé Introduktion Baggrund Formål Problemformulering Målformulering Teori Aspergillus Antimykotika Resistensmekanismer MIC-bestemmelse Screenings azolagar Medie til dyrkning Reagens til præparation af inokulum Materialer Prøvemateriale Materialer Metode Litteratursøgning Indsamling og behandling af prøvematerialer Fremstilling af inokulum Fremgangsmåde og aflæsning Resultatbehandling Resultater Sammenligning af Sentititre YeastOne og EUCAST bouillonfortynding Vurdering af screenings azolagar Aflæsning af A. niger, A. flavus og A. terreus Vurdering af metoder ved anvendelse af intern kvalitetskontrol Diskussion Sammenligning af Sensititre YeastOne med EUCAST bouillonfortynding Screenings azolagar sammenlignet med metoder til resistensbestemmelse

5 6.3 Diskussion af resultater for A. niger, A. flavus og A. terreus Diskussion af intern kvalitetskontrol EUCAST bouillonfortynding som referencemetode Generel egnethed Konklusion Perspektivering Referenceliste Bilag 1... Fejl! Bogmærke er ikke defineret. Speciesoversigt... Fejl! Bogmærke er ikke defineret. Bilag 2... Fejl! Bogmærke er ikke defineret. Udførlig materialeliste... Fejl! Bogmærke er ikke defineret. Bilag 3... Fejl! Bogmærke er ikke defineret. Fremstilling af komponenter til EUCAST bouillonfortynding... Fejl! Bogmærke er ikke defineret. Bilag 4... Fejl! Bogmærke er ikke defineret. Fremstilling af mikrotiterplader til EUCAST bouillonfortynding... Fejl! Bogmærke er ikke defineret. Bilag 5... Fejl! Bogmærke er ikke defineret. Fortynding af antimykotikaopløsning... Fejl! Bogmærke er ikke defineret. Bilag 6... Fejl! Bogmærke er ikke defineret. Rådata til scattergrammer og tilhørende tabeller... Fejl! Bogmærke er ikke defineret. Bilag 7... Fejl! Bogmærke er ikke defineret. Essentiel og kategorisk overensstemmelse... Fejl! Bogmærke er ikke defineret. Bilag 8... Fejl! Bogmærke er ikke defineret. Vurdering af screenings azolagar... Fejl! Bogmærke er ikke defineret. Bilag 9... Fejl! Bogmærke er ikke defineret. Rådata for A. niger, A, flavus og A. terreus... Fejl! Bogmærke er ikke defineret. Bilag Fejl! Bogmærke er ikke defineret. Rådata for intern kontrol, ATCC... Fejl! Bogmærke er ikke defineret. 4

6 1. Introduktion 1.1 Baggrund Azolresistens hos Aspergillus spp. er et spirende globalt problem og er associeret med høje risici for behandlingssvigt med en mortalitetsrate, der nærmer sig 90 %(1)(2). Adskillige studier har inden for det seneste årti rapporteret en øget forekomst af erhvervet azolresistens hos Aspergillus spp. (3). Konservativt estimeres det, at den globale prævalens af azolresistente Aspergillus spp. er 3-6 % (4)(5). På nuværende tidspunkt udføres der enkelte steder i Danmark rutinemæssigt resistensbestemmelse af Aspergillus spp. Klinisk Mikrobiologisk Afdeling Aarhus Universitetshospital (KMA AUH) udfører screening for azolresistens på agarmedier indeholdende de respektive azoler; itraconazol, voriconazol og posaconazol. Metoden anvendes udelukkende til at vurdere, hvorvidt Aspergillus spp. har nedsat følsomhed til ovenstående azoler. I tilfælde af nedsat følsomhed ses vækst, hvorefter isolaterne indsendes til Statens Serum Institut (SSI) til yderligere resistensbestemmelse vha. EUCAST's bouillonfortynding (6). Denne resistensbestemmelse er bekostelig, idet fremsendelsen af isolater til SSI koster KMA AUH i omegnen af 3000 kr. pr. isolat. Dette er også en langsommelig process, idet svartiden kan tage op til en måned. En hurtig resistensbestemmelse er essentiel for patientens mortalitet og morbiditet. Derfor danner projektet grundlag for en eventuel implementering af metoder til resistensbestemmelse i praksis på KMA AUH. Der findes flere metoder, der kan anvendes til resistensbestemmelse af Aspergillus spp. Dette inkluderer bl.a. diskdiffusion, E-test samt flydende MIC-bestemmelser (7). Der er imidlertid udfordringer forbundet med udførelsen og tolkningen, idet sådanne metoder ikke udføres rutinemæssigt. Dette medfører mangel på den ekspertise, der skal til for at opnå reproducerbare resultater (4). Sensititre YeastOne er interessant at beskæftige sig med, da metoden i forvejen er implementeret på KMA AUH i forbindelse med resistensbestemmelse af Candida, samt at udførelsen og aflæsningen er meget brugervenlig. EUCAST bouillonfortynding er ligeså interessant, idet metoden betragtes som guldstandard og er implementeret på SSI. I den forbindelse undersøges Sensititre YeastOne og EUCAST bouillonfortynding Aspergillus spp. kan give anledning til infektion, aspergillose, specielt hos immunsupprimerede patienter eller hos patienter med skadet lungevæv (8). Til behandling af aspergillose er azoler effektive og også førstevalg i den medicinske behandling (8)(9). Et omfattende forbrug af azoler såvel i kliniske sammenhænge som i agrikulturen har været medvirkende til, at den erhvervede 5

7 azolresistens er rapporteret hos patienter, der har været i langvarig azolbehandling såvel hos azolnaive patienter (3)(4)(5). I Danmark er der fra blevet rapporteret tre tilfælde af azolresistent invasiv aspergillose, alle med dødelig udgang, hvoraf to patienter ikke tidligere havde været i azolbehandling (2). Her kan det ikke afvises, at en mulig forbindelse mellem azolresistens hos azolnaive patienter og det omfattende forbrug af azoler i agrikulturen ses (8). Det støtter desuden op om fundet af flere azolresistente Aspergillus spp. i miljøet (4)(8). 1.2 Formål Formålet med dette projekt er at undersøge, hvorvidt SensititreYeastOne, EUCAST bouillonfortynding samt screenings azol-agar egner sig til hhv. resistensbestemmelse og screening for azolresistens hos Aspergillus spp. 1.3 Problemformulering Hvilke konsekvenser har det, for patient og personale, at anvende Sensititre YeastOne, EUCAST bouillonfortynding og screenings azolagar til hhv. resistensbestemmelse og screening for azolresistens hos Aspergillus spp. med henblik på daglig anvendelse på KMA AUH? 1.4 Målformulering Vi vil besvare problemformuleringen ved hjælp af eksisterende viden på området og egne undersøgelser af følgende delmål ved at: - Udføre flydende MIC-bestemmelse vha. Sensititre YeastOne og EUCAST bouillonfortynding på 50 Aspergillus spp. isolater med henblik på resistensbestemmelse. - Sammenligne og vurdere MIC og SIR-værdierne for Sensititre YeastOne og EUCAST bouillonfortynding vha. følgende statistiske metoder og afbildninger: scattergrammer, samt essentiel og kategorisk overensstemmelse. - Vurdere anvendelsen af EUCAST bouillonfortynding som referencemetode - Undersøge, hvorvidt screenings azol-agar er optimal til screening for nedsat følsomhed hos Aspergillus spp. ved at sammenligne resultaterne med SIR-værdierne fra Sensititre YeastOne og EUCAST bouillonfortynding. - Vurdere Screenings azolagar, Sensititre YeastOne og EUCAST bouillonfortynding i forhold til daglig anvendelse i et klinisk mikrobiologisk laboratorium. 6

8 - Kvalitetssikre ovenstående metoder ved at anvende en referencestamme, ATCC , med kendte MIC-værdier som intern kvalitetskontrol. 2. Teori 2.1 Aspergillus Skimmelsvampe af arten Aspergillus er udbredte saprofytter (10). De findes naturligt over alt miljøet, herunder i jord, luften samt vegetabilsk materiale (10)(11). I hospitalsmiljøet er de fundet i bl.a. luften, brusere, hospitalsvand, potteplanter etc. Som resultat af Aspergillus mangfoldige tilstedeværelse, bliver spore-kontamineret støv til tider inhaleret og dermed er det luftvejene, der er den hyppigste indgangsportal til kroppen (12)(11). Raske individer med et normalt immunsystem bliver ikke ramt af en infektion ved daglig inhalering af conidier. Men patienter med en ændret lungearkitektur eller generelt nedsat immunsystem (langvarig behandling eller svækkende sygdomme) kan blive udsat for meget alvorlige Aspergillus infektioner (9). En stigning i raten af infektioner ses under perioder med byggekonstruktion, især i områder omkring hospitaler. Ventilationsskakter og luften kan blive kontamineret med jord og vegetative fragmenter, som er blevet luftbåret pga. forstyrrelser i jorden og vegetationen. Derfor ses en proportionel forbindelse mellem en infektion, oftes aspergillose, og disse perioder, hvor store mængder conidier spredes i luften og miljøet (11). Aspergillus spp. er opportunistiske patogener, og infektionstypen afhænger af den underliggende sygdom samt Aspergillus arten (10). Omkring 20 forskellige Aspergillus spp. er kendte infektionsgivere, hvor Aspergillus fumigatus er den hyppigste og ses hos omkring. 90 % af tilfældene. Aspergillus flavus og Aspergillus niger ses hos ca. 8-9% af tilfældene. Slutteligt ses Aspergillus terreus hos ca. 1% af tilfældene (10). Fordi en Aspergillus infektion kan være så alvorlig og kan have store konsekvenser for patienten velvære, er det vigtigt at kunne identificere disse Makroskopiske og mikroskopiske karakteristika Identifikationen af en Aspergillus spp. afhænger både af de makroskopiske og mikroskopiske morfologiske træk. Kolonier af Aspergillus spp. karakteriseres hyppigst ved hurtig vækst, en pudret, granulær eller vattet tekstur samt en stor varians i farver helt fra hvid og orange til grøn og sort (11)(10). 7

9 Aspergillus spp. har flere mikroskopiske karakteristika, hvilke kan anvendes til identifikation. Den indeholder både et vegetativt mycelium og et luftmycelium. Luftmycelium, også kaldet det reproduktive mycelium eller hyfer, er den del, der stikker op i luften og op ad substratet. (11)(13). Det er denne del, der mikroskoperes til identifikation af arten. Ved mikroskopering ses disse hyfer som septate. Conidiophorer er grene fra hyferne, som vokser ud fra en fodcelle. I den terminale ende af conidiophoren sidder en vesikel, som ses som alt fra globulær til eliptisk, og hvis overflade både kan være glat eller ru. Vesiklen kan være delvist eller helt dækket af metulae og phialider. Aspergillus spp., som er uniseriate, indeholder kun phialider, som ses som et enkelt lag celler, der vokser ud fra vesiklen. Hvis den omvendt er biseriat, vokser phialiderne på metulae, som er sterile støtteceller. Dette ses som to lag celler, der vokser ud fra vesiklen. Phialiderne bærer på conidier, sporer, som er de infektiøse spredningslegemer. Conidierne kan forme kompakte (kolumnær disposition) eller adskilte (radial disposition) kolonner (10)(12). Figur 1 viser opbygningen af en Aspergillus spp. Figur 1 Den karakteristiske opbygning af en Aspergillus spp (10) Antimykotika Antimykotika omfatter midler, som anvendes til behandling af både superficielle mykoser samt invasive infektioner (14). 8

10 2.2.1 Amphotericin B Amphotericin B er en polyen makrolid (15). Det er et bredspektret antimykotika, som har fungicid aktivitet på alle Aspergillus spp (12). Dette antimykotikas aktivitet fungerer ved, at det binder sig ireversibelt til ergosterol, som er hovedkomponenten i skimmelsvampens cellemembran (12)(14)(15). Denne binding danner transmembrane ionkanaler, hvilket resulterer i en øget membranpermeabilitet, som medfører lækage af de vitale intracellulære molekyler såsom K +. Dette medfører i sidste ende celledød (15)(12). En anden mekanisme, som amphotericin B besidder er, at den kan involvere sig direkte i membranskade. Dette er et resultat af en kaskade af oxidative reaktioner, som er påbegyndt fra oxidationen af amphotericin B selv (12) Azoler Itraconazol, posaconazol og voriconazol er alle triazoler, idet de indeholder tre nitrogenatomer i deres azolring. Disse er lipofile, og voriconazol og posaconazol er desuden 2. generationstriazoler (14)(16). Triazolernes aktivitet over for Aspergillus spp. er fungicid. De fungerer ved at hæmme det svampecytokrom P450 afhængige enzym lanosterol 14-alpha-demethylase. Dette enzym er involveret i omdannelsen af lanosterol til ergosterol, som er en vigtig komponent inden for bevaring af cellemembranens integritet. Denne hæmning gør, at membransyntesen i svampecellen bliver afbrudt, hvorved cellen dør pga. mangel på ergosterol (14)(12)(15). Figur 2 nedenfor illustrerer måden, hvorpå antimykotika er aktive over for en celle. Figur 2 illustration af de forskellige antimykotikas aktiviteter mod en celle (12). 9

11 2.2.3 Aktivitet af antimykotika Aktiviteten af en antimykotika (Assay Potency) fortæller noget om, hvor stor en del af det testede antimykotika, der er aktivt. Aktiviteten udtrykkes i mg/g. Denne aktivitet anvendes, når volumen af et opløsningsmiddel til opløsning af antimykotikaet skal beregnes (17). Formlen, hvori aktiviteten indgår, ser således ud: Volume (L) = Weight (g) Assay Potency (mg/g) Concentration (mg/l) Producenten af antimykotika har opsat aktiviteten i purity (procenter). Derfor skal disse aktiviteter i procenter altid regnes om til mg/g for at kunne anvendes i beregningen. De ser således ud: Antimykotika Aktivitet (%) Amphotericin B 95 Itraconazol 95 Voriconazol 98 Tabel 1 viser aktiviteten af de forskellige antimykotika (15)(18)(19). 2.3 Resistensmekanismer Target for triazolerne er 14-alpha lanosterol demethylase enzymet, som er genereret af Cytokrom P α sterol demethylase genet (CYP51A) (20)(21).Specifikke mutationer i dette gen kan muligvis medføre resistens over for én eller flere azoler (22)(12). Dominante azolresistente fænotyper er associeret med mekanismer, som skyldes tilstedeværelsen af et 34 eller 46 basepar langt tandemrepeat (3)(20)(23). Dette er en duplikation af et fragment af en DNA-sekvens i CYP51A s promoterregion. Mutation i codon 98 samt en dobbeltmutation i codons 121 og 289 ses som hot-spots for mutationer forbundet med azolresistens og er altid forbundet med et tandemrepeat (TR34/L98H og TR46/Y121F/T289A) (24). Dette øger opreguleringen af enzymet, hvorved dets funktionsevne øges otte gange. Dermed øges CYP51A ekspressionen, hvorved skimmelsvampen bliver resistent over for azolerne (21)(24). Det lader til, at CYP51A genet generelt er et hot-spot for mutationer, der giver fænotypisk resistens, og at resistensmekanismerne synes at have en forbindelse til forholdene for resistensudvikling. Resistensmekanismerne, der er fundet i isolater, der er blevet resistente pga. længerevarende 10

12 azolbehandling er altid punktmutationer, mens de, der er fundet hos resistente isolater, der er blevet udsat for azolfungicider altid er punktmutationerne L98H, Y121F og T289A forbundet med et tandemrepeat (3)(20)(21). 2.4 MIC-bestemmelse MIC-bestemmelse udføres på de Aspergillus spp. der er fundet hyppigst patogene, og udføres især, hvis den konkrete art tidligere har udtrykt resistens over for de komercielle antimykotika (17). Det øgede antal af muligheder for at behandle invasive svampesygdomme kombineret med dokumenteret resistens mod antimykotika imellem nogle arter, har bekræftet behovet for standardiserede metoder til at bestemme in vitro følsomheden for kliniske isolater af Aspergillus mod både nye og allerede etablerede antimykotika (17). Det har været vanskeligt at standardisere MIC-bestemmelser af skimmelsvampe. Men på baggrund af utallige studier er nu både en amerikansk (CLSI) og en europæisk (EUCAST) referencemetode udkommet (14). Disse metoder er reproducerbare, præcise og tilgængelige til brug i et klinisk laboratorie (12). De er i stand til at bestemme organismers følsomhed over for et givent antimykotika, bekræftelse af deres følsomhed samt bestemme følsomheden, når metoder såsom E- test og diskdiffusion synes upålidelige (17). CLSI og EUCAST-metoderne bygger på bouillonfortynding, og disse fungerer som guldstandarder inden for MIC-bestemmelse (25). De anvendes til at bestemme aktiviteten af et givent antimykotika mod en patogen skimmelsvamp. Skimmelsvampen testes for dens evne til at producere synlig vækst i en mikrotiterplade i brønde med bouillon indeholdende en tofoldsfortynding af forskellige antimykotika. Når en skimmelsvamps følsomhed vurderes, aflæses MIC-værdier. MIC (minimum inhibitory concentration) er defineret som den laveste koncentration i mg/l, hvor et antimykotika hæmmer 100% vækst af skimmelsvampe (17). MIC-værdien informerer om skimmelsvampens følsomhed og/eller resistens til de pågældende antimykotika. Den viser desuden aktiviteten af et givent antimykotika under fastsatte testforhold og kan anvendes til beslutninger om behandlingsvalg, når faktorer såsom farmakokinetik, farmakodynemik og resistensmekanismer er taget i betragtning (17) Breakpoints De aflæste MIC værdier for Aspergillus spp. kan omsætes til kategorierne S, I elller R (SIRværdier). Disse værdier fortæller hvorvidt skimmelsvampen er S, sensitiv, I, intermediær, eller R, resistent, over for et givent antimykotika (17). 11

13 European Committee of Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST) har præsenteret standardiserede breakpoints. Disse breakpoints beretter om grænserne mellem S, I og R i forhold til de bestemte Aspergillus spp arter opstillet over for et bestemt antimykotika (26). Tabel 2 illustrerer de fastsatte breakpoints. Aspergillus flavus Aspergillus fumigatus Aspergillus niger Aspergillus terreus S R S R S R S R Antimykotika Amhotericin B IE IE IE IE Itraconazol IE 1 IE Posaconazol IE IE 0,12 0,25 IE IE 0,12 0,25 Voriconazol IE IE 1 2 IE IE IE IE Tabel 2 viser de kliniske breakpoints for Aspergillus spp. i forhold til antimykotika. 1: MIC-værdierne er generelt højere end for A. fumigatus. Om det betyder en ringere klinisk respons er ukendt. IE: utilstrækkelige beviser på, at pågældende art er et godt mål for behandling med dette stof (27) EUCAST bouillonfortynding Denne metode er, som nævnt, guldstandarden inden for MIC-bestemmelse (25). Metoden har til formål at resistensbestemme Aspergillus spp. ved anvendelse af aflæste MIC-værdier over for et givent antimykotika. brøndene i mikrotiterpladerne indeholder RPMI-1640 vækstmedie samt diverse antimykotia i serielle tofoldsfortyndinger. Udvalgte brønde fungerer desuden som hhv. positiv og negativ vækstkontrol, hvori antimykotika ikke er tilsat. MIC-værdien aflæses ved første brønd, hvor væksten af skimmelsvampen er 100 % hæmmet. Disse værdier omsættes til SIR-værdier vha. breakpoints, hvorved det kan bestemmes, hvorvidt en Aspergillus spp. har nedsat følsomhed over for et antimykotika. Figur 3 illustrerer, hvorledes det ses, hvor skimmelsvampen er hæmmet 100 %. Figur 3 Forskellem mellem vækst (til højre) og 100 % hæmning (til venstre). 12

14 2.4.3 Sensititre YeastOne Sensititre YeastOne er en kommerciel metode til MIC-bestemmelse af diverse Candida og Aspergillus spp. Metoden bygger på en colormetrisk mikrodilution. Mikrotiterpladerne består af 96 brønde, hvoraf én brønd, udelukkende indeholdende bouillon, fungerer som en positiv kontrol. De resterende brønde er coatet med forskellige antimykotika i serielle tofoldsfortyndinger i mg/l (28). Hver brønd er desuden tilsat en farveindikator, Alamar Blue. Den aktive del af Alamar Blue er resazurin. Dette er et cellepermeabelt blåt farvestof. Ved interaktion med metabolsk aktive celler, reduceres resazurin til farvestoffet resorufin, hvorved en rød farve fremkommer i brøndene (29). Figur 4 illustrerer denne reaktion. Figur 4 Reduktionen af resazurin til resorufin ved interaktion med aktive celler (30). MIC-værdier aflæses ved første brønd uden farveskift. Disse aflæses manuelt til vurdering af en Candida eller Aspergillus følsomhed over for et givent antimykotika. Figur 5 illustrerer, hvorledes forskellen mellem vækst og hæmning af dette ses. Figur 5 Forskellen mellem vækst (til venstre) og hæmning af vækst (til højre). 13

15 2.5 Screenings azolagar Denne metode bygger på screnning, hvorved den anvendes til at adskille de Aspergillus spp. stammer med nedsat azolfølsomhed fra de azolfølsomme stammer over for et eller flere antimykotika. Screenings azolagar-pladen består af fire brønde, alle tilsat RPMI-1640 vækstmedium. Tre azoler er desuden tilsat hver sin brønd; 4 mg/l itraconazol i brønd et, 1 mg/l voriconazol i brønd to og 0,5 mg/l posaconazol i brønd tre. Brønd fire indeholder kun RPMI-1640, hvorved denne fungerer som en positiv vækstkontrol (9). Ved aflæsning vurderes det, hvorvidt vækst ses i den positive kontrol, hvorefter vækstmængden i de resterende brønde vurderes (31). Hvis vækst fremkommer, indikerer dette, at isolatet er nedsat følsom og muligvis resistent over for det pågældende antimykotika. Figur 6 illustrerer mulige aflæsningsresultater. Figur 6: A: afbildning af vækst ved itraconazol samt positiv vækstkontrol nedsat følsomhed over for itraconazol. B: afbildning af vækst i den positive kontrol fuld følsom. 2.6 Medie til dyrkning Sabouraud dextrose agar Conidier er de komponenter af skimmelsvampen, der anvendes til MIC-bestemmelse samt screening. For at kunne udføre analyser på en Aspergillus spp., kræves det, at kolonierne er velvoksne med udviklede conidier. En inkubation på 2-7 dage er den optimale tid (28)(17). Kulturerne har behov for et passende medie til at vokse på. Sabouraud dextrose agar er et nonselektivt medie til diffentering af diverse skimmelsvampe og gær. Når Aspergillus spp. vokser på denne plade, bibeholder de deres arts-karakteristiske udseende, hvorved de er lette at identificere ifølge de standardiserede makroskopiske karakteristika beskrevet af Sabouraud (32). 14

16 Dette medie består af Mykologisk pepton, som er et mix af dyre og plantepeptoner, der er krævet for at opnå god vækst af skimmelsvampe (33). Der er desuden tilsat glucose, som er et kulhydrat, der er et vigtigt næringsstof for skimmelsvampe, idet de udnytter stoffet som en energikilde (34). ph på Sabouraud dexrose agar er 5,6 ±0.2, hvilket er den optimale ph til vækst af skimmelsvampe og bakterier (12). 2.7 Reagens til præparation af inokulum Tween20 Til udførelse af screening og MIC-bestemmelse fremstilles en inokulum. Dette består af en suspension af conidier, opsamlet direkte fra Aspergillus kolonierne. Skimmelsvampe er hydrofobe og kan derfor ikke opslæmmes i vand, som anvendes til fremstillingen af inokulum. For at dette er muligt, anvendes et substrat, Tween20, også kaldet Polyoxyethylen Sorbitan Monolaurat. Dette stof er et ionisk middel, som fungerer membranopløsende og anvendes som et emulgerende stof til præparation af et inokulum (35). Ved tilsætning af dette stof, er det muligt for de hydrofobe skimmelsvampe at blandes i vand, hvorved en densitet af dette kan måles. 3. Materialer 3.1 Prøvemateriale Til projekter er i alt 49 Aspergillus spp. isolater anvendt. Isolaterne stammer hovedsageligt fra luftvejssektreter og podninger. Til kvalitetssikring er desuden én ATCC-stamme, Aspergillus fumigatus , medtaget. Tabel 3 viser speciesfordelingen af de medtagne Aspergillus spp. Se bilag 1 for udførlig speciesoversigt. Species Antal Aspergillus fumigatus 40 Aspergillus niger 6 Aspergillus flavus 2 Aspergillus terreus 1 Tabel 3 - artsfordelingen af de anvendte Aspergillus 3.2 Materialer Se udførlig materialeliste i bilag Inokulum - Tween 20, AUH reagens, AUH Apotek - Nephelometer, Sensititre, 15

17 - DensiCHEK plus, biomérieux Screenings azolagar - Screenings azolagar, SPL Life Sciences - Finnpipette 5-50 μl + filterpipettespidser, Thermo Electron Sensititre YeastOne - YeastOne mikrotiterplader, Thermo Scientific - Selvklæbende plastfilm, Thermo Scientific - Sensititre inokulum bouillon, Thermo Scientific - Multipipette μl + filterpipettespidser, Thermo Labsystems - Sensititre Vizion Eucast bouillonfortynding - Manuelt fremstillede mikrotiterplader - Multipipette μl + filterpipettespidser, Thermo Labsystems - Selvklæbende plastfilm, Sarstedt - Sensititre Manuel Viewer 4. Metode 4.1 Litteratursøgning Til inspiration samt baggrundsviden onhandlende Aspergillus spp. og resistensbestemmelse blev søgemaskinen Google anvendt. Hjemmesiden for Statens Serum Institut har desuden været relevant at anvende i forbindelse med baggrundsviden. VIA Bibliotekerne har ligeledes været meget anvendelige i forbindelse med fund af videnskabelige artikler. I forbindelse med udarbejdelsen af teoriafsnittet blev diverse lærerbøger, både fra uddannelsen samt VIA Biblioteket, anvendt. Til fund af videnskabeligie artikler, som blev anvendt til både inspiration, introduktion, teori og metodeafsnittet samt diskussion, blev både Cinahl og især Pubmed anvendt. Oftest blev søgningerne begrænset til kun at omhandle mennesker, samt en alder på maksimum 10 år. Til søgningen blev forskellige fritekstsøgninger samt MESH-termer anvendt. Disse var bl.a. 16

18 Aspergillus Susceptibility Testing, Drug Resistance Aspergillus, very major Error etc.. Der blev desuden fundet nyttige videnskabelige artikler ved at gennemlæse allerede fundne artiklers referencelister. Fremgangsmåder samt produktinformationer er til dels fundet i producenternes indlægssedler samt Region Midtjyllands onlinesamnling E-dok. 4.2 Indsamling og behandling af prøvematerialer I perioden 25/3 til 6/4 blev i alt 62 Aspergillus spp. isolater indsamlet. 55 isolater blev udvalgt fra KMA AUH s egen -80 C fryser. Herunder blev to resistente isolater, TR46/Y121F/T289A og TR34/L98H, inkluderet. Disse havde kendte MIC-værdier, da de var tidligere MIC-bestemt af SSI. Fem isolater blev desuden indsamlet fra mykologilaboratoriet på KMA AUH. Disse fem isolater var blevet tilsendt fra Centraalbureau voor Schimmelcultures i Holland. En intern kontrol, ATCC indgik også i forsøget. Alle isolater blev udsået på Sabouraud dextrose agarplader med en 1 μl øse. Materiale fra Aspergillus spp. blev afsat tre forskellige steder på pladen. Pladerne blev inkuberet i en plasticpose 2-7 dage ved 35 C (36). Tre Isolater med manglende vækst efter flere forsøg blev ekskluderet pga. manglende tid. Yderligere ti isolater blev ekskluderet fra forsøget pga. mangel på screenings azolagar. Dermed endte det sluttelige antal isolater på 49 Aspergillus spp. til videre anvendelse. 4.3 Fremstilling af inokulum Samme suspension blev anvendt til alle tre metoder. En opløsning af 5 ml sterilt vand og 2-3 dråber Tween20 fremstilledes og blev hældt ud over Aspergillus spp. kolonierne. Med en vatpind blev conidierne frigjort og opløst i væsken. Derefter blev suspensionen opsamlet i et reagensglas. Denne henstod i 3-5 minutter, så tungt materiale såsom hyfer fik mulighed for at bundfældes. Overskydende materiale, der som oftest flød i overfladen, blev afpipetteret og kasseret, hvorefter supernatanten blev afpipetteret over i et rent reagensglas. Suspensionen blev målt og densiteten blev justeret med sterilt vand og Tween20 (2 ml vand til 1 dråbe Tween20), til en optimal McFarland med en densitet på 0,5 blev opnået. En densitet i intervallet [0,40;0,60] blev også accepteret. 17

19 Den færdige suspension stod maksimum 30 minutter inden anvendelse til de tre metoder for at opretholde en jævn conidiekoncentration (17). 4.4 Fremgangsmåde og aflæsning I det følgende afsnit beskrives proceduren og aflæsningen for de tre metoder hver for sig; EUCAST bouillonfortynding, Sensititre YeastOne og screenings azolagar. Alle tre metoder blev udført på samtlige 49 isolater. Desuden blev ATCC-stammen medtaget hver udførelsesdag. Se nedenstående figur 7 for flow over fremgangsmåderne EUCAST bouillonfortynding Figur 7 - Flow over fremgangsmåden for de tre metoder Fremgangsmåden for metoden er baseret på EUCAST Definitive document E.DEF 9.1 samt vejledning af afdelingslæge Jan Berg Gertsen (17). Inden tilsætning af inokolum var det nødvendigt at optø de manuelt producerede mikrotiterplader. Bilag 3 og 4 viser fremstillingen af disse. De blev opbevaret i -80 C fryseren på KMA AUH og optøningen foregik ved at placere mikrotiterpladerne på et elektronisk vippebord. Herefter blev antimykotikaopløsningerne fortyndet ud i de relevante brønde. Tabel 4 afbilder disse fortyndinger. Række Kolonne A Itraconazol ,5 0,25 0,12 5 0, , ,01 56 Pos. kontrol Neg. kontrol B Voriconazol ,5 0,25 0,12 5 0, , ,01 56 Pos. kontrol Neg. kontrol C Amphoteric in B ,5 0,25 0,12 5 0, , Pos. kontrol Neg. kontrol D Tabel 4 - Fordelingen af de respektive antimykotika samt koncentrationsfordelingen i mg/l 18

20 Bilag 5 beskriver en detaljeret fremstilling af proceduren bag ovenstående tabel. Derefter blev 1 ml suspension afpipetteret til 9 ml sterilt vand til fremstilling af inokulum. Opløsningen blev vendt for at opnå homogenitet. Med en multipipette blev 100 μl inokulum afpipetteret til brønd 1-11 og i brønd 12 blev 100 μl sterilt vand afpipetteret. Pladerne blev forseglet med selvklæbende plastfilm og inkuberet ved 35 C i 48 timer. Aflæsningen foregik efter efter 48 timers inkubation. Den foregik på baggrund af EUCAST definitive document E.DEF 9.1 (17). Pladerne blev aflæst manuelt ved anvendelse af et Sensititre Manuel Viewer (spejlet), hvor mængden af vækst i brøndene blev vurderet. MIC-værdien blev aflæst, hvor en total hæmning af skimmelsvampen sås. Figur 8 illustrerer, hvorledes MIC-værdierne aflæses. Figur 8 Aflæsning af EUCAST bouillonfortynding. MIC-aflæses ved grøn markering = 100 % hæmning af vækst. Ved aflæsning sås der bort fra enkelte kolonier og/eller kontaminering samt skipped wells (17). Første brønd, hvor væksten var totalt hæmmet blev noteret, og ved hjælp af et skema fremstillet i samråd med afdelingslæge Jan Berg Gertsen, blev disse placeringer tolket til MIC-værdier (se tabel 4). Med henblik på anvendelse til tolkning samt resultatbehandling blev disse MIC-værdier vha. de kliniske breakpoints omsat til SIR-værdier (se tabel 2) (26) Sensititre YeastOne Fremgangsmåden for denne metode er baseret på Sensititre YeastOne manual (28). 100 μl McFarland 0,5 suspension blev afpipetteret ned i 11 ml YeastOne inokulum bouillon, hvorefter opløsningen blev vendt, til homogenitet blev opnået. Færdigfremstillede mikrotiterplader indeholdende tørret RPMI-1640 tilsat serielle fortyndinger af forskellige antimykotika fra Sensititre YeastOne, blev anvendt. Figur 9 illustrerer pladelayoutet for denne metode. 19

21 Figur 9 viser en oversigt over indholdet af antimykotika i mikrotiterpladen samt de respektive koncentrationer. De relevante antimykotika for dette projekt er markeret med grøn (37). Med en multipipette blev derefter 100 μl af det forudfremstillede inokulum afpipetteret i samtlige brønde. Pladerne blev forseglet med selvklæbende plastfilm, hvorefter de blev inkuberet ved 35 C i 48 timer. Pladerne blev aflæst efter 48 timers inkubation. De blev manuelt aflæst på Sensititre Vizion System. Denne Aflæsning foregik på baggrund af Sensititre YeastOne manual (28). For en øgning i sensitivitet blev det afgjort, at synlig vækst i brønden også skulle kategoriseres som vækst til trods for et eventuelt manglende farveskift. MIC-værdien blev aflæst ved første brønd uden hverken synlig vækst eller farveskift. Den pågældende brønd blev noteret, og ved hjælp af Sensititre YeastOne Plate Format blev aflæsningen tolket til MIC-værdier (se figur 9)(37). Figur 10 Aflæsning af Sensititre YeastOne. MIC-værdien aflæses ved grøn markering = første brønd uden farveskifte og/eller synlig vækst. For at kunne udføre behandling af resultaterne, blev de aflæste MIC-værdier omsat til SIR-værdier (se tabel 2). Figur 10 ovenfor illustrerer, hvorledes MIC-værdierne aflæses. 20

22 4.2.3 Screenings azolagar Proceduren for metoden er baseret på egne erfaringer samt vejledning fra afdelingslæge Jan Berg Gertsen fra KMA AUH. Til denne metode blev den forudfremstillede suspension med en McFarland 0,5 ± 0,1. anvendt. Med en Finnpipette blev 25 μl suspension afpipetteret på hvert agarfelt. Pladerne blev inkuberet ved 35 C i plastikposer. Aflæsningen af pladerne foregik efter 48 timer. Ved aflæsningen blev mængden af vækst vurderet. Aflæsningen var visuel og væksten blev kategoriseret i + og 0. Alle medlemmer af gruppen aflæste resultaterne individuelt. Ved aflæsning blev det vurderet, hvorvidt der var vækst i den positive vækstkontrol, hvorefter vækstmængden i de resterende brønde blev vurderet og noteret. Tabel 5 viser tolkingen af vækstmængden og figur 11 viser illustrerer tolkningen i billeder. Vækstmængde Tolkning Meget vækst + + Moderat vækst + Lidt vækst (+) Tvivl hvorvidt vækst er til stede 0 Ingen vækst Tabel 5 - Vækstmængder med tilhørende tolkninger til screenings azolagar Figur 11 Billedlig vækstmængder fra Screenings azolagar. 10A: 0 = Ingen vækst. 10B: (+) = tvivlsomt om vækst ses. 10C: + = lidt vækst. 10D: ++ = moderat vækst. 10E: +++ = meget vækst 21

23 4.3 Resultatbehandling Errors For at kunne illustrere de opnåede resultater ud fra de aflæste MIC-værdier, blev et scattergram udarbejdet. Et scattergram er i stand til grafisk af præsentere de aflæste MIC-værdier, hvor Sensititre YeastOne blev sammenlignet med EUCAST bouillonfortynding. Der blev udarbejdet et scattergram for hver af de sammenlignelige antimykotika; itraconazol, voriconazol og amphotericin B. Figur 12 nedenfor viser en skitse af et tomt scattergram, som indeholder de forskellige errors, der kan opstå ved en uoverensstemmelse mellem de to metoder; Very Major Error, Major Error og Minor Error. Figur 12 Skitse af scattergram, der illustrerer sammenhængen mellem de aflæste MIC-værdier og de pågældende Errors. Til forsøget, på baggrund af anvendelsen på SSI samt artikelfund, blev EUCAST bouillonfortynding udvalgt som referencemetoden (25). Dernæst var det muligt at indsætte resultaterne i scattergrammet, hvorved der blev mulighed for at aflæse de forskellige Errors. Tabel 6 nedenfor illustrerer overensstemmelse mellem de to metoder tolket til errors. 22

24 Referencemetode (EUCAST) Testmetode (Sensititre Grad af overensstemmelse YeastOne) Sensitiv Overensstemmelse Sensitiv Intermediær Minor Error Resistent Major Error Sensitiv Minor Error Intermediær Intermediær Overensstemmelse Resistent Minor Error Sensitiv Very Major Error Resistent Intermediær Minor Error Resistent Overensstemmelse Tabel 6 Overenstemmelse mellem EUCAST bouillonfortynding og Sensitre YeastOne (38). Ved hjælp af fundne artikler, blev der opsat acceptgrænser for, hvor mange procent Very Major Errors, Major Errors samt Minor Errors, der maksimum blev tilladt ved en given metode (7)(39). Ud fra de fundne resultater blev procenten af disse for Sensititre YeastOne udregnet, hvorefter de blev sammenlignet med det opsatte acceptgrænser. Dermed kunne en vurdering af metodens validitet til resistensbestemmelse af Aspergillus spp. vurderes. Tabel 7 viser disse grænseværdier. Very Major Errors Major Errors Minor Errors 1,5 % 3 % 10 % Tabel 7 - Acceptgrænser for Very Major Errors, Major Errors samt Minor Errors (7)(39). Ved at udarbejdelse af disse scattergrammer, var det muligt at beregne disse Errors og dermed vurdere, hvorvidt en overensstemmelse sås mellem Sensititre YeastOne og EUCAST bouillonfortynding i forhold til de 49 Aspergillus spp. isolater. Beregningerne var opbygget ens for alle tre typer af Errors, derfor ses kun et eksempel nedenfor: Very Major Errors % = Antal Very Major Errors Antal testisolater i alt Essentiel og kategorisk overensstemmelse Andre tests til at undersøge, hvorvidt en overensstemmelse sås mellem MIC-værdierne og SIRværdierne mellem Sensititre YeastOne og EUCAST bouillonfortynding, omhandler den essentielle og den kategoriske overensstemmelse. Igen tages blev der taget udgangspunkt i, at EUCAST bouillonfortynding var referencemetoden, hvorved disse udregninger kunne vurdere Sensititre YeastOnes egnethed til resistensbestemmelse af Aspergillus spp i forhold til en referencemetode. 23

25 Essentiel overensstemmelse ses, hvis en MIC-værdi for Sensititre YeastOne ligger inden for ± ét fortyndingstrin til forskel fra referencemetoden. En kategorisk overensstemmelse ses, hvis en SIRværdi for Sensititre YeastOne ligger i den samme SIR-kategori som referencemetoden. For begge overensstemmelser gælder det, at den procentvise overensstemmelse af de testede isolater i alt skal være over 89,9 % (38). Den kategoriske overensstemmelse kan desuden anvendes til sammenligning af screenings azolagar med de to ovenstående MIC-bestemmelser. Væksten af Aspergillus spp. på screeninsg azolgar kunne ikke tolkes til konkrete MIC-værdier, men til SIR-værdier. Ingen vækst er dermed ensbetydende med, at isolatet er sensitivt, hvorimod synlig vækst (i alle grader) betegnes som et intermediært/resistent isolat. Derfor blev MIC-værdierne for Sensititre YeastOne og EUCAST bouillonfortynding fortolket til SIR-værdier (se tabel 2). Dermed kunne resultaterne for screenings azolagar sammenlignes med de to MIC-bestemmelser, hvorved det kunne vurderes, hvilke metode der stemmer bedst overens. Tabel 8 viser tolkningen af resultaterne til SIR-værdier. Vækstmængde SIR-værdier 0 S (+) I/R + I/R ++ I/R +++ I/R Tabel 8 Vækstmængderne for screenings azolagar tolket til SIR-værdier Som ved Errors, er det også mulighed for at udarbejde en formel til beregning af disse overensstemmelser. Nedenfor ses eksempler på udregning: Essentiel overensstemmelse (%) = Kategorisk overensstemmelse (%) = Antal med maks ± 1 dilutionstrin til forskel Antal testisolater i alt Antal isolater med SIR overensstemmelse Antal testisolater i alt Kvalitetssikring Til vurdering af alle resultater fra Screenings azolagar, Sensititre YeastOne og EUCAST bouillonfortynding, sammenlignedes der med Aspergillus fumigatus, som var en referencestamme, ATCC For denne stamme var der i EUCAST Definitive Document E.def 9.1 opstillet acceptable MIC-ranges (17). Disse ses i tabel 9. 24

26 Antimykotika Aspergillus fumigatus ATCC MIC-ranges (mg/l) Amphotericin B Itraconazol Voriconazol Posaconazol 0, Tabel 9 Acceptable MIC-ranges for ATCC Denne referencestamme blev medtaget på hver fjerde EUCAST bouillonfortyndingsplade og medtaget én gang på Sensititre YeastOne, hver gang en ny dag blev påbegyndt. Det samme gjaldt for Screenings azolagar. Stammen blev medtaget for at kvalitetssikre metoderne. Men inden den kunne anvendes til kvalitetssikring, skulle den selv valideres. Dette blev den ved at undersøge, hvorvidt egne aflæste MIC-værdier stemte overens med de acceptable MIC-ranges. Til illustration af ATCC-stammens resultater samt vækstmængde blev kontrolkort udarbejdet. Der blev fremstillet et kontrolkort for de to resistensbestemmelsesmetoder for hvert antimykotika; Sensititre YeastOne: voriconazol, itraconazol, posaconazol og amphotericin B. EUCAST bouillonfortynding: itraconazol, voriconazol og amphotericin B. Dermed kunne det vurderes, hvorvidt resultaterne lå inden for det fastsatte ranges, og en eventuel validering af metoderne kunne finde sted. For screenings azolagar blev de acceptable MIC-ranges tolket til SIR-værdier, hvorved der var mulighed for at sammenligne metodens aflæste SIR-værdier, og dermed vurdere, hvor valid denne var. Tabel 10 illustrerer disse værdier. Antimykotika Aspergillus fumigatus ATCC Vækstmængde SIR-værdier Itraconazol S Ingen vækst Voriconazol S Ingen vækst Posaconazol S Ingen vækst Tabel 10 SIR-værdierne samt den tilhørende vækstmængde for de bestemte antimykotika tolket ud fra de acceptable MIC-ranges 5. Resultater I det følgende afsnit bliver resultaterne fra vores projekt præsenteret både grafisk og skematisk Sammenligning af Sentititre YeastOne og EUCAST bouillonfortynding Til resistensbestemmelse af Aspergillus spp. er Sensititre YeastOne og EUCASt bouillonfortynding anvendt. I det følgende sammenlignes disse metoder. Sammenligningen af resultaterne har taget 25

27 udgangspunkt de aflæste MIC-værdier for de 40 Aspergillus fumigatus isolater, der blev anvendt til projektet Sammenligning af de to metoder til grafisk afbildning. Figurerne 13, 14 og 15 forestiller scattergrammer, der grafisk afbilder de aflæste MIC-værdier for Sensititre YeastOne og EUCAST bouillonfortynding. Der ses en sammenholdning af de aflæste MIC-værdier for de respektive antimykotika; itraconazol, voriconazol og amphotericin B. Se desuden tabel 12 for placering af Errors. De tilhørende tabeller 11, 12 og 14 præsenterer skematisk resultaterne fremvist i scattergrammerne. Se rådata samt udregninger i bilag 6. Figur 13 Itraconazol Figur 13 viser en sammenligning af MIC-værdierne for Sensititre YeastOne og EUCAST bouillonfortynding aflæst for de 40 Aspergillus fumigatus isolater. 1 isolat tolkes som Very Major Errors og 5 isolater tolkes som Minor Errors. Indsatte streger påviser desuden grænserne mellem S, I og R. Tabel 11 Antal Antal % Very Major Error 1 2,5 Major Error 0 0 Minor Error 5 12,5 Overensstemmelse I alt % 26

28 Tabel 11 viser skematisk resultaterne udledt af scattergrammet. Disse resultater er udledt af SIR-værdierne, som ses i scattergrammet. I alt ses 2,5 % Very Major Errors samt 12,5 % Minor Errrors. Figur 14 - voriconazol Figur 14 viser en sammenligning af MIC-værdierne for Sensititre YeastOne og EUCAST bouillonfortynding aflæst for de 40 Aspergillus fumigatus isolater. 2 isolater tolkes som Minor Errors. Indsatte streger påviser desuden grænserne mellem S, I og R. Tabel 12 - Voriconazol Antal Antal % Very Major Error 0 0 Major Error 0 0 Minor Error 2 5 Overensstemmelse I alt Tabel 12 viser skematisk resultaterne udledt af scattergrammet. Disse resultater er udledt af SIR-værdierne, som ses i scattergrammet. I alt ses 5 % Minor Errors. 27

29 Figur 15 - amphotericin B Figur 15 viser en sammenligning af MIC-værdierne for Sensititre YeastOne og EUCAST bouillonfortynding aflæst for de 40 Aspergillus fumigatus isolater. 8 isolater tolkes som Major Errors og 30 isolater tolkes som Minor Errors. Indsatte streger påviser desuden grænserne mellem S, I og R. Tabel 13 Amphotericin B Antal Antal % Very Major Error 0 0 Major Error 8 20 Minor Error Overensstemmelse 2 5 I alt Tabel 13 viser skematisk resultaterne udledt af scattergrammet. Disse resultater er udledt af SIR-værdierne, som ses i scattergrammet. I alt ses 20 % Major Errors og 75 % Minor Errors Overensstemmelsen mellem Sensititre YeastOne og EUCAST bouillonfortynding Tabellerne 14 og 15 viser den essentielle og kategoriske overensstemmelse mellem Sensititre YeastOne og EUCAST bouillonfortynding. Den essentielle overensstemmelse er udledt af de aflæste MIC-værdier for de to metoder. Den kategoriske overensstemmelse er udledt af SIRværdierne for de to metoder. Se rådata samt udregninger i bilag 7. 28

30 Tabel 14 Essentiel overensstemmelse Antal isolater med maksimum ±1 dilutionstrin til forskel Antal isolater med maksimum ±1 dilutionstrin til forskel % Itraconazol 3 7,5 Voriconazol Amphotericin B 4 10 Gennemsnit 35,8 Tabel 14 viser den essentielle overensstemmelse mellem de to Sensititre YeastOne og EUCAST bouillonfortynding Tabellen beretter, at der, ud af de 40 Aspergillus fumigatus isolater, er en gennemsnitlig essentiel overensstemmelse (maks ± 1 dilutionstrin til forskel) på 35,8 %. Tabel 15 Kategorisk overensstemmselse Antal overensstemmels er S Antal overensstemmels er I Antal overensstemmels er R Overensste mmelser i alt Itraconazol Voriconazol Overensste mmelser i alt % Amphotericin B Gennemsnit 61,67 Tabel 15 viser den kategoriske overensstemmelse mellem Sensititre YeastOne og EUCAST bouillonfortynding. Tabellen beretter, at der, ud af de 40 anvendte Aspergillus fumigatus isolatere, er en gennemsnitlig kategorisk overensstemmelse (isolater med samme SIR-værdie) på 61,67 % 5.2. Vurdering af screenings azolagar Til vurdering af screenings azolagar for nedsat følsomhed hos Aspergillus, sammenlinges denne metode med hhv. EUCAST bouillonfortynding og Sensititre YeastOne vha af en kategorisk overensstemmelse. Til sammenligning er der taget udgangspunkt i SIR-værdierne. For screenings azolagar tolkes MIC-værdierne som S = ingen vækst og I/R = vækst i forskellige grader. For Sensititre YeasOne og EUCAST bouillonfortynding er SIR-værdierne udledt af de aflæste MICværdier. Resultaterne har taget udgangspunkt i de 40 Aspergillus fumigatus isolater, der blev anvendt til projektet. Se rådata og udregninger i bilag 8. 29

31 5.2.1 Sammenligning med EUCAST bouillonfortynding Tabel 16 Overensstemmelse - S Overensstemmelse - I/R I alt overensstemmelse I alt overensstemmelse % Itraconazol Voriconazol ,5 Posaconazol Gennemsnit 93,75 Tabel 16 viser den kategoriske overensstemmelse mellem screenings azolagar og EUCAST bouillonfortynding. Tabellen beretter, at der, for de 40 anvendte Aspergillus fumigatus isolater, er en gennemsnitlig kategorisk overensstemmelse på 93,75 %. Posaconazol forefindes ikke på EUCAST mikrotiterpladerne Sammenligning med Sensititre YeastOne Tabel 17 Overensstemmelse - S Overensstemmelse - I/R I alt overensstemmelse I alt overensstemmelse % Itraconazol Voriconazol ,5 Posaconazol I alt 97,5 Tabel 17 viser den kategoriske overensstemmelse mellem screenings azolagar og Sensititre YeastOne. Tabellen beretter, at der, for de 40 anvendte Aspergillus fumigatus isolater, er en gennemsnitlig kategorisk overensstemmelse på 97,5 % Aflæsning af A. niger, A. flavus og A. terreus Tabel 18 afbilder sammenligningen mellem de aflæste MIC-værdier for EUCAST bouillonfortynding og Sensititre YeastOne. Sammenligningen ses i form af den essentielle overensstemmelse. MIC-værdier kan ikke aflæses på screenings azolagar, hvorved den essentielle overensstemmelse kun er udført for de to MIC-bestemmelser for disse species. Tabellen har taget udgangspunkt i de fire isolater, hvorved en sammenligning mellem de to metoder var mulig. Se 30

32 rådata og beregninger i bilag 9. 5 ud af 6 Aspergillus niger isolaer kunne ikke aflæses på Sensititre YeastOne. Dette illustrerer figur 16. Tabel 18 Antal med maksimum ± 1 dilutionstrin til forskel Essentiel overensstemmelse % Itraconazol 1 25 Voriconazol 2 50 Amphotericin B 2 50 Gennensnit 41,67 Tabel 18 illustrerer den essentielle overensstemmelse mellem EUCAST bouillonfortynding og Sensititre YeastOne. Som vist i tabellen, er den gennemsnitlige overensstemmelse (maksimum ±1 fortyndingstrin til forskel) 41,67 %. Figur 16 Aspergillus niger Figur 16 Resultater for Aspergillus niger på Sensititre YeastOne. Tomme felter sås, bl.a. I den positive kontrol (markeret med grøn), hvorved en aflæsning ikke var mulig. 5.4 Vurdering af metoder ved anvendelse af intern kvalitetskontrol Til vurdering af metoderne er en intern kvalitetskontrol, ATCC , anvendt. For Sensititre YeastOne og EUCAST bouillonfortynding, er der taget udgangspunkt i de aflæste MIC-værdier for den interne kontrol sammenlignet med de fastsatte, acceptable MIC-ranges (se tabel 9). For screenings azolagar er udgangspunktet en sammenligning af de aflæste SIR-værdier sammenlignet med de acceptable SIR-værdier for samme stamme (se tabel 10). Til illustrering af disse resultater er der udarbejdet kontrolkort for hhv. Sensititre YeastOne og EUCAST bouillonfortynding samt en tabel for screenings azolagar. Se rådata i bilag