NY METODE TIL MOLEKYLÆR DETEKTION AF FAKTOR V LEIDEN PÅ FULDBLOD

Transkript

1 NY METODE TIL MOLEKYLÆR DETEKTION AF FAKTOR V LEIDEN PÅ FULDBLOD UDEN DNA EKSTRAKTION Projektansvarlige: Gruppe 14 Michelle Kjær Kristensen Mette Raahauge Themsen Pernille Jensenius Filimon Anslag uden mellemrum: Udarbejdet i perioden 10. oktober 2016 til 2. januar 2017 i samarbejde med Universitetshospitalet Klinisk Biokemisk Afdeling i Køge under vejledning af uddannelsesansvarlig bioanalytikerunderviser Henrik Ydemann Rasmussen og udført på University College Sjælland i Næstved under vejledning af adjunkt Kim Blanksø Pedersen samt TrioLab under oplæring af Bettina Borre Buhl af nyt apparatur. Forsidebilledets kilde:

2 Forord Dette er et professionsbachelorprojekt udarbejdet af tre bioanalytikerstuderende på bioanalytikeruddannelsen, University College Sjælland (UCSJ) i Næstved. Opgaven henvender sig til bioanalytikerstuderende, ansatte hos kliniske biokemiske afdelinger, LaCAR og TrioLab samt andre med interesse for projektet. Laboratoriepraksis blev udført på University College Sjælland i Næstved i et samarbejde med Universitetshospitalet Klinisk Biokemisk Afdeling (KBA) i Køge under vejledning af uddannelsesansvarlig bioanalytikerunderviser Henrik Ydemann Rasmussen fra KBA i Køge og adjunkt underviser Kim Blanksø Pedersen fra UCSJ i Næstved. Dette bachelorprojekt er med hensigt til implementering af en ny analysemetode til detektering af Faktor V Leiden (FVL) mutation og derfor i interesse for Universitetshospitalet KBA i Køge. Projektet har til formål at undersøge, om et nyt instrument LC Genie III og analysemetoden lever op til standarderne ved en verifikation og medicinsk teknologivurdering (MTV) i forhold til detektion af mutationen Faktor V Leiden. Metoden sammenlignes med den traditionelle Real-Time PCR metode, som på nuværende tidspunkt benyttes på kliniske biokemiske afdelinger i Region Sjælland. Vi vil gerne takke Henrik Ydemann Rasmussen for overlevering af genotypebestemte fuldblodsprøver som blev leveret af Helle Nørholm fra Universitetshospitalet KBA i Roskilde og Anita Jane Dynd Bak fra Universitetshospitalet KBA i Skejby. Til produktchef ved TrioLab Bettina Borre Buhl skal lyde en særlig tak for hjælpen med oplæring i og introduktion til instrumentet LC Genie III fra LaCAR og en god korrespondance og vejledning i tolkning af resultater, samt svar på spørgsmål i forbindelse med LC Genie III og analysemetoden. En stor tak skal også lyde til vores to vejledere Kim Blanksø Pedersen og Henrik Ydemann Rasmussen for forståelse, hensynstagen og hjælpsomhed i forbindelse med projektet. Side 1 af 39

3 Abstract Summary At the department of clinical biochemistry in Køge, a new method needs validation for possible future implementation in the laboratory. The new method presented by TrioLab is said to be faster, more efficient and cheaper, as well as showing a high specificity, since it uses Loop mediated isothermal amplification (LAMP). The purpose of the project is to conduct a health technology assessment (HTA) and a verification of the instrument LC Genie III and the analysis method. Materials and method For the project 34 EDTA whole blood samples, were collected, which were analyzed on the LC Genie III instrument and compared qualitatively with test results from the reference method. To meet accreditation standards of HTA's guidelines, an interseriel determination of precision is conducted on all positive controls, as well as an intraseriel determination of precision of one heterozygous with six analysis. Results The method of comparison of the 28 EDTA whole blood samples, between LC Genie III and qpcr methods, show a sensitivity and specificity of 100% as well as an interseriel accuracy of 100% and intraseriel accuracy of 83%. LAMP Human FV Leiden kit can also be applied to CFX96 Touch from Bio-Rad. Conclusion LC Genie III's ability to detect point mutations without extraction of the DNA, shows good performance with a 100% correlation. This may proof to be beneficial to departments of clinical biochemistry financially, as well as organizational and can may also proof to be beneficial to the patient. Side 2 af 39

4 Resumé Baggrund I Danmark forekommer mutationen Faktor V Leiden hos 7 % af befolkningen. Ændringen af faktor V proteinet, medfører en forøget disponering for dannelse af dyb venøs trombose (DVT). Der findes i dag en pakke for trombofiliudredning, hvor bl.a. detektion af Faktor V Leiden indgår. På nuværende tidspunkt benyttes in-house analysemetoder, baseret på qpcr metoder til detektering af Faktor V Leiden i Region Sjælland. Formål På KBA i Køge skal en ny metode valideres til mulig fremtidig implementering i laboratoriet. Den nye metode som præsenteres af TrioLab siges at være hurtigere, mere effektiv og billigere samtidig med en høj specificitet, da den bruger Loopmediated isothermal amplification (LAMP). Formålet med projektet er derfor at udføre en medicinsk teknologivurdering (MTV) og en verifikation af instrument LC Genie III og analysemetoden. Materiale og metoder Til projektet blev der indsamlet 34 EDTA fuldblodsprøver som blev analyseret på LC Genie III instrumentet og sammenlignet kvalitativt med analyseresultat fra referencemetoden. For at leve op til akkrediteringsstandarderne af MTV s punkter er der fremført en interseriel præcisions bestemmelse sideløbende på samtlige positive kontroller og en intraseriel præcision på én heterozygot med seks analyseringer. Resultater Metodesammenligningen af 28 EDTA fuldblodsprøver mellem LC Genie III og qpcrmetoder viser en sensitivitet og specificitet på 100 %, samt en interseriel præcision på 100 % og intraseriel præcision på 83 %. LAMP Human FV Leiden kit kan også anvendes på CFX96 Touch fra Bio-Rad. Konklusion LC Genie III evne til at detektere punktmutationer uden ekstraktion af DNA, viser en god performance med 100 % korrelation. Dette kan gavne kliniske biokemiske afdelinger økonomisk, organisatorisk samt være til gavn for patienten. Side 3 af 39

5 Indholdsfortegnelse 1 Introduktion Problembaggrund LAMP analyseprincip Afgrænsning Problemformulering Metodiske overvejelser Forsøgsdesign Prøveindsamling Resultater Krav og kvalitetsmål Præanalytiske forhold Stabilitet/holdbarhed Detektionsgrænser Metode og materialer Analysering af prøver Kvalitetssikring Databehandling Resultater Delforsøg 1 - Metodesammenligning Artefakter Delforsøg 2 - præcisionsbestemmelse Interseriel præcision på positive kit-kontroller Intraseriel præcision på EDTA fuldblod, heterozygot prøvemateriale Delforsøg 3 - Pilotforsøg Diskussion Metodesammenligning Præcisionsbestemmelse Interseriel præcision positiv kontroller Intraseriel præcision på EDTA fuldblodsprøvemateriale Pilotforsøg Medicinsk Teknologi Vurdering (MTV) Teknologien Økonomien Organisationen Patienterne Konklusion Perspektivering Referenceliste: Side 4 af 39

6 1 Introduktion Kvalitetssikring og kvalitetsudvikling af alle arbejdsprocedurer, samt analyseudstyr, er essentielt for sundhedsvæsenets fokus på Patienten i centrum. Patienterne skulle gerne have samme behandling, med højt kvalitetsniveau, uanset hvor i landet patienten befinder sig. Som følge af et mere ressourcepresset sundhedsvæsen, grundet højere levealder, et stigende antal af kroniske sygdomme, samt centralisering af den faglige ekspertise på færre, men større sygehuse og accelererede patientforløb, er fokus på udviklingsarbejde i bioanalytikerprofessionen nødvendigt og højt prioriteret(1). Det sætter krav til effektivisering af arbejdsgangen samt, at der skabes mest mulig værdi for patienten, med de ressourcer, der er til rådighed. Udviklingen medfører en kontinuerlig udvikling af nye analyseapparater, og nye analysemetoder. Disse skal valideres eller verificeres, for at sikre, at de lever op til akkrediteringsstandarderne. Akkrediteringssystemet sikrer, at kvaliteten kan måles og medfører øget fokus på forbedring de steder, hvor der er behov for det. Ved at følge akkrediteringsstandarderne, sikres det, at de kliniske afdelinger på landets sygehuse, lever op til kravene om høj og ensartet kvalitet af alle behandlingsforløb, og det gør sig gældende såvel nationalt som internationalt. Region Sjællands kliniske biokemiske afdelinger, benytter en anbefaling til metodevalidering, som er udarbejdet af Dansk Selskab for Klinisk Biokemi (DSKB), som er et hjælperedskab til validering af analysemetoder. Denne anbefaling er en revideret version af en tidligere retningslinje, RL6, fra Den Danske Akkrediteringsfond (DANAK) som også har deltaget i arbejdet med den reviderede version. Ifølge DANAK lever vejledningen op til kravene i akkrediteringsstandarderne ISO og ISO 15189(2). Retningslinjerne fra DSKB indeholder en række parametre, der sikrer, at faktorer som blandt andet økonomi, anvendelighed, kvalitet, miljø og arbejdsmiljø, vurderes i forbindelse med indkøb af nyt analyseudstyr. Parametrene er: Krav og kvalitetsmål, referenceinterval, metrologisk sporbarhed, korrekthed, analytisk specificitet, metodesammenligning og præcisionsbestemmelse(3). Statens institut for medicinsk teknologivurdering (MTV) har ligeledes formuleret nogle retningslinjer, med det formål at klarlægge relevante konsekvenser af anvendelsen af medicinsk teknologi. Dette sker gennem analyse og vurdering af følgende fire hovedelementer: Patienten, økonomi, organisation og teknologi. Herigennem klarlægges hvad det nye udstyr, eller metode kan og hvilken konsekvens det for eksempel har for patienterne, afdelingen, sikkerhed og miljøet. MTV bør anvendes på alle niveauer i sundhedsvæsenet og bør ideelt benyttes inden der tages beslutning om at indføre en ny teknologi i den daglige rutine(4). I beslutningsprocessen i forbindelse med hvorvidt et nyt udstyr eller en ny analyse skal implementeres, er MTV og metodevalidering to redskaber, der supplerer hinanden godt. MTV giver en bred vurdering ud fra de fire nævnte overordnede hovedpunkter, hvor en metodevalidering ud fra mange punkter tvinger til en dybdegående og mere specifik vurdering af det nye udstyr eller den nye analysemetode. Side 5 af 39

7 1.1 Problembaggrund Klinisk Biokemisk Afdeling Sjællands Universitetshospital i Køge (KBA Køge) har i samarbejde med University College Sjælland i Næstved (UCSJ Næstved) overvejet at implementere et nyt analyseudstyr som blandt andet kan detektere Faktor 5 (FV) Leiden mutation i genet der koder for FV. Denne analyse indgår på nuværende tidspunkt som en del af trombofiliudredning, der i region Sjælland analyseres på Roskilde og Næstved sygehus(5,6). Trombofili er en samlet betegnelse for en lang række faktorer, der giver en øget risiko for trombose, især venøs tromboemboli (VTE). Disse indbefatter blandt flere; biokemiske markører, genetiske faktorer, hormonale kontraceptiva (p-piller), graviditet, cancer, samt livsstil. Desuden øges risikofaktoren for hvert 10. leveår. Dyb venetrombose (DVT), er den hyppigst forekommende venøse tromboemboli med ca tilfælde årligt i Danmark. Der findes ikke nogen præcise opgørelser over de økonomiske omkostninger, men sammenligner man antallet af DVT, med de ca årlige tilfælde af blodpropper i hjernen, som koster samfundet i alt ca. 131 mio kr., vil det formentligt ikke være en mindre økonomisk byrde for samfundet. DVT er desuden den tredje største årsag til kardiovaskulære dødsfald i Danmark(7 10). Ved trombofiliudredning undersøges flere markører, herunder Faktor V Leiden (herefter benævnt; FV Leiden). Denne genetiske mutation, betegnes en polymorfi, da den forekommer hos mere end 1 % af befolkningen, nærmere bestemt 7 % af den danske befolkning(11). Polymorfien nedarves autosomalt dominant og anses for at være en af de hyppigste genetiske årsager til trombofili. Den karakteriseres ved en specifik mutation (nukleotid substistution) i position 1691, i det kodende gen for koagulationsfaktoren V. Mutationen resulterer i en kraftigt forøget koagulationsevne af blodet og dermed en øget risiko for trombose (se figur 1). Figur 1: a) Her ses vildtypen faktor V, hvor APC passer til bindingsstedet på faktor Va, Dette resulterer i en hurtig kløvning af proteinet, til den inaktive form faktor Vi. Figur1 b) her ses mutationen faktor V Leiden, hvor APC bindingsstedet er blevet ændret, således at APC, ikke længere passer i bindingsstedet. Dette resulterer i en langsommere spaltning/kløvning af Faktor Va (APC resistens)(12) Figurens Kilde: Side 6 af 39

8 Faktor V er en af de essentielle koagulationsfaktorer i koagulationskaskaden. Dets aktive form, faktor Va, virker som en cofaktor, der aktiverer faktor X, som igangsætter omdannelsen af pro-thrombin til thrombin. Thrombin igangsætter spaltningen af fibrinogen til fibrin, der danner fibrinkoagel. Aktiveret protein C (APC) er en antikoagulant, der spalter og inaktiverer prokoagulationsfaktor Va, der nedregulerer yderligere thrombin dannelse. APC inaktiverer faktor Va, ved at spalte det ved tre forskellige peptider: R306, R506, og R679. Ved FV Leiden mutationen sker der en nukleotidsubstitution af guanin(g) til adenin(a) ved position 1691 i faktor V genet, der forårsager en aminosyreændring af arginin(arg) med glutamin(gln) på 506 APCspaltningsstedet. Denne ændring, gør faktor Va resistent over for APC og inaktiveres derfor 10 gange langsommere, hvilket resulterer i en langsommere nedbrydning af thrombin, der derved kan udøve sin pro-koagulerende effekt i længere tid (se figur 2) (13),(14). Figur 2: Illustration af normal Faktor V og Faktor V Leiden mutation. Ved inaktivering af FVa spalter Aktiveret Protein C (APC) bindingerne mellem de tre peptider (R306, R506 og R679) som nedregulerer trombin dannelsen. Ved FV Leiden mutation sker en nukleotidsubstitution på genet ved position 1691 hvor guanin(g) bliver ændret til adenin(a), som medfører en aminosyreændring af argenin(arg) til glutamin(gln). Derved sker en ændring af proteinet R506, som hæmmer APC s nedregulering af trombin dannelse(13)(14). Figurens Kilde: Activation-and-degradation-of-normal-FV-and-FV-Leiden-FV-circulates-as-a Tilstedeværelse af FV Leiden øger risikoen for VTE ca. 7 gange hos heterozygote og helt op til ca. 80 gange hos homozygote, sammenlignet med den øvrige befolkning. Hos heterozygote p-pille brugere, stiger risikoen for VTE ca. 30 gange, sammenlignet med ikke-brugere, som ikke har FV Leiden. Hos gravide er det observeret, at op til ca. 50% med venøs tromboemboli, har trombofili. Her er FV Leiden igen, en af de hyppigste genetiske årsager. Derudover er der set en markant forhøjet incidens hos cancerpatienter, hvor der i et studie (14), er påvist en risiko på 13 % for, at en cancerpatient med FV Leiden, udvikler VTE (8,13,15 17) Ved diagnosticering og detektering af FV Leiden, anvendes på nuværende tidspunkt Real-Time Polymerase Chain Reaction (qpcr), hvor forskellige in-house analysemetoder bliver anvendt, alt efter hvilke PCR apparatur og metoder der i forvejen er valideret og implementeret på de biokemiske afdelinger. Firmaet LaCAR har udviklet et nyt analyseapparatur LC Genie III, som i Danmark forhandles af TrioLab. Apparaturet benytter Loop-mediated isothermal Side 7 af 39

9 amplifikation(lamp) teknologi, som giver mulighed for at detektere single nukleotid polymorfismer (SNP) på 25 minutter, hvor Ethylen Diamin Tetra Acetat (EDTA) fuldblodsprøver kan benyttes uden ekstraktion af DNA. Instrumentet kan på nuværende tidspunkt detektere fem forskellige sygdomme/anomalier. Herunder indgår Faktor II, Faktor V, Human hemochromatosis protein (HFE), Methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) og seglcelleanæmi(18). LC Genie III kan analysere seks patientprøver ad gangen, som gør det velegnet til afdelinger, med et mindre antal patientprøver, og klinisk biokemiske afdelinger som på Køge Universitetshospital, der overvejer at indføre analysen på eget laboratorium. Derudover er instrumentet vandtæt, vejer kun 2 kg og selve analysen til svar, tager kun 30 minutter, dette kunne gøre det velegnet til analyser i felten (u-lande), eller udekørende laboratoriebusser(dk). Da der på de afdelinger, hvor der udføres FV Leiden analyser, allerede er qpcr apparatur, og derudover taget i perspektiv, at disse afdelinger ofte udfører et større antal patientprøver ad gangen, er det af særlig interesse, at der fra LaCAR forefindes protokol til brug på CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System (CFX96 Touch, Bio-Rad) og Lightcycler 480 (Roche). Det vil sige at samme analysekit kan benyttes, og der kan analyseres op til 96 patientprøver ad gangen, på afdelingernes nuværende apparatur(19). 1.2 LAMP analyseprincip LAMP benytter en konstant temperatur mellem 60-65, til amplificering af target DNA. Ifølge TrioLab skulle denne nye metode med sine specialdesignede loopprimerregion, Bacillus stearothermophilus (Bst) polymerase og konstante temperatur være hurtigere og mere effektiv til at amplificere DNA med en høj specificitet (16). Metoden består typisk af seks specialdesignede primere, som genkender seks forskellige sekvenser på target DNA. Bst-polymerasen har helicaseaktivitet, som resulterer i en høj deplacerings- og replikationsaktivitet mellem nukleotiderne. Således bliver amplifikationen af target DNA til specifikke enkeltstrenget selv-hybridiseringsloop, som under DNA replikationen bliver til to dobbelt loops også kaldet LAMP dumbbell strukturer, som så kan lave multi-loop-komplekser med deres selv-primer region og derved danne katamer (se figur 3) (20). Side 8 af 39

10 Side 9 af 39

11 Figur 3: Øverst til venstre (a) ses target DNA, forward outer primer (F3 primer) og backward outer primer (B3 primer). Derudover ses der to sammenkoblede primers, en forward inner primer (FIP) med en tilhørende sekvens F2 som er komplementær til target F2c sekvensen. Det samme gælder backward inner primer (BIP) med en tilhørende sekvens B2 som er komplementær til target sekvensen B2c. Øverst til højre i figuren (b) ses hvordan DNA replikationen således vil danne specifikke enkeltstrenget selv-hybridiserings-loop med dobbelt loop-struktur (dumbbell structure) Nederst i figuren (c) ses hvordan amplifikationen af de enkeltstrengede selv-hybridisering-loop danner multi-loop komplekser, for til sidst at danne katamer som ses i tegning 11 og 12 (20). Figurens kilde: Side 10 af 39

12 Tilstedeværelsen af heterozygot, homozygot mutant og homozygot vildtype alleler kan identificeres ved hjælp af smeltekurver, baseret på fluorescens-mærkede prober, sunder gradvis temperaturøgning til 90. Da de fluorescensmærkede prober er designet specifikt til baserne i homozygot vildtype-genet vil en ændring af bindingerne mellem baserne, som hos heterozygot og homozygot mutant bevirke at fluorescensen vil kunne observeres ved lavere temperatur i smeltekurven end ved vildtypen (se figur 4)(18,20). Tilstedeværelsen af heterozygot, homozygot mutant og homozygot vildtype alleler kan identificeres ved hjælp af smeltekurver, baseret på fluorescens-mærkede prober, under gradvis temperaturøgning til 90. Da de fluorecensmærkede prober er designet specifikt til baserne i homozygot vildtype-genet vil en ændring af bindingerne mellem baserne, som hos heterozygot og homozygot mutant bevirke at fluorescensen vil kunne observeres ved lavere temperatur i smeltekurven end ved vildtypen (se figur 4)(18,20) Figur 4: illustrerer princippet bag smeltekurveanalysen. Der ses to target SNP s, den øverste med punktmutationen for Faktor V Leiden, og den nederste er vild typen. Til venstre i figuren er der hybridiseret specifikke prober til amplifikationstarget og det ses at der er quenching mellem fluoreforen(reporteren) og quencheren. Disse prober er mærket med FAM-farvestof og designet til vild type allelen og indeholder derfor cytecin som det ses i figuren. Idet der er stærkere binding mellem cytocin og guanin end der er mellem cytocin og adenin kræver det en højere temperatur før proben frigives fra vild typen. Dette visualiseres i kurverne øverst i figuren, hvor det første peak er en homozygot mutant med en lavere smeltetemperatur, end vild typen, som har det største peak. Derudover ses også en kurve for en heterozygot prøve med to peaks(18). Figurens Kilde: LAMP Human FV-LEIDEN KIT. Ved analysering på LC Genie III har LaCAR fastsat detektionsgrænser for smeltepunktstemperaturen og fluorescenceniveauet, så det er muligt at skelne mellem Side 11 af 39

13 positive og negative kontroller, heterozygot, homozygot mutant og vildtyper som ses i tabel 1 og 2. Prøver med smeltepunktstemperaturer eller fluorescenceniveau uden for detektionsgrænsen kan forekomme, derfor kan der opstå resultater, hvor smeltekurven bliver invalid. En reanalysering af de pågældende prøver vil derfor være påkrævet. Detektionsgrænserne bruges desuden også til kontrollerne, hvor apparaturet kan skelne mellem valide og invalide kontroller, så eventuelle artefakter eller instrumentfejl kan detekteres. Tabel 1: Detektionsgrænser for kontroller angivet af LaCAR 53,5 +/-1 Fluo>700 63,8 +/-1 Fluo>700 Positiv kontrol Tilstede Tilstede Negativ Kontrol Fraværende Fraværende Tabel 2: Detektionsgrænser for blodprøver angivet af LaCAR 53,9 +/-1 Fluo>700 63,1 +/-1 Fluo>700 Foreslået genotype Tilstede Tilstede Heterozygot Tilstede Fraværende Homozygot mutant Fraværende Tilstede Homozygot vildtype Fraværende Fraværende ingen amplifikation 1.3 Afgrænsning Trombofiliudredning udføres på nuværende tidspunkt i Region Sjælland, på KBA i Næstved og Roskilde. Da indsamling af fuldblodsprøver til indeværende projekt foregik i et samarbejde med KBA på henholdsvis Skejby og Roskilde Sygehus bliver analysemetoderne herfra sammenlignet kvalitativt med den nye analysemetode LAMP på LC Genie III. Både KBA i Skejby og Roskilde benytter i dag selvudviklede analysemetoder til diagnosticeringen af FV Leiden. I Skejby analyseres smeltekurven på Lightscanner (LS96, Idaho Technology) og Roskilde benytter QuantStudio (Life Technologies)(5). LC Genie III er godkendt af Conformité Européenne og kan anvendes in-vitro diagnostisk (CE-IVD mærket), hvilket vil sige at metoden er godkendt indenfor EUlovgivningen og produktet har gennemgået en omfattende validering af producenten inden markedsføring(21). Når et produkt er CE-IVD mærket er det ifølge retningslinjerne fra DSKB, tilstrækkeligt med en verifikation, hvor det vurderes om det nye analyseinstrument virker efter hensigten i eget laboratorium, ud fra relevante punkter fra en metodevalidering(2). Derfor er indeværende projekt opbygget ud fra følgende struktur: Det praktiske forsøg inddeles i to delforsøg og et pilotforsøg. Det første delforsøg er en metodesammenligning, for at vurdere overensstemmelsen mellem resultaterne fra Side 12 af 39

14 analysemetoderne anvendt på KBA Roskilde og KBA Skejby og resultaterne fra LC Genie III. Delforsøg 2 er en præcisionsbestemmelse inddelt i en inter- og intraseriel præcision. Pilotforsøget er en undersøgelse af Lamp Human FV Leiden analysekit på CFX96 Touch. I denne undersøgelse vil seks prøver med hver genotype; heterozygot, homozygot mutant og vildtype, blive testet på CFX96 Touch, for at kunne vurdere om analysekittet fra LaCAR til detektion af FV Leiden kan anvendes på andet qpcr apparatur. Derudover vil følgende punkter blive berørt ud fra oplysninger givet af LaCAR: Præanalytiske forhold, robusthed, krav og kvalitetsmål, samt analytisk specificitet sammenholdt med dette projekts resultater (2). Forsøgsdesignet laves ud fra mængden af reagens til rådighed, og så kravene fra DSKBs anbefaling til metodesammenligning, så vidt muligt efterkommes. Af disse årsager vil de positive kontroller fra det medfølgende analyse-kit blive anvendt til interseriel præcision, da disse i forvejen er med i hver opstilling. Ved den intraserielle præcision vil genotypen heterozygot blive analyseret seks gange i samme opsæt. 1.4 Problemformulering For at kunne vurdere, hvorvidt det er fordelagtigt økonomisk og organisatorisk, at implementere et nyt analyseinstrument, ønsker KBA Køge en verifikation og MTV af den nye analysemetode og -apparat, LC Genie III. Indeværende projekt er udarbejdet ud fra følgende problemformulering og underspørgsmål: Hvilke fordele kan LC Genie III, som har den fordel at kunne detektere direkte på EDTA fuldblod, bidrage med i forhold til detektion af FV Leiden og implementering på Universitetshospitalet Klinisk Biokemisk Afdeling i Køge, vurderet ud fra en verifikation og MTV? Hvilke resultater, vurderet ud fra sensitivitet og specificitet, giver metodesammenligningen i delforsøg 1, hvor FV Leiden analyseret på henholdsvis det nye analyseudstyr, LC Genie III, og de nuværende anvendte qpcr metoder sammenlignes? Hvordan er den interserielle præcision i delforsøg 2.1 af Lamp Human FV Leiden positive kitkontroller? Hvordan er den i delforsøg 2.2 intraserielle præcision på EDTA fuldblodsprøvemateriale? Hvilke resultater fremkommer af pilotforsøget, hvor Lamp Human FV Leiden analysekit anvendes på CFX96 Touch? Denne problemformulering vil blive belyst ud fra resultaterne af verifikationen af LC Genie III, oplysninger fra LaCAR samt øvrig relevant litteratur omhandlende lignende studier i en diskussion, hvor også de fire hovedpunkter fra MTV inddrages. Dermed menes et fyldestgørende vurderingsgrundlag at kunne opnås, så det kan konkluderes Side 13 af 39

15 hvorvidt LC Genie III virker som forventet, og lever op til de på forhånd opstillede mål og kvalitetskrav. 1.5 Metodiske overvejelser Indeværende projekt er et kvalitetssikringsstudie, hvor det essentielle er at vurdere hvorvidt LC Genie III lever op til akkrediteringsstandarderne, så den kan implementeres på KBA Køge. Derfor følges vejledningen til metodevalidering fra DSKB, og dermed er metoden for laboratoriearbejdet til dels fastlagt, da der heri er specifikke krav til udførelsen af en metodevalidering. Da dette er en verifikation, udføres ikke en fuld metodevalidering, men relevante punkter udvælges fra denne, hvilket giver projektet en struktur som beskrevet i de følgende afsnit. Projektets resultater vil i sidste ende blive diskuteret og understøttet af relevante artikler, søgt ud fra opstillede kriterier til relevans, gyldighed og validitet. Følgende søgeord er blevet brugt: LAMP or loop mediated isothermal amplification, LAMP PCR comparison, FV Leiden mutation or factor V leiden, FV leiden detection, FV leiden full blood,genie III. Fokus i diskussionen vil være fordele og ulemper ved den nye analysemetode, og hvilken betydning det kan have for teknologien, organisationen, økonomien og patienten Forsøgsdesign For at opnå et forsøgsdesign, der giver en dækkende vurdering af LC Genie III og det tilhørende analysekit Human Lamp FV Leidens performance, vil analysering af prøverne, som tidligere beskrevet, blive inddelt i to delforsøg og et pilotforsøg: En metodesammenligning, en præcisionsbestemmelse opdelt i en interseriel præcision udført på positive kitkontroller, og en intraseriel præcision udført på EDTA fuldblodsprøvemateriale. Samt et pilotforsøg, hvor der analyseres på CFX96 Touch, for at undersøge om LAMP Human FV Leiden kittet kan anvendes på dette instrument. Metodesammenligningen benyttes til vurdering af korrelationen, samt robusthed af den nye analysemetode LAMP sammenlignet med referencemetoden qpcr. Hertil vil en interseriel præcisionsbestemmelse, kunne bidrage til en vudering af LAMP metodens intermediære performance med forskellige operatører over længere tid, som afspejler den daglige rutine bedst muligt. En intraseriel præcisionsbestemmelse vil bidrage til vurderingen af metodens repeterbarhed, hvor performance af ensartethed med én heterozygot prøve inden for kort tid testes i samme opsæt (22). Ved metodesammenligning vil 34 EDTA fuldblodsprøver blive analyseret på LC Genie III. Resultaterne herfra sammenlignes med resultaterne af samme prøver, fremkommet ved analyse med de nuværende in-house detektionsmetoder, som benytter qpcr til detektion af FV Leiden. Der tages højde for mængden af reagens til rådighed, og til trods for, at det var ønskeligt at analysere flere end 34 prøver, kan der argumenteres for, at antallet af prøver er tilstrækkeligt til at danne en grundlæggende vurdering af apparaturets performance. Dette især set i lyset af, at det er en kvalitativ analysemetode, hvor der ikke nødvendigvis udføres omfattende statistiske beregninger i modsætning til Side 14 af 39

16 kvantitative analyser. Desuden har den biologiske variation ingen indflydelse ved genetisk mutation, da man enten er mutant eller vildtype, og derfor kræver metodesammenligningen ikke en større datamængde. Den interserielle præcision foretages sideløbende i delforsøget med metodesammenligningen, idet de positive kontroller fra hver opstilling anvendes. Dermed udnyttes reagenserne bedst muligt. Disse positive kit-kontroller er fremstillet af plasmid DNA, indeholdende vildtype sekvensen for FV genet og plasmid DNA med sekvensen for polymorfisme mutationen G1691A i forholdet 1:1 (23) Prøveindsamling Ved indsamlingen af prøver efterstræbes der en ligelig fordeling af prøver, der henholdsvis er med og uden FV Leiden mutation, dermed vil der ikke opstå bias i forbindelse med udregningerne af sensitivitet og specificitet. Ved analyseringen af prøverne vil disse blive randomiseret, således at tidligere prøvesvar ikke på forhånd er kendt. Dette vil bidrage til, at forsøgene ligner den daglige rutine på de kliniske afdelinger Resultater Resultaterne af analyserne er kvalitative data, derfor beregnes sensitivitet og specificitet, samt prædiktive værdier. Effektiviteten beregnes ud fra sensitiviteten og specificiteten, som indikerer, hvor god analysens evne er, til at stille den korrekte diagnose. De prædiktive værdier beregnes, for at vurdere sandsynligheden for, at en person med et positivt analysesvar faktisk er syg. Disse resultater vil blive opstillet i skematisk form. For at beregne, om der er klinisk signifikant forskel på de to analysemetoder, anvendes den non-parametriske test McNemar. Denne statistiske test er valgt, da data er kvalitative og parrede, idet forsøgene baserer sig på en sammenligning, der vurderer effektiviteten af metoderne med samme analyt: qpcr som referencemetode, overfor LAMP metoden på LC Genie III. Der opstilles hypoteser og signifikansniveauet sættes til p<0,05 som er afgørende for, om de opstillede hypoteser forkastes eller verificeres (22) Krav og kvalitetsmål Der fastsættes på forhånd krav til analysemetoden, der er afgørende for om resultaterne er acceptable og om apparaturet kan implementeres. Dette er en kvalitativ bedømmelse, og derfor sættes kvalitetsmålet for metodesammenligningen, til opnåelse af samme genotyper på LC Genie III og referencemetoden, der sammenlignes med. Acceptkriterierne for både metodesammenligningen og præcisionsbestemmelsen er 100 % overensstemmelse, dog er det kendt på forhånd, at der kan forekomme invalide analyser. Dette er acceptabelt i de tilfælde, hvor der fremkommer korrekt genotypning efter gentagelse af analysering. Ved invalide resultater vurderes den pågældende prøve ved en reanalysering. Invalide resultater skyldes ofte, at prøven falder udenfor de fastsatte detektionsgrænser, som bliver til mulige artefakter. Side 15 af 39

17 1.6 Præanalytiske forhold For at opnå optimale og pålidelige resultater, bør instruktionsmanualen fra LaCAR følges nøjagtigt og det er vigtigt med omhyggelig behandling af prøverne gennem hele præ-analysen. Hvis ikke ovenstående overholdes, er der risiko for, at DNA nedbrydes eller kontaminering af prøverne, hvilket kan resultere i artefakter med invalide og falsk negative resultater Stabilitet/holdbarhed Analysekittet er blevet testet af LaCAR efter fire og otte frys/tø cyklusser, uden der blev observeret forskel på resultaterne. Ligeledes var der heller ikke forskel på kittets performance, efter opbevaring ved +5 sammenholdt med referencekittet som blev opbevaret ved -20 over en periode på 12 uger. LaCAR har lavet en udregning, der viser, at analysekittet kan opbevares ved -20 i op til 2 år. Dette angiver en god holdbarhed, hvor opbevaringen, hvad enten det er på køl eller frys, inden for en relativ lang periode, ikke påvirker resultaterne. Ifølge den Regionale Præanalytisk Vejledning (PAV) er holdbarheden for FV Leiden på EDTA fuldblodsprøvemateriale: Syv døgn ved , 30 døgn ved +2-8 og flere år ved Detektionsgrænser Forstudierne fra LaCAR viser, at en volumen mellem 1 µl og 20 µl kan anvendes, når prøvematerialet er fuldblod. Instruktionen foreskriver 5 µl, dermed skulle der være rigeligt DNA-materiale til amplifikationen. Dette spænd mellem nedre og øvre detektionsgrænser bevirker, at kravene til afpipetteringen af de 5 µl ikke er ekstremt høje, da en mindre unøjagtighed ikke påvirker resultatet. Dog vides det, at blodets farve kan interferere med fluorescenssignalet, og derfor bør der ikke anvendes mere end de foreskrevne 5 µl til 1000 µl lyseringsbuffer. Side 16 af 39

18 2. Metode og materialer De to delforsøg blev udført på LaCAR Genie III TM (Optigene Ltd., v3.16) og pilotforsøget på CFX 96 Touch, hvor softwaren Bio-Rad CFX Manager 3.1 fra 2012 blev benyttet til illustrering af smeltekurver. Til alle delforsøg blev der indsamlet 34 EDTA fuldblodsprøver fra henholdsvis KBA i Roskilde og KBA i Skejby. Prøverne var en blanding af homozygot vildtyper, homozygote mutante og heterozygot. Derudover blev der taget to blodprøver fra donorer kendt med FVL - både en homozygot og en heterozygot, samt en blodprøve med FV vildtype. Blodprøverne blev taget efter foreskrevne instrukser samt samtykke, hvor deltagernes underskrift blev indsamlet. Lamp Human FV LEIDEN KIT (rs6025) (LaCar MDx Belgien, REF: LC-FVL-LP-24) blev anvendt til alle tre delforsøg. Dette indeholdt Lysis Buffer (LC-FVL-LB) til lysering af prøvemateriale, reaktionsmix bestående af Primers/Probes/Buffer/dNTPs/Enzyme (LC-FVL-RB) samt en positiv kontrol og PCR-vand til negativ kontrol (se figur 5). Figur 5: Flowdiagrammet illustrerer projektets delforsøg 1 og 2 udført på LC Genie III samt pilotforsøget udført på CFX96 Touch, hvor LAMP Human FV LEIDEN KIT blev brugt til alle forsøg. I kolonnerne som læses vandret mod højre, ses forsøgenes fremgangsmåde. Side 17 af 39

19 2.1. Analysering af prøver Forberedelse af prøve- og kontrolmateriale var ens for alle prøver i de tre forsøg. De blev udført i separat PCR-laboratorium til dette formål, efter forskrifterne fra LaCAR s Quick guide protokol - lysering med Lamp Human FV LEIDEN KIT (rs6025) (se figur 6). Forberedelse af Lamp-reaktionerne var ligeledes ens ved de tre forsøg og blev udført i præ-pcr-lab efter forskrifterne fra LaCAR s Quick guide protokol - Lamp Human FV LEIDEN KIT (rs6025) (se figur 6). LAMP og smeltekurve på LC Genie III blev foretaget i separat laboratorium. Figur 6: Flowdiagram illustrere fremgangsmåden ved prøve- og LAMP forberedelse med LAMP Human FV LEIDEN kit inden analysering. Ved analysering på CFX96 Touch, blev protokollen fra kitindlægget version 4.1 fulgt ved programmeringen af instrumentet, med undtagelse af intervallet mellem de enkelte steps, hvor instruktionen foreskriver en stigning på 0,5 mellem hvert step og 5 sekunder på de enkelte steps. I dette delforsøg blev smeltekurven programmeret til kun at stige 0,2 ad gangen og 10 sekunder på hvert step for at optimere dataopsamlingen. 2.2 Kvalitetssikring I hvert opsæt var der en positiv og negativ kontrol. Den positive kontrol inkluderes for at sikre effektiviteten af analyserne, og den negative kontrol for at monitorere kontaminering - enten af reagenserne eller fra omgivelserne. Derfor blev der også taget forbehold for dette, så forberedelse af prøvematerialet blev udført i ét laboratorium og afpipettering af reaktionsbuffer i et andet laboratorium. For yderligere at undgå kontaminering, blev der anvendt DNase-frie pipettespidser med filter og amplifikationen foregik i et separat rum (23). Alle krav til temperatur, holdbarhed og antallet af frys/tø cyklusser af reagenser og prøvemateriale, blev overholdt i overensstemmelse med instruktionen fra LaCAR og PAV (se afsnit 1.6.1) (23). Side 18 af 39

20 2.3 Databehandling Analyseresultaterne er kvalitative data, hvor sensitivitet og specificitet, samt prædiktive værdier blev beregnet ud fra følgende formler: Sensitivitet = Antal sandt positive/antal syge Specificitet = Antal sandt negative/antal raske Effektiviteten = sande/alle = (sandt positive + sandt negative) / alle. Positive prædiktive værdi PPV = antal sandt positive/antal positive Negative prædiktive værdi NPV = antal sandt negative/antal negative Desuden blev McNemar anvendt til at beregne, om der er klinisk signifikant forskel på de to analysemetoder. Signifikansniveau blev sat til p<0,005 (5%). Analyseresultaterne fra hhv. PCR- og LAMP-metode blev indsat i skematisk form, hvor resultaterne blev opdelt i vildtype og mutant. Hypotesernes p-værdier blev beregnet ud fra følgende formler: H0 : X 2 = (b - c) 2 /b + c og H1: X 2 = ([b - c] -1) 2 /b + c, hvorefter de blev forkastet eller verificeret. Alle resultater blev opstillet i skematisk form og beregnet i programmet Microsoft Office Excel 2010 (Microsoft Corporation) (22,24). Side 19 af 39

21 3. Resultater 3.1 Delforsøg 1 - Metodesammenligning I metodesammenligningen indgik resultater fra 28 ud af de i alt 34 EDTA fuldblodsprøver i beregningerne. Prøverne blev analyseret på LC Genie III som benytter LAMP metoden. Resultaterne fra LC Genie III blev sammenlignet med referencemetodens prøvesvar fra henholdsvis KBA i Roskilde og Skejby. Tabel 3 illustrerer en 2x2 tabel, hvor resultaterne fra LC Genie III blev inddelt i positive og negative test, alt efter udfaldet af genotypen sammenlignet med referencemetodens prøveresultat af genotype. I tabel 3 indgik 11 prøver med homozygote vildtype, fire prøver med homozygot mutant, 13 prøver med heterozygot. Der blev udelukkende brugt resultater med valide negative og positive kontroller til beregningerne, derfor blev seks, af de i alt 34 EDTA fuldblodsprøver, ikke medtaget i resultaterne, da den negative kontrol var invalid. (Se afsnit artefakter) Nedenfor tabel 3 ses metodens diagnostiske sensitivitet og specificitet. Tabel 3: Sammenligning af resultaterne fra LC Genie III og referencemetoden. LC Genie III LAMP. metode: Referencemetode: qpcr Mutant (syg) Vildtype (rask) Total positive test 17 (SP 1 ) 0 (FP 2 ) 17 Negative test 0 (FN 3 ) 11 (SN 4 ) 11 Total Udregning af sensitivitet og specificitet: Diagnostisk sensitivitet: SP/(SP+FN) = 100 % Diagnostisk specificitet: SN/(SN+FP) = 100 % Effektiviteten: (SP+SN)/Alle = 100 % Positive prædiktive værdi: SP/(SP+FP) = 100 % Negative prædiktive værdi: SN/(SN+FN) = 100 % 1. SP: Sand positiv. 2. FP: Falsk positiv. 3. FN: Falsk negativ. 4. SN: Sand negativ. Side 20 af 39

22 Resultaterne fra LC Genie III blev opdelt i ja eller nej alt efter udfaldet sammenlignet med referencemetodens prøveresultater, som illustreret i tabel 4. Under tabel 4 ses de opstillede hypoteser, samt beregningen af den signifikante forskel på de to metoder ved brug af McNemar test. Tabel 4: Resultater af McNemar test. Faktor V Leiden (qpcr) Ja Nej Total Efter analysering på LC Genie III (LAMP PCR) Ja 17 (a) 0 (b) 17 (e) Nej 0 (c) 11 (d) 11 (f) Total 17 (g) 11 (h) 28 (n) Hypoteser: H0: (b = c) Anvendelse af LC Genie III til detektion af Faktor V Leiden udgør ingen forskel. H1: (b c) Anvendelsen af LC Genie III til detektion af Faktor V Leiden udgør en forskel. Der er valgt et signifikansniveau på p<0,05. Som det fremgår af tabel 4 er der ingen uoverensstemmelse mellem resultaterne for LC Genie III og referencemetoden. Den signifikante forskel var derfor ikke mulig at beregne, da b og c er 0, som er defineret ved nedenstående X 2 ligning: Artefakter X2 = (b c) 2 /(b + c) Figur 7 illustrerer den invalide negative kontrol med et peak ved 53,59 C (pink), disse identifikationer blev derfor ikke medregnet i ovenstående resultater, da analysen indikerer et artefakt i form af kontaminering. Side 21 af 39

23 Figur 7: Kurverne illustrerer seks patientprøver (analyse nr ) samt en positiv (lilla) og negativ kontrol (pink). Den pink kurve med en høj peak på 53,59 indikerer at kontrollen er blevet kontamineret. De øvrige kurver viser henholdsvis tre heterozygote (rød, orange og gul) med to peaks og tre homozygote (grøn, lyseblå og blå) normale kurver med en peak omkring 62,9. Resultaterne i tabel 5 viser untested ud for genotypen, som er en følge af, at den negative kontrol blev invalid. Der blev stadig detekteret smeltepunkter på tre heterozygote og tre homozygot vildtype prøver. Tabel 5: Opsætning af analyse nr med invalid negativ kontrol. 3.2 Delforsøg 2 - præcisionsbestemmelse Der blev udført en interseriel præcisionsbestemmelse på fem positive kontroller, samt en intraseriel præcision på en heterozygot EDTA fuldblodsprøve Interseriel præcision på positive kit-kontroller Ud fra resultaterne af de fem valide positive kontroller, som indgik i denne præcisionsbestemmelse, ses i tabel 6 en præcision på 100 %, hvor alle kontroller viser peaks ved 54 +/-1 og 63 +/-1, som indikerer heterozygot mutant. Side 22 af 39

24 Tabel 6: Interseriel præcision baseret på positive kontroller medtaget i hvert opsæt Intraseriel præcision på EDTA fuldblod, heterozygot prøvemateriale Resultaterne fra dette delforsøg viste, at der var fem heterozygote prøver og en invalid prøve (figur 8), hvilket giver en intraseriel præcision på 83,33 %. Resultatet er dog ikke endegyldigt, da den invalide prøve efter forskrifterne fra LaCAR skal reanalyseres. Men da mængden af reagens til rådighed ikke var tilstrækkelig, var dette ikke muligt. Tolkes smeltetemperaturerne nærmere, ses det første peak for den invalide prøve på 55,02, og som det ses i tabel 2, er grænserne for smeltepunkterne for den første peak i en heterozygot prøve på 53,9 +/- 1. Den invalide prøve havde altså en smeltetemperatur der var 0,3 for høj til at blive valid. Figur 8: Kurverne viser fem heterozygote prøver med to peaks og en invalid prøve, samt en positiv heterozygot kontrol (lilla) og en negativ kontrol (pink kurve). I tabel 7 ses 5 heterozygote genotyper med to peaks og en invalid prøve. Smeltetemperaturerne viser, at den invalide prøve har en anelse højere smeltetemperatur på begge peaks, end de øvrige prøver. Side 23 af 39

25 Tabel 7: Intraseriel præcision baseret på heterozygote prøver. 3.3 Delforsøg 3 - Pilotforsøg Figur 9 og tabel 8 viser resultaterne for pilotforsøget, hvor funktionen af Lamp Human FV Leiden analysekit på CFX96 Touch fra Bio-Rad undersøges. Kurverne i figur 9 viser to vildtyper (pink og gul), to heterozygote (lyseblå og orange) og to homozygote mutante prøver (lilla og blå), kurverne illustrerer samtidig et lavt fluorescenceniveau, hvor de homozygote ligger omkring 150 og heterozygote ligger omkring de 70, hvor det forventet er >700 (se tabel 2). Derudover viser kurven for den positive kontrol en flad peak (grøn), hvilket indikerer, at der ikke har været noget kontrolmateriale, der kunne amplificeres. I tabel 8 ser resultaterne anderledes ud, idet smeltepunktstemperaturerne for de enkelte prøver, i forhold til detektionsgrænserne, tolkes til, at prøve nr. 26 er invalid da smeltepunktstemperaturen skal ligge mellem 48,0-51,0. Prøve nr. 27 er vildtype og de resterende fire prøver er heterozygote. Figur 9: Ovenstående ses kurverne for de seks patientprøver (pink, gul, lyseblå, orange, lilla og blå) samt en positiv (grøn) og negativ (rød) kontrol. Vurderet udelukkende ud fra kurvernes udseende. Side 24 af 39

26 Tabel 8: Oversigt over smeltetemperatur og genotype for prøverne nr Side 25 af 39

27 4. Diskussion Forsøgsdesignet i indeværende projekt er, som tidligere beskrevet, udført i forhold til at LC Genie III er CE-IVD mærket. Dermed er det tilstrækkeligt, at gennemføre en verifikation, med det formål at vurdere, hvorvidt den nye analysemetode fungerer efter hensigten i eget laboratorium, og lever op til de på forhånd opstillede krav og kvalitetsmål. Denne diskussion vil tage læseren igennem projektets resultater, og diskutere dem i forhold til videnskabelig litteratur indeholdende resultater fra lignende studier. I denne del af diskussionen inddrages også sammenligning af referencemetoden qpcr, og den nye metode LAMP, ligeledes understøttet af relevant litteratur. Derudover vil LaCAR s data for analytisk specificitet og robusthed blive diskuteret, og sammenholdt med resultaterne fra metodesammenligningen i delforsøg 1. Til sidst i afsnittet diskuteres resultaterne i forhold til de fire hovedpunkter i MTV en: Teknologi, økonomi, organisation og patient Metodesammenligning Ud fra resultaterne opnået i dette projekt, ses en tilstrækkelig høj diagnostisk specificitet på 100 %, hvilket lever op til forsøgets på forhånd fastsatte kvalitetsmål. Resultaterne udgør en beregning, hvor kun valide prøver er medregnet, hvor der ses en diagnostisk sensitivitet på 100 %. Dette er på baggrund af en efterfølgende reanalysering af en invalid test, hvor en korrekt identifikation viste homozygot mutant, som dernæst blev medregnet, hvilket er inden for acceptkriterierne. Det vil sige, at efter forskrifterne fra LaCAR om reanalysering af invalide test, viser dette projekts resultater derfor en korrelation på 100 %. Smeltetemperaturerne for den invalide prøve i metodesammenligningen lå på 55,01 og 64,03, hvor den fastsatte detektionsgrænse for heterozygot genotype ligger ved 53,9 +/-1 C og 63,1 +/- 1 C. Smeltepunkterne ligger altså meget tæt på detektionsgrænsen, men dette er formentlig årsagen til, at prøven blev invalid ved første analysering. I den daglige rutine, hvor der ikke er kendskab til genotypen på forhånd, kunne årsagen til den invalide test være prøverelateret, men det er næppe tilfældet i dette forsøg. Da invalide prøver kan forekomme ved analysering, kunne en vurdering af analysens robusthed med fordel belyses ved et ekstra delforsøg, hvor for eksempel tre forskellige lot-nummer testes på samme prøve på alle genotyper. Det ville gøre det muligt, at vurdere sammenhængen mellem resultaterne af de forskellige lot numre, og dermed vurdere analysens robusthed. LaCAR har i deres egen validering udført en robusthedsanalyse, hvor 108 prøver blev analyseret med tre forskellige operatører på to forskellige laboratorier. Undersøgelsen viste en overensstemmelse mellem korrekte svar og antal prøver på 97,22%. Side 26 af 39

28 I dette projekts resultater ses i figur 7, at analyse nr er untestet, hvilket kan observeres ud for genotypen i tabel 5. Dette skyldes artefakt i den negative kontrol, som er invalid. Det er indikation for, at der er sket en reaktion i kontrollen på grund af kontaminering. Hvis resultaterne vurderes udelukkende ud fra kurverne og smeltetemperaturerne, ses tre prøver at være heterozygote mutante og tre prøver homozygote vildtype. Apparatet fortæller helt som det skal, at resultaterne er ugyldige, for selv om kurverne for patientprøverne ikke viser tegn på kontaminering, kan dette ikke vides med sikkerhed, og prøverne bør analysere igen. Da der i dette tilfælde, ikke var mere reagens til rådighed, var dette ikke muligt. Resultaterne er ikke medtaget i de statistiske beregninger, men i det tilfælde at den negative kontrol havde været valid, ville der formentlig have været 100 % overensstemmelse mellem LC Genie III, og resultaterne opnået med referencemetoden på alle de indsamlede 36 EDTA fuldblodsprøver. I overensstemmende med vores resultater, viser flere studier, at LAMP metoden har en tilstrækkelig høj sensitivitet og specificitet, til at konkordere med referencemetoden. Ved forudgående studierviser LAMP metoden (uanset apparatur og analyse), en specificitet på 100 % (25 28). I et nyt studie fra 2016 har man undersøgt muligheden, for at kunne finde en enkel, hurtig og sensitiv metode til at detektere Ebola virus. LAMP metoden blev i dette tilfælde afprøvet på LC Genie III, med samme mastermix som benyttes i nærværende projekt. Analysemetoden havde ifølge dette nye studie, sensitivitet og specificitet på 100 %, samt en amplifikationstid på min., med resultater efter 30 min. Dette sammenlignet med qpcr, med en amplifikationstid på min., er en stor tidsbesparelse. Desuden nævnes i artiklen, enkeltheden i udførelsen af de præanalytiske trin samt, at der ikke krævedes nogen DNA ekstraktion (25). Dette stemmer overens med vores observationer. I ét studie fra 2012, blev der observeret en anelse lavere sensitivitet af LAMP metoden, på 89,13% sammenlignet med qpcr på 91,1 % (26). Derimod anses en sensitivitet på 89,13% i dette tilfælde stadig som værende tilstrækkelig, da specificiteten var på 100%, og samtidig taget i betragtning, at LAMP metoden er betydeligt hurtigere til at amplificere DNA. I et andet studie fra 2012, observeredes en højere sensitivitet af LAMP på 54,5% overfor qpcr 33,3 % (27). Dette er særligt interessant, da qpcr til dato, anses for at være referencemetode for de fleste DNA analyser, heriblandt FV Leiden diagnostisk analyse. Dette sidstnævnte studies analyser er ikke udført på fuldblod, og kan derfor ikke bruges til direkte sammenligning i forhold til fuldblodsanalyse af FV Leiden. Alle studierne tilsammen, inklusiv indeværende, peger på, at LAMP metoden udviser en tilstrækkelig høj performance evne, til at kunne erstatte qpcr ved de mange DNA analyser. Dette kan vise sig at være en fordel, da metoden er både hurtigere og simplere at udføre, end samtlige andre PCR metoder. Dette af flere årsager; LAMP analyserer isotermisk og kræver blot ca min. til at amplificere nok DNA til detektion. Selve smeltekurverne udføres i dette tilfælde, på selve apparaturet LC Genie III og indenfor de 30 min. Det kræver intet særligt udstyr og selve det præanalytiske er hurtigt og simpelt at udføre. Der er færre trin i forberedelsen af prøverne, end ved qpcr, hvor der kræves DNA ekstraktion. De færre trin, er ikke kun tidsbesparende, de nedsætter samtidig risikoen for fejl og kontamination. Side 27 af 39