SNP-detektion i faktor II & faktor V

Transkript

1 SNP-detektion i faktor II & faktor V - En metodesammenligning af LC- Genie III og LightCycler 2.0 på KBA Næstved. Anna Elisabeth Christensen [Skriv her]

2 Professionsbachelorprojekt Bioanalytikeruddannelsen, University College Sjælland Campus Næstved (UCSJ) SNP-detektion af FII og FV en metodesammenligning af LC-Genie III og LightCycler 2.0 på KBA, Næstved Udarbejdet af: Anna Christensen, bn13s014, bn13s043, bn13s026, bn13s029 Projektperiode: d. 10/ / I-vejleder: Adjunkt, Cand. Scient. Kim Blanksøe Pedersen ved University College Sjælland Campus Næstved K-vejleder: Bioanalytikerunderviser, Marianne Birkekær Christensen ved Klinisk Biokemisk Afdeling, Næstved sygehus Antal anslag: Forsidebillede: Billede-id: , fundet den [ ] på via UCSJ s licensaftale. Billede ved sidetal: Billede-id: , fundet den [ ] på via UCSJ s licensaftale. Denne opgave - eller dele heraf - må kun offentliggøres med forfatternes tilladelser.

3 Forord Denne rapport er udarbejdet som skriftligt produkt af det afsluttende professionsbachelorprojekt for Bioanalytikeruddannelsen på UCSJ, Næstved. Rapporten er udarbejdet i perioden , af Anna Elisabeth Christensen,, og i samarbejde med Klinisk Biokemisk Afdeling, Næstved Sygehus. Rapporten er rettet mod en målgruppe med samme professionsmæssige baggrund. En stor tak til klinisk underviser, Marianne Birkekær Christensen ved Klinisk Biokemisk Afdeling, Næstved Sygehus og Adjunkt, Cand. Scient. Kim Blanksø Pedersen ved UCSJ Campus Næstved, for deres løbende vejledning og engagement. Derudover stor tak til kemiker, Palle Lyngsie Pedersen ved Klinisk Biokemisk Afdeling, Næstved for gode råd og godt samarbejde. Ligeledes en stor tak til Klinisk Biokemisk Afdeling, Næstved for ad hoc hjælp og vejledning, samt undervisning i LightCycler 2.0. Ydermere en stor tak til Produktchef, Bettina Borre Buhl ved Triolab for løbende korrespondance, udlån af LC-Genie III, samt levering af reagenser til analyserne, til fordelagtige priser. Sidst men ikke mindst tak til LaCAR MDX Technologies, Liège, Belgien, for hurtig korrespondance og vejledning i forbindelse med arbejdet på LC-Genie III. Anna Elisabeth Christensen Dato: 1

4 Indholdsfortegnelse Forord... 1 Resume... 5 Baggrund... 5 Formål... 5 Materiale og metode... 5 Resultater... 5 Konklusion... 5 Introduktion... 6 Indledning... 6 Faktor V Leiden... 7 Faktor II prothrombin... 7 LightCycler Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET)... 8 Loop-mediated isothermal AMPlification (LAMP) Smeltekurve Validering Afgrænsning Problemformulering Metodiske overvejelser Delvis validering af LC-Genie III Patientprøver og etik Prøvemateriale og simulering af afpipetteringsforsøg Kvalitetssikring Metodisk tilgang Metode

5 Metodesammenligning Sammenligning med LightCycler Afpipetteringsforsøg Detektionsgrænseforsøg Resultater Metodesammenligning af LightCycler 2.0 og LC-Genie III Afpipetteringsforsøg Detektionsgrænseforsøg Økonomi og ergonomi Tid Diskussion Metodesammenligningen Afpipetteringsforsøg Detektionsgrænseforsøg Wildtypespecifik probe og mutationsspecifik probe Anvendelse af plasmidkontroller fra LaCAR Indprogrammerede intervaller - oplæring af personale Økonomi Arbejdstid: Præanalyse: Analyse: Postanalyse: Administrering af ventetid Manuelle afpipetteringer - usikkerhed Ergonomi Databehandling - sporbarhed Konklusion

6 Perspektivering Referenceliste

7 Resume Baggrund Hvert år rammes flere danskere af en dyb venetrombose. Årsagerne til dette kan bl.a. skyldes mutationer i generne, fedme, manglende motion, p-piller, graviditet eller rygning. Patienter der har haft en trombose skal trombofiliudredes. Her undersøges forskellige parametre, bl.a. for mutationer i koagulationsfaktorerne faktor II og faktor V. På Klinisk Biokemisk Afdeling, Næstved udføres analyserne af faktor II mutation og faktor V Leiden, på en LightCycler 2.0. Formål LC-Genie III benytter den nye teknologi: Loop-mediated isothermal amplification, der gør DNAoprensningen unødvendig. Derfor laves en metodesammenligning mellem LightCycler 2.0 og LC- Genie III, hvor det undersøges om LC-Genie III kan erstatte LightCycler 2.0, til analyse af mutationer i faktor II og faktor V. Metodesammenligningen underbygges af parametre, som økonomi, ergonomi og arbejdstid. Materiale og metode På LC-Genie III analyseres patientprøver, der allerede er analyseret på LightCycler 2.0 for faktor II mutation og faktor V Leiden, og udføres på EDTA-stabiliseret fuldblod. For at se om det kan have indflydelse på genotypningen, simuleres der på LC-Genie III, et afpipetteringsforsøg, på kittet for faktor II, hvor mængden af tilsat blod varieres. Til sidst udføres et forsøg på LC-Genie III, hvor detektionsgrænsen for faktor II kittet bestemmes. Resultater Metodesammenligningen viser 100 % overensstemmelse. Dog er LC-Genie III dyrere og kræver flere manuelle afpipetteringer end LightCycler 2.0 og LC-Genie III er længere tid om at analysere, det gennemsnitlige antal prøver afdelingen har om ugen. Konklusion Det kan konkluderes, at LightCycler 2.0 ikke kan erstatte LC-Genie III, da det ikke kan betale sig hverken økonomisk eller tidsmæssigt. 5

8 Introduktion Indledning I Danmark rammes ca af en trombose om året. Ud af disse, er ca af tilfældene en dyb venetrombose (DVT). Halvdelen af tilfældene resulterer efterfølgende i lungeemboli (LE). Årsagerne til tromboser kan både være genetisk og livsstilsbetingede(1). Venøs tromboseemboli (VTE), der er en sammenfatning af LE og DVT, havde en incidens på omkring 1-2 tilfælde pr indbygger i For patienter under 40 år er incidensen 1 ud af pr. år, hvor patienter over 60 år har en incidens på 1 ud af 100 pr. år(2,3). Patienter der har haft DVT, har større risiko for at få et recidiv. Derfor er det vigtigt at de diagnosticeres korrekt og får den rette behandling. Når en patient diagnosticeres med en DVT, eller et eller flere familiemedlemmer har en kendt mutation, der øger risikoen for DVT, udføres en trombofiliudredning. Trombofiliudredningen udføres altid i samråd mellem behandler og patient, og der indhentes informeret samtykke. Trombofiliudredningen afgører, om patienten skal have længerevarende antikoagulant (AK) behandling. I forbindelse med trombofiliudredningen analyseres koagulationsanalyserne; aktiveret partial tromboplastin tid (APTT), D-dimer, homocystin, antithrombin (AT), fibrinogen (FIB) og international normaliseret ratio (INR). Hvis D- dimer er over 0,5 mg/l, sendes patienten til ultralydsscanning, for at bekræfte tilstedeværelsen af en trombe(4). Hvis ultralydsscanningen er positiv, udføres en række analyser på både gener og proteiner. Analyserne består blandt andet, af analysering af enkeltnukleotidmutation/single nucleotide polymorphism (SNP) i generne for koagulationsfaktorerne Faktor II (FII) og Faktor V (FV). Derudover analyseres der inden for hæmatologien, akut-fase proteiner som C-Reaktivt protein (CRP), fibrinogen, homocystein og koagulationsfaktor VIII. Der undersøges ligeledes for protein C og S, samt fosfolipid antistoffer(5). På Klinisk Biokemisk Afdeling (KBA), Næstved sygehus blev der i 2015, analyseret hhv prøver og 1200 prøver for faktor II mutationen (FIIM) og faktor V Leiden (FVL) om året(6). Svaret for hele trombofiliudredningen frigives først fra afdelingens interne resultat-database (BCC- Lab(7)) idet alle analyser er udført. Analyserne for SNP i FII og FV, udføres når der er nok prøver, til 6

9 at analysen er rentabel. Derfor går der 2-3 uger før svaret frigives(5). Trombofiliudredningen er derfor ikke en akut udredning(8). Faktor V Leiden FVL er betegnelsen for en enkeltnukleotidmutation i genet der koder for FV. Mutationen er på placering 1691, hvor adenin erstattes med guanin. Dette forårsager en aminosyreændring af arginin til glutamin. Grundet mutationen, kan protein C ikke inhibere koagulationsfaktor Va, der omdanner prothrombin til thrombin. Dette betyder, at thrombin omdanner mere fibrinogen til fibrin, hvorefter der dannes fibrinclot. Den forhøjede mængde fibrin øger risikoen for venetromboser. FVL er en autosomal, nedarvet, dominant mutation. Derfor kan mutationen nedarves både heterozygot og homozygot. Alt efter om man er heterozygot eller homozygot, er der større risiko for dannelsen af venetromboser. Faktorer som rygning, p-piller, graviditet, fedme og mangel på motion, kan give en øget risiko for dannelse af VTE(5). Prævalensen i Danmark er fordelt, så 7,5 % af befolkningen er heterozygot for FVL mutationen, og 0,2 % af befolkningen er homozygot(9,10). Faktor II prothrombin Ligesom ved FVL, kan en SNP i genet for FII prothrombin, øge risikoen for DVT. Mutationen er en autosomal nedarvet, dominant mutation på placering 20210, hvor guanin erstattes med adenin (G20210A). Genvarianten der undersøges for er > A, der er lokaliseret i 3 : utranslateret region (3 UTR), 14 baser downstream fra poly-adenyleringsstedet (ATA AAA)(11). Mutationen bevirker, at lokationen for spaltningsstedet i mrna ændres, så at nedbrydningen af mrna inhiberes. Dette medfører en øget translation, da mrna kan translateres flere gange, før det nedbrydes. Derfor øges koncentrationen af FII prothrombin i plasma. Patienterne har på grund af den forhøjede koncentration af prothrombin, større risiko for DVT. Heterozygote patienter har en 30 % højere koncentration af prothrombin i plasma hvor homozygote har op til 70 %(12,13). Lige som ved FVL, leder faktorer som rygning, p-piller, graviditet, fedme og mangel på motion, til en øget risiko for dannelse af VTE(5). Prævalensen i Danmark er fordelt, så at 2 % af befolkningen er heterozygote for FIIM(12). 7

10 Analysen af FIIM og FVL udføres på LightCycler 2.0 fra Roche, på KBA, Næstved. LightCycler 2.0 Ved SNP-analyserne af patienternes DNA, analyseres for mutationerne A1691G og G20210A ved hjælp af real time polymerase chain reaction (PCR) på LightCycler 2.0. Patienternes DNA oprenses først, fra fuldblod, på QIAsymphony SPC, fra Qiagen, hvorefter de analyseres på LightCycler 2.0. Selve analysen består af 40 temperaturcykler, hvor hver cyklus består af en denaturering på 95 C, en annealing på 55 C og en elongering på 72 C.Efter amplificeringen, udføres en smeltekurve. Bioanalytikeren markerer kontrollerne som referencekurver i LightCycler 2.0 s software. Derved grupperes alle øvrige smeltekurver efter hvilken referencekurve de ligner mest, og resultatet aflæses. Selve analysen tager ca. 1 time og der kan analyseres op til 32 prøver ad gangen(14), inklusiv 5 kontroller. Den første kontrol består af oprensningen på QIAsymphony. De næste 4 kontroller, består af genomisk DNA, genotypet som henholdsvis; homozygot wild type (WT), heterozygot og homozygot muteret, samt en blindprøve. Ud over de daglige kontroller, udføres eksterne kontroller halvårligt(11). Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) På KBA, Næstved anvendes LightCycler 2.0 til PCR. Den PCR-metode der anvendes, kaldes FRET. Ved FRET anvendes hybridiseringsprober, bestående af en donor-, og acceptorprobe. Under amplificeringen påsættes både en donorprobe med fluoroforen fluorosein, der emitterer grønt lys ved 520nm, og en acceptorprobe med fluoroforen LC640, der emitterer rødt lys ved 640nm. Under amplificeringen, exciteres donorfluoroforen med en lyspåvirkning på 495nm(15). Det emitterede lys fra donorfluoroforen, exciterer efterfølgende acceptorfluoroforen, og amplificeringen kan registreres, da fluorescensen er proportional med mængden af amplificeret DNA. Acceptorfluoroforen emitterer kun lys, hvis den er placeret tæt på donorfluoroforen. Efter endt PCR, udføres en smeltekurve, hvor det amplificerede produkt udsættes for en stigende temperatur, der langsomt denaturerer det amplificerede DNA. Derved slipper både donor-, og acceptorproben. Acceptorproben er designet til at sidde på det locus, hvor punktmutationen kan opstå. Dette betyder, at acceptorproben binder dårligere, hvis der er en punktmutation til stede, 8

11 og dermed falder af allerede ved lave temperaturer. Derfor vil fluoresensniveauet falde hurtigere, hvis der er mutation til stede, og dermed lave en kurve, der peaker ved lav temperatur (Se figur 1, blå kurve). Wild Type (homozygot rask) prøver, har ingen mutation og proberne sidder fast i længst tid. Dette resulterer i en kurve der peaker ved højere temperatur (Se figur 1, rød kurve). Heterozygote prøver har kun mutation på det ene allel, og vil derfor få en peak ved både lav og høj temperatur (Se figur 1, grøn kurve)(11). Figur 1: Illustration fra D4 Region Sjællands Dokumentportal (11). Eksempel på smeltekurve for FII på LightCycler 2.0. Ulemperne ved nuværende metode på LightCycler 2.0 er blandt andet, at det er tidskrævende. På KBA, Næstved er det nødvendigt at en bioanalytiker afsættes til at udføre PCR-analyserne i 2 dage. Da der i dag er udviklet nye DNA-amplificeringsmetoder hvor oprensningen af DNA er unødvendig, kan der argumenteres for, at den nuværende metode potentielt tager længere tid end nødvendigt. Hvis afdelingen konverterer til en analyse uden DNA-oprensning, kan det åbne op for, at den designerede bioanalytiker får muligheden for, at hjælpe til på andre poster på afdelingen, såsom ambulatoriet eller få tildelt andre arbejdsopgaver. Produktionen af kapillærrørene der anvendes til LightCycler 2.0 vil ikke længere blive produceret i fremtiden. Afdelingen er derfor tvunget til at finde et nyt alternativ(16). 9

12 Et muligt alternativ til FRET på LightCycler 2.0. er den nye teknologi Loop-mediated isothermal AMPlification(LAMP) på apparatet LC-Genie III fra LaCAR. Loop-mediated isothermal AMPlification (LAMP) Denne metode kræver ikke forudgående DNA-oprensning, og kan derfor anvendes på fuldblod. Amplificeringen foregår isotermisk; ved en fast temperatur, modsat almindelig PCR, der anvender temperaturcykler. Polymerasen er en BST-lignende polymerase, udvundet af Bacillus stearothermophilius. Polymerasen, der er helikase-aktiv gør det muligt at spalte DNA uden forudgående denaturering(17,18). Til analysen af henholdsvis FIIM og FVL på LC-Genie III, anvendes 6 primere; Forward Inner Primer (FIP), Forward Outer Primer/ F3 primer (FOB), Backward Inner Primer (BIP), Backward Outer Primer/ B3 primer (BOP), samt Loop Primer F og Loop Primer B. De 6 primere er designede til at binde sig specifikke steder på target DNA (Se figur 2 (trin 1) og figur 11(trin 9)). Teknologien bag LAMP fungerer således (Se figur 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 og 11): Figur 2: Illustration fra premierbiosoft.com (19,20). Trin 1: (A) De farvede kasser, navngivet F3, F3c, F2, B1, B2 osv., på Target DNA illustrerer de distinktive områder, hvor de 6 primers er designet til at binde sig. (B) FIP bryder det dobbeltstrengede target DNA ved at binde sig til F2c på sense-strengen i 3 enden. Polymerasen danner derefter den komplementære nonsense-streng samtidig med, at den originale nonsense-streng, skubbes af. 10

13 Figur 3: Illustration fra premierbiosoft.com (19,20). Trin 2: (A) FOP/F3 Primeren hybridiseres til F3c hvorefter den danner en ny non-sense streng, samtidigt med, at den skubber komplementær-strengen, dannet i Trin 1, af. (B) Den afskubbede komplementær-streng danner en loop hybridisering i 5 enden, ved at F1 bindes til F1c. Figur 4: Illustration fra premierbiosoft.com (19,20). Trin 3: (A) BIP hybridiseres til B2c locus, på den afskubbede komplementær-streng med loop i 5 enden og der dannes en ny sensestreng. (B) Elongeringen bryder loop hybridiseringen, så at DNA igen er på dobbeltstrenget form. 11

14 Figur 5: Illustration fra premierbiosoft.com (19,20). Trin 4: (A) BOP/B3 Primer hybridiseres til B3c på non-sense strengen i 3 enden, hvorefter der ved hjælp af elongering, dannes en ny sense-streng, samtidigt med at den foregående sense-streng skubbes af. (B) Den afskubbede sense-streng danner loop hybridisering i både 3 -, og 5 enden og danner en Dumbbell Shape Structure. Figur 6: Illustration fra premierbiosoft.com (19,20). Trin 5: På det enkeltstrengede DNA- fragment med Dumbbell Shape Structure, elongerer polymerasen fra 3 -enden til 5 enden, så at loop hybridiseringen brydes. Derved opnås en Stemloop Structure. Se også den sorte pil på Trin 4, B. 12

15 Figur 7: Illustration fra premierbiosoft.com (19,20). Trin 6: På Stemloop Structure bindes FIP til F2c locus, hvorefter polymerasen elongerer fra F1C til B1, så at der dannes en sensestreng. Herefter vil polymerasen elongere fra B1 (se sort pil) og dermed skubbe den nydannede sense-streng af. Figur 8: Illustration fra premierbiosoft.com (19,20). Trin 7: (A) Her ses den struktur der er tilbage efter fraspaltningen af den fraspaltede sense-streng i Trin 6. (B) Her ses den fraspaltede sense-streng, dannet som følge af elongeringen fra FIP i Trin 6. Strengen har Dumbbell Shape Structure, indtil polymerasen elongerer den fra 3 enden, så at der dannes en ny non-sense streng, og strukturen omdannes til en Stemloop Structure, se trin 8. 13

16 Figur 9: Illustration fra premierbiosoft.com (19,20). Trin 8: BIP hybridiseres til B2c på begge DNA-strukturer, dannet i Trin 7. Herefter elongerer polymerasen til 5 enden på begge strukturer, så at der dannes en ny sense-streng. Alt efter hvilken af de ovenstående strukturer der elongeres, skubbes den foregående sense-streng enten helt af og danner Dumbbell Shape Structure, eller elongeres i forlængelse af den eksisterende struktur. Herved dannes der konstant nye F2 og B2-bindingssites så FIP og BIP kan binde sig og danne længere og længere DNA-strukturer, bestående af gentagne kopier af samme sekvens af amplificeret Target-DNA. Figur 10: Illustration fra premierbiosoft.com (19,20). Trin 9: Her ses et eksempel på det amplificerede target DNA med F2 og B2 - bindingssites i hvert knæk. 14

17 Figur 11: Illustration fra LaCAR (21). Loop Primer F og Loop Primer B placerer sig på loop-enden af henholdsvis sense og antisense strengen, af fragmenter med Dumbbell Shape Structure. Disse to primers resulterer i yderligere amplificering af target DNA. Det er muligt at udføre LAMP uden Loop Primer F og B, men amplifikationshastigheden og koncentrationen af target DNA øges ved anvendelse af disse. Smeltekurve Efter amplificeringen udføres en smeltekurveanalyse, hvor temperaturen først sænkes til 40 C, hvorefter den langsomt hæves til 90 C (Se figur 12). Ved 40 C bindes både prober med påsat fluorofor (fluorofor-prober) og prober med påsat quencher (quencher-prober) til LAMP-produktet. Fluorofor-proben er designet til enten at være WT-specifik, altså til at binde sig på DNA uden nogen mutation, eller til at være mutations-specifik, altså til at binde sig på DNA med SNP. Quencher-proben er designet til at binde sig tæt ved dens modsvarende fluorofor-probe, og dermed absorbere fluorescensen fra den. Idet temperaturen stiger, denatureres LAMP-produktet og fluorofor-proben falder af. Fluorofor-proben udsender målbar fluorescens, idet afstanden til quencher-proben bliver for stor. 15

18 Hvis der benyttes en WT-specifik fluorofor-probe (Se figur 12), vil den have god affinitet over for et LAMP-produkt uden SNP og derfor først slippe ved høj temperatur. Den WT-specifikke fluoroforprobe, har derimod dårligere affinitet over for et LAMP-produkt med SNP og vil derfor slippe, allerede ved lav temperatur. Dette betyder, at en WT-prøve vil danne en peak ved høj temperatur, og en homozygot muteret prøve vil danne peak ved lav temperatur. En heterozygot prøve vil danne 2 lavere peaks, ved både lav og høj temperatur. Figur 12: På billedet, fra forsøgene på LC-Genie III, ses et eksempel på en smeltekurve for FVL. Analysen benytter en WT-specifik probe. Der er analyseret 2 homozygote WT patientprøver (lyseblå og mørkeblå kurve) og 4 heterozygote patientprøver (orange, grøn, rød og gul kurve). Derudover er der analyseret 1 positiv kontrol, der er heterozygot (lilla kurve) og 1 negativ kontrol (lyserød kurve) (22). Hvis der derimod benyttes en mutations-specifik fluorofor-probe (Se figur 13), vil den have god affinitet over for et LAMP-produkt med SNP og derfor først slippe ved høj temperatur. Proben har derfor dårligere affinitet over for et LAMP-produkt uden SNP og slipper ved lav temperatur. Dette betyder, at en WT-prøve vil danne peak ved lav temperatur, og en homozygot muteret prøve vil danne peak ved høj temperatur. En heterozygot prøve vil danne 2 lavere peaks, ved både lav og høj temperatur. 16

19 Figur 13: På billedet, fra forsøgene på LC-Genie III, ses et eksempel på en smeltekurve for FIIM. Analysen benytter en mutationsspecifik probe. Der er analyseret 2 homozygote WT patientprøver (lyseblå og mørkeblå kurve) og 4 heterozygote patientprøver (gul, orange, rød og grøn kurve). Derudover er der analyseret 1 positiv kontrol, der er heterozygot (lilla kurve) og 1 negativ kontrol (lyserød kurve) (22). Anvendelsen af LAMP-teknologi eliminerer behovet for oprensning. Oprensning er derimod essentiel, hvis der arbejdes med traditionel PCR, da jern ionerne i hæmoglobinen, ellers vil blive frigivet under denatureringen. Det frigivne jern inhiberer herefter polymerasen, så PCR-reaktionen stoppes(23,24). Da oprensningen er tidskrævende, vil det være relevant at undersøge om LC-Genie III kan implementeres på afdelingen. Den sparede tid på oprensning gør, at LC-Genie III muligvis er et bedre alternativ til QIAsymphony SPC og LightCycler 2.0. Ved at fjerne oprensningen mindskes muligheden for fejl og kontaminering af prøverne. Derudover er det muligt at svartiden forkortes. Ved at udelade oprensning, analyseres der i stedet på EDTA-stabiliseret fuldblod. EDTA kan binde magnesium og dermed påvirke polymerasen, så at denne inhiberes. Derudover forhindres primer annealing og smeltetemperaturen påvirkes (23,24). På KBA i Næstved, er fire bioanalytikere uddannet til at udføre PCR-analyserne. Hvis LC-Genie III er lettere at betjene, kunne det åbne op for muligheden for, at flere blev oplært i at udføre PCRanalyserne. Dermed er der flere kvalificerede ansatte til at veksle mellem arbejdet i den daglige rutine og PCR-arbejdet. 17

20 For at undersøge om LC-Genie III kan erstatte LightCycler 2.0 og lette analyseringen af FIIM og FVL, udføres der en delvis validering. Validering Hvis LC-Genie III skal erstatte den nuværende procedure, skal der udføres en validering. Formålet med en validering er at sikre, at afprøvningen af nyt apparatur eller implementering af nye analyser sker, så kvaliteten af analyserne opretholdes(25). På KBA i Næstved er der udarbejdet en validering specifikt til enkelt-nukleotid analyser, som ikke følger den almindelige valideringsproces. I forbindelse med valideringen af apparaturet udarbejdes en valideringsrapport. Rapporten består af en valideringsprotokol, resultater, databehandling, samt konklusion. Valideringsprotokollen udarbejdes inden påbegyndelse af valideringsprocessen, og skal godkendes af minimum én fra afdelingsledelsen. Protokollen beskriver de parametre, der skal undersøges i forbindelse med validering af enkeltnukleotid genetiske analyser. Parametrene er: baggrunden for analysen, analyseprincippet, reagenser, udstyr samt apparatur, kontroller, korrekthed, robusthed og analytisk usikkerhed(26,27). Afgrænsning Der undersøges om LC-Genie III fra LaCAR kan erstatte LightCycler 2.0, ser benyttes på KBA, Næstved. LightCycler 2.0 kan ikke fortsætte, da produktionen af kapillærrør til apparatet ophøre. Der skal derfor findes et nyt alternativ. Da LC-Genie III udfører enkelt-nukleotid analyser, skal der laves en enkelt-nukleotid genetisk analysevalidering. På grund af begrænsende faktorer, som økonomi og tid, udføres kun enkelte dele af en validering. Apparaternes korrekthed analyseres ved en metodesammenligning. Yderligere undersøges, og diskuteres, udgifter for apparatur, reagenser og utensilier. Undervisning af personale og tiden, det tager bioanalytikeren at udføre analysen diskuteres ligeledes. Der benyttes patientprøver, der allerede er analyseret for FIIM og FVL på LightCycler 2.0. Sammenligningen foretages derfor på EDTA-stabiliserede patientprøver, der er genotypet som WT eller heterozygot for både FIIM og FVL. Da prævalensen for homozygot muterede FIIM og FVL 18

21 patienter er meget lav, er sandsynligheden for at modtage en sådan patientprøve meget lille. Da afdelingen ønsker at benytte egne kontroller, analyseres to interne kontroller som patientprøver. Ud over metodesammenligningen, undersøges der også om afpipetteringsfejl har indflydelse på resultatet på LC-Genie III. Afpipetteringsfejlen simuleres ved at tilsætte varierende mængder blod fra én heterozygot FIIM patientprøve, til den anbefalede mængde lyseringsbuffer. Yderligere undersøges detektionsgrænsen for analysen af FIIM på LC-Genie III, og resultaterne sammenlignes med informationerne i medfølgende IFU(28,29). Detektionsgrænsen undersøges ved en to-folds fortyndingsrække på en heterozygot patientprøve. På grund af begrænset mængde reagens, vil der til alle analyser, blive analyseret omkring 40 prøver. 19

22 Problemformulering Hvordan kan der, ved brug af Loop Mediated Isothermal Amplification (LAMP) på patientprøver, der analyseres for Faktor II (Prothrombin) Genvariant og Faktor V Leiden, udføres en delvis validering af LC-Genie III på KBA, Næstved og afgøre om denne kan fungere som erstatning for den eksisterende PCR-procedure med henholdsvis QIAsymphony fra Qiagen og LightCycler 2.0 fra Roche? o Hvilken betydning har mængden af blod, tilsat lyseringsbuffer for analysesvaret for Faktor II (Prothrombin) Genvariant på LC Genie III? o Hvordan er det muligt at eftervise detektionsgrænsen på analysekittet for Faktor II (Prothrombin) Genvariant fra LaCAR på LC-Genie III? o Hvilken betydning har det for organisationen, rent teknologisk og økonomisk hvis LC-Genie III erstatter den nuværende PCR-metode? o Hvilken betydning har det for patienten i forbindelse med både deres diagnose, behandling og monitorering hvis LC-Genie III erstatter den nuværende PCRmetode? 20

23 Metodiske overvejelser Delvis validering af LC-Genie III Klinisk Biokemisk Afdeling, Næstved har en specifik valideringsprocedure til enkelt-nukleotid genetiske analyser, som FIIM og FVL. Der udføres kun en delvis validering af LC-Genie III, da begrænsninger som tid og økonomi, gør det umuligt at udføre en fuld enkelt-nukleotid genetisk analyse-validering på LC-Genie III (26). Patientprøver og etik Til udførelse af forsøget anvendes patientprøver, hvorpå analyserne FIIM og FVL allerede er rekvireret og analyseret på LightCycler 2.0. Dette gøres for ikke at afsløre skjulte mutationer. Resultaterne fra LC-Genie III og LightCycler 2.0 sammenlignes, da LightCycler 2.0 benyttes til analysering af FIIM og FVL på KBA, Næstved. Hvis resultaterne fra begge apparater ikke stemmer overens, analyseres prøven igen på LC-Genie III. Hvis der stadig er uoverensstemmelse, analyseres prøven igen på LightCycler 2.0. I tilfælde af, at der stadig ikke er nået overensstemmelse, skal det overvejes om prøven skal sekventeres og patienten underrettes. På grund af økonomiske udfordringer, er der en begrænset mængde reagens. Derfor er det ikke muligt at genanalysere alle prøver, der får et uventet resultat. Derudover er det kun muligt at benytte LC-Genie III i en begrænset periode, da den er udlånt til afprøvning i en måned på afdelingen. Der forventes at analysere det maksimale antal prøver, som de indkøbte analysekit tillader. Prøvemateriale og simulering af afpipetteringsforsøg Forsøget på LC-Genie III er tilrettelagt, så der analyseres på EDTA-stabiliseret fuldblod. Holdbarheden af DNA i EDTA-fuldblod er 30 døgn ved 4 C. Dette kan blive et problem, da afdelingen får tilsendt varierende antal prøver hver uge. For at undgå at analysere på udløbne prøver, kontrolleres datoen for prøvetagningen inden analysering af prøven(30). Det er valgt at analysere på EDTA-fuldblod på LC-Genie III, da oprensningen af DNA ikke er nødvendig. Da man på LC-Genie III kan udelade DNA-oprensningen, er det interessant at se, om dette er tidsbesparende, eller om det leder til andre problemstillinger. Det er derfor essentielt at 21

24 undersøge om LC-Genie III kan udføre analyserne med samme kvalitet som LightCycler 2.0. For at undersøge hvor følsom analysen på LC-Genie III er, er det besluttet at simulere en afpipetteringsfejl. Dette udføres ved afpipettering af forskellige mængder blod til den anbefalede mængde lyseringsbuffer, for at se om det kan have en indvirkning på resultaterne. Forsøget udføres af økonomiske årsager, udelukkende på kittet for FIIM. Derudover er det valgt at undersøge detektionsgrænsen for FIIM, og sammenlignes med den medfølgende IFU, fra LaCAR(28,29). Kvalitetssikring For hver analysestrip à 8 brønde, analyseres en positiv og negativ kontrol, fra begge kit s(28,31). Kontrollerne viser om amplificeringen er forløbet korrekt, og afslører eventuel kontaminering under præanalysen. For at undersøge om afdelingens egne kontroller, kan anvendes med de udleverede analysekit for FIIM og FVL på LC-Genie III, analyseres de to interne kontroller fra afdelingen, som patientprøver. Genotypningen af de interne kontroller, sammenlignes med genotypningen på LightCycler 2.0. Afviger en eller flere kontroller fra det fastlagte acceptinterval, markeres alle prøver af maskinen som Invalid. Sker dette, skal hele processen med lysering og efterfølgende analyse af alle prøver og kontroller, udføres igen. Afviger én enkelt patientprøve fra det fastlagte måleinterval, markeres denne som invalid. Prøven analyseres på ny, efter endnu en lysering. Efterfølgende udføres fejlfinding i præanalysen. Metodisk tilgang Der udføres statistik på kvalitativ data. Der beregnes sensitivitet og specificitet, for at se om der er overensstemmelse mellem resultaterne på LightCycler 2.0 og LC-Genie III. Ud fra resultaterne udarbejdes et skema, hvor fordele og ulemper ved begge apparater, både økonomisk og tidsmæssigt i forhold til præanalyse, analyse og postanalyse, sammenlignes. Som følge af valideringen vil fordele og ulemper, ved både den benyttede, og den nye metode, blive blotlagt og vurdere relevansen af den nye metode. Øvrige fordele og ulemper, ved implementeringen af den nye metode, belyses og diskuteres på baggrund af videnskabelige artikler, fundet på henholdsvis pubmed og google scholar. De videnskabelige artikler udvælges og inddrages, på baggrund af faktorer som fx forlagets impact 22

25 factor, dato for udgivelse, samt forfatterens tilknytning til projektet. I forbindelse med søgning af videnskabelige artikler er der blandt andet brugt søgeord som: comparison LightCycler 2.0, mutation specific probe and wildtype specific probe, comparison faktor V-Leiden prothrombin LightCycler 2.0, LAMP, FRET, wildtype probe hybridization and mutation probe og long term blood storage impact. For at vurdere om LC-Genie III kan erstatte LightCycler 2.0, anvendes artiklen, Comparison of Standard PCR and the LightCycler Technique to Determine the Thrombophilic Mutations: An Efficiency and Cost Study udarbejdet af Schroll-Metzger B. et al.(32). I artiklen undersøges hvorvidt LightCycler 2.0 kan erstatte standard PCR (the golden standard). På begge apparater analyseres for FIIM, FVL og MethylenTetraHydroFolat Reduktase mutation (MTHFR). Ved standard PCR genotypes PCR-produktet via polyacrylamid gel. Genotypningen på LightCycler 2.0, udføres ved en smeltekurve. Efterfølgende sammenlignes resultaterne fra begge apparater, samt tidsforbruget og økonomi. Resultaterne fra LightCycler 2.0 stemmer overens med resultaterne fra standard PCR. Tidsforbruget på LightCycler 2.0 er markant mindre end standard PCR, dog koster LightCycler 2.0 mere i utensilier og kit, der anvendes til detektion af mutationerne. På sigt vil LightCycler 2.0 være en bedre investering, hvis der analyseres flere genanalyser. Egenskaberne ved anvendelse af WT-specifikke -og mutationsspecifikke prober diskuteres ud fra artiklen: MTBDRplus and MTBDRsl Assays: Absence of Wild-Type Probe Hybridization and Implications for Detection of Drug-Resistant Tuberculosis udarbejdet af Marva Seifert et al. hvor specificiteten på WT-specifikke og mutationsspecifikke prober undersøges(33). Resultaterne viser at den mutationsspecifikke probe, har en signifikant højere specificitet, end den WT-specifikke probe. Derudover er den WT-specifikke probe mere sensitiv. Alt efter hvad man undersøger, mener Marva Seifert et al. at en kombination af proberne kunne give de mest optimale resultater. 23

26 Metode Der blev udført en metodesammenligning af henholdsvis LightCycler 2.0 fra Roche og LC-Genie III fra LaCAR. LightCycler 2.0 er Conformité Européenne (CE) - mærket og in vitro-diagnostisk udstyr (IVD) godkendt. Det vil sige at produktet er blevet godkendt til diagnostisk brug(34). LC-Genie III er CE godkendt. Der blev anvendt analysekit for Lamp Human Prothrombin mutation KIT (rs ) lot. nr.: 04006J og Lamp Human FV LEIDEN KIT (rs6025) lot.nr.: 05005L udleveret fra LaCAR. Begge kit er CE og IVD godkendt og indeholdt henholdsvis lyseringsbuffer, mastermix, samt en negativ og positiv kontrol. De EDTA-stabiliserede patientprøver blev analyseret som fuldblod på LC-Genie III, uden forudgående DNA oprensning. Afdelingens egne kontroller, bestående af genomisk DNA, blev analyseret som patientprøver, efter den medfølgende analyseprotokol for oprenset DNA. Der blev i alt analyseret 24 prøver for FIIM og 35 patientprøver for FVL. Metodesammenligning Metodesammenligningen blev udført efter den medfølgende protokol for både FIIM og FVL (Se figur 14). Tiden for præanalyse, analyse, og postanalyse blev noteret, til sammenligning med LightCycler 2.0. Derudover blev antallet af manuelle afpipetteringer noteret. Figur 14: Flowdiagram over udførelse af både præanalyse og analyse med FII og FV kit fra LaCAR. Ved analyse på DNA tilsættes derimod 2 µl template-dna, med en koncentration på 1 ng/µl, til 10 µl lyseringsbuffer (28,31,35). Prøverne blev analyseret på LC-Genie III efter de indprogrammerede protokoller for hhv. FIIM og FVL (Se figur 15 og 16). 24

27 Figur 15: Eksempel på temperaturprofil over analysering af FIIM, som følge af forsøgene på LC-Genie III. Amplificeringen foregår ved 66 C i 30 minutter. Derefter udføres smeltekurve analysen over 5 minutter, hvor temperaturen falder til 40 C og stiger gradvis til 90 C (22). Figur 16: Eksempel på temperaturprofil over analysering af FVL som følge af forsøgene på LC-Genie III. Amplificeringen foregår ved 65 C i 20 minutter. Derefter udføres smeltekurve analysen over 5 minutter, hvor temperaturen falder til 40 C og stiger gradvis til 90 C (22). Sammenligning med LightCycler 2.0 Til metodesammenligningen blev der deltaget i rutinen på LightCycler 2.0. Undervejs blev der taget tid på præanalyse, analyse og postanalyse. Derudover blev antallet af manuelle afpipetteringer noteret. Afpipetteringsforsøg En EDTA stabiliseret fulblodsprøve, heterozygot for FIIM, blev afpipetteret ned i lyseringsbuffer. Der blev afpipetteret hhv. 1, 3, 5, 8 og 10 µl blod til den anbefalede mængde lyseringsbuffer. Prøverne blev analyseret efter protokollen. 25

28 Detektionsgrænseforsøg En EDTA stabiliseret fuldblodsprøve, heterozygot for FIIM, blev fortyndet i forholdene; 1:5, 1:20, 1:80, 1:160, 1:320. Både fortyndingerne og den ufortyndede prøve blev analyseret efter protokollen. 26

29 Resultater Metodesammenligning af LightCycler 2.0 og LC-Genie III Tabel 1: Analysen for FVL, blev udført på i alt 35 prøver. Der var 35/35 = 100% overensstemmelse, mellem analyserne på LightCycler 2.0 og LC-Genie III. Specificiteten og sensitiviteten beregnes ligeledes til 100%. Tabel 2: Analysen for FIIM, blev udført på i alt 24 prøver. Der var 24/24 = 100% overensstemmelse, mellem analyserne på LightCycler 2.0 og LC-Genie III. Specificiteten og sensitiviteten beregnes ligeledes til 100%. 27

30 Afpipetteringsforsøg Figur 17: På smeltekurverne ses en tendens ved tilsætning af lavere mængde af blod i forhold til FV-Leidens kit-beskrivelse (under 5 µl, prøve nr. 1 og 2), vil første peak fremkomme højest i forhold til anden peak. Ved tilsætning af dobbelt så meget blod, i forhold til kit-beskrivelse (10 µl, prøve nr. 5), fremkommer første peak lavest og anden peak højest. Der er nogenlunde overensstemmelse ved tilsætning af 5 µl og 8 µl (prøve nr. 3 og 4). 28

31 Detektionsgrænseforsøg Figur 18: På smeltekurverne ses, at detektionsgrænsen for LC-Genie III befinder sig mellem fortyndingsforholdene 1:20 og 1:80. Det ses at LC-Genie III genotyper den heterozygote prøve, som henholdsvis WT og homozygot muteret ved koncentrationer over 1:80. Tabel 3: I tabellen ses leukocytkoncentrationen for de forskellige fortyndingsforhold, brugt i detektionsgrænseforsøget. 29

32 Økonomi og ergonomi Tabel 4: I tabellen ses antallet af manuelle afpipetteringer der kræves for analyse af 6 prøver, inklusiv 5 og 2 kontroller, på hhv. LightCycler 2.0 og LC-Genie III. Det ses, at LightCycler 2.0 kræver 24 afpipetteringer, og at LC-Genie III kræver 32 afpipetteringer. Derudover ses prisen pr. prøve for både LightCycler 2.0 og LC-Genie III. *Inklusiv timeløn. Tid Tabel 5: I tabellen ses tiden for præanalyse, analyse og postanalyse på både LightCycler 2.0 og LC-Genie III. 30

33 Diskussion Metodesammenligningen Metodesammenligningen af LC-Genie og LightCycler 2.0 viser 100% overensstemmelse mellem genotypningen af patientprøver, analyseret på begge maskiner (Se tabel 1 og 2). Dette resulterer i en sensitivitet og specificitet på 100%. Tages udelukkende dette i betragtning, betyder det, at LC- Genie III kan erstatte LightCycler 2.0. Derudover har den videnskabelige artikel Comparison of Standard PCR and the LightCycler Technique to Determine the Thrombophilic Mutations metodesammenlignet standard PCR med LightCycler Technique, hvor økonomien og tiden bliver undersøgt(32). Disse parametre er essentielle ved implementering af nyt udstyr. Det er derfor valgt at undersøge disse parametre i forbindelse med sammenligningen af LightCycler 2.0 og LC-Genie III. Afpipetteringsforsøg Resultaterne fra forsøget, viste sig at være overraskende, da det så ud til, at de 2 peaks på kurverne varierede i højden som følge af de forskellige mængder blod, tilsat i hver analysebrønd (Se figur 17). Jo lavere mængde tilsat blod, jo højere første peak, og lavere anden peak. Jo mere blod, tilsat i hver efterfølgende brønd, resulterede i et gradvis fald af første peak, og gradvis stigning i anden peak. LaCar oplyser, at de varierende højder på kurverne, skyldes probernes præference over for target- DNA(36). Dette kan muligvis forklares ved, at der ved 1 µl og 3 µl tilsat blod, viser sig en kemisk ligevægt, med en tilpas mængde prober til target-dna. Ved højere koncentrationer af DNA (5, 8 og 10 µl) forskydes ligevægten, så der er for meget DNA i forhold til mængden af prober. Derfor vil proberne foretrække, at binde sig til det DNA, den er designet til at binde sig på. I dette tilfælde, binder proben sig til DNA med mutationen, da proben i FIIM-kittet er mutationsspecifik. Derfor vil der, ved høje DNA-koncentrationer registreres højere fluorescens-output på den mutationsspecifikke peak. Dette kan muligvis forklare den gradvise forskydning af kurverne (Se figur 17). 31

34 Den medfølgende IFU for FIIM analysekittet oplyser, at LaCAR har udført et lignende forsøg hvor de har testet genotypningen på LC-Genie III med blodvolumener varierende mellem 1 µl µl. Forsøget viste, at LC-Genie III kan genotype korrekt på blodvolumener mellem 1 µl og 50 µl(28). Vores resultater stemmer derfor overens med producentens resultater. Detektionsgrænseforsøg Resultatet af detektionsgrænseforsøget, viste sig at stemme overens med producentens resultater. Detektionsgrænsen blev fundet til at ligge mellem fortyndingsforhold 1:20 og 1:80 (Se figur 18). Der har en koncentration på 0,08 x 10 3 cells/mm 3 og 0,32 x 10 3 cells/mm 3 (Se tabel 3). I den medfølgende IFU for FIIM analysekittet oplyser producenten, at der ikke er fundet nogen nedre detektionsgrænse for fuldblod, men at LC-Genie III kan genotype korrekt på leukocytkoncentrationer mellem 0.22 x 10 3 cells/mm 3 og x 10 3 cells/mm 3 (28,37). Da det ikke er sandsynligt at finde blodprøver med så lavt leukocyttal, er detektionsgrænsen primært en parameter der har betydning ved præanalytiske fejl. Af fejl kan nævnes fx at undlade at vortex e en prøve i forbindelse med lyseringen, så blodet bundfalder så kun få celler lyseres. Derved vil man, ved afpipettering til analysestrips, ikke få nok template DNA til, at der genotypes korrekt. Ved så små mængder template DNA bliver genotypning måske et spørgsmål om tilfældighed. Dette kan ikke vides med sikkerhed uden opfølgende forsøg. Wildtypespecifik probe og mutationsspecifik probe Producenten har designet en WT-specifik probe til kittet for FVL. Dette kan have betydning for genotypningen på LC-Genie III, da der findes adskillige genvariationer, der kan være til stede, samtidigt med den mutation der analyseres for. Hvis genvariationen er placeret tæt på det locus, hvor proben binder, kan det påvirke probens bindeevne. Derfor kan proben allerede falde af, ved lavere temperaturer. LC-Genie III kan derved fejlgenotype eller klassificerer prøven som Invalid, pga. det indprogrammerede temperatur- og fluorescensinterval. Dette undgår man ved, at designe en mutationsspecifik probe, som producenten har gjort i kittet for FIIM. Den mutationsspecifikke probe er designet til at binde sig ved mutationen der undersøges for. Derfor vil genvarianterne ikke have nogen betydning. 32

35 Dette understøtter artiklen, MTBDRplus and MTBDRsl Assays: Absence of Wild-Type Probe Hybridization and Implications for Detection of Drug-Resistant Tuberculosis, da resultaterne fra forsøg i artiklen, viser at den mutationsspecifikke probe har en højere specificitet og den WTspecifikke probe, har en højere sensitivitet(33). Da producenten ikke har oplyst hvor lange proberne er, kan det ikke afgøres hvor stor betydning en eventuel genvariation vil have på analysen. Dette kom ikke til udtryk, under vores forsøg. Anvendelse af plasmidkontroller fra LaCAR Ifølge producenten, kan KBA, Næstved anvende egne kontroller til analysering af FIIM og FVL på LC-Genie III (38). Afdelingens egne kontroller blev analyseret for både FIIM og FVL på LC-Genie III. Resultaterne stemmer overens med LightCycler 2.0 (Se tabel 1 og 2). Ved brugen af afdelingens egne kontroller, er det nødvendigt at LC-Genie III s acceptinterval for kontrollerne omprogrammeres. Derved kan LC-Genie III vise om kontrollerne er Valid eller Invalid. Dette er muligt at omprogrammere, hvis man logger ind som administrator på apparatet. Derudover er LaCAR ved at udvikle et check kit designet til, at verificere om LC-Genie III fungerer optimalt(39). Dette er et krav til akkrediterede afdelinger. Indprogrammerede intervaller - oplæring af personale LC-Genie III benytter indprogrammerede acceptintervaller, for at validere kontrollerne. Prøverne genotypes ud fra henholdsvis et temperatur- og fluorescensinterval. Dette betyder, at LC-Genie III muligvis, vil genotype en anden genvariant forkert, eller som invalid, hvis den ikke passer ind i enten temperatur- og fluorescensintervallet. LightCycler 2.0 kan ikke afgøre hvorvidt en prøve er kontamineret eller ej, eller afgøre om en kontrol er valid eller invalid, da den ikke har intervaller. Derfor, er afdelingen nødt til at have op til 5 kontroller med i deres analyser. Af denne grund, er det bioanalytikerens egen erfaring og viden om PCR der gør sig gældende i proceduren med, at godkende resultater, da LightCycler 2.0 ikke selv kan vurdere resultaterne. 33

36 Hvorvidt det vil være lettere for en bioanalytiker at blive trænet op i arbejdet på LC-Genie III, end som i LightCycler 2.0, afhænger bioanalytikerens tidligere erfaring med PCR-arbejde. Økonomi På LightCycler 2.0 kan der analyseres 27 prøver og 5 kontroller ad gangen, hvorimod der på LC- Genie III kun kan analyseres 6 prøver og 2 kontroller ad gangen. Dette betyder, at prisen er 140 kr. (inklusiv timeløn) pr. prøve på LightCycler 2.0(40,41). For LC-Genie III er det 217 kr. pr. prøve eksklusiv timeløn(42). Prisen pr. prøve på LightCycler 2.0, er inklusiv oprensningen på QIAsymphony (Se tabel 4). I forhold til prisen alene, er det umiddelbart ikke rentabelt, at implementere LC-Genie III, da prisen er meget højere på LC-Genie III end på LightCycler 2.0. Arbejdstid: Præanalyse: Ifølge resultaterne fra vores forsøg (Se tabel 5) er det, set ud fra den præanalytiske del, tidsmæssigt hurtigere, at benytte LightCycler 2.0 end LC-Genie III. Præanalysen, for arbejdet på LightCycler 2.0 og LC-Genie III, tager henholdsvis 3 timer og 17 minutter, og 4 timer og 53 minutter. Præanalysen på LC-Genie III tager længere tid, end på LightCycler 2.0 fordi prøvematerialet, ifølge den benyttede IFU, kun må lyseres i 10 min. Derfor er det nødvendigt at udføre lyseringen lige inden analysering. Hvis man er effektiv og kan sætte en analyse i gang (der varer enten 35 eller 25 minutter afhængigt af om det er FIIM eller FVL) betyder det, at man ikke kan klargøre mere end 12 patientprøver ad gangen, før man overskrider denne tidsgrænse. Derfor vil bioanalytikeren være nødsaget til at udføre mange gentagne lyseringer, og dermed mange afpipetteringer. Tidsbegrænsningen ved anvendelsen af LC-Genie III fjerner muligheden for, at bioanalytikeren kan hjælpe til et andet sted på laboratoriet. Da LC-Genie III ligeledes kun kan håndtere 6 patientprøver ad gangen, er det derfor essentielt at gentage den præanalytiske del, x antal gange for at få analyseret mere end 6 patientprøver. I alt skal præanalysen gentages 8 gange, for at analysere 24 patientprøver. 34

37 LightCycler 2.0 kan derimod håndtere 32 prøver inklusiv 5 kontroller. Da patientprøverne først oprenses på QIAsymphony, betyder dette, at præanalysen kun skal udføres 2 gange for at analysere 24 prøver. Efter udarbejdning af vores forsøg, har LaCAR oplyst, at det er muligt at analysere på prøver, lyseret i helt ned til 1 minut. Den nye IFU, oplyser, at prøvemateriale, skal lyseres mellem 1-10 minutter(37,43). Derudover, oplyser LaCAR, at lyserede prøver, kan opbevares på køl i 1 døgn inden analysering, uden at resultatet påvirkes(44). På grund af dette, vil det ikke længere være nødvendigt kun at udføre lyseringen lige inden analysen, og dermed åbne op for muligheden for, at udføre lyseringen, på alle dagens prøver, på én gang. Potentielt, vil denne ændring gøre, at tiden for præanalysen på LC-Genie III vil være tættere på tiden for præanalysen på LightCycler 2.0, samt at bioanalytikeren muligvis vil kunne hjælpe til med andre arbejdsopgaver. Analyse: Ved analysering af 24 prøver for FIIM og FVL, tager det LightCycler 2.0, 1 time og 58 minutter og LC-Genie III 4 timer (Se tabel 5). Den store tidsforskel skyldes, at LC-Genie III ikke kan håndtere mere end 6 prøver ad gangen. På grund af dette, skal analyseringen af 24 prøver for FIIM og FVL, opdeles i 8 analyseringer på LC-Genie III, hvorimod de kan analyseres på LightCycler 2.0 over 2 analyseringer, én for FIIM og én for FVL. Postanalyse: Postanalytisk er LC-Genie III mere tidsbesparende, end LightCycler 2.0, da det tager 2 minutter, at lave det postanalytiske arbejde på LC-Genie III, og 31 minutter på LightCycler 2.0 (Se tabel 5). Det postanalytiske arbejde på LightCycler 2.0 indbefatter grupperingen af prøver, efter kontrolkurverne på smeltekurveanalysen. Dette er ikke nødvendigt på LC-Genie III, da denne automatisk sammenligner med de forudindstillede temperatur-, og fluorescensintervaller. Det postanalytiske arbejde på LightCycler 2.0, stiller derfor større krav til den enkelte bioanalytiker, sammenlignet med arbejdet på LC-Genie III. Derfor kan det være forskelligt hvilket apparat, der kræver kortest tid til henholdsvis præanalyse, analyse og postanalyse. Hvis tiden for disse processer lægges sammen, tager arbejdet på 35

38 LightCycler 2.0, kortest tid, hvis der analyseres på 24 patientprøver for FIIM og FVL, nemlig 5 timer og 46 minutter. Arbejdet på LC-Genie III tager derimod 8 timer og 55 minutter. Derfor er LC-Genie III rent tidsmæssigt ikke noget godt alternativ, til LightCycler 2.0. Hvis tiden for lysering af prøver på LC-Genie III, kan nedsættes til 1 minut, og at de kan opbevares på køl i 1 døgn, vil tidsforskellen mellem de to apparaters totale arbejdstid mindskes. På trods af dette, vil LC-Genie III stadig ikke være noget godt alternativ, da den begrænsede mængde prøver, den kan håndtere, ikke er nok i forhold til mængden af prøver, modtaget på afdelingen pr. uge. I år 2015 har modtog afdelingen i gennemsnit 24,5 prøver om ugen(6). Derudover, er det tvivlsomt, hvorvidt den besparede tid, som følge af den forkortede præanalyse, overhovedet vil være nok til, at bioanalytikeren reelt set vil kunne hjælpe til med andre arbejdsopgaver. Ligeledes, er det ikke sikkert, at den hjælp bioanalytikeren yder andre steder, vil have nok effekt, og om det egentlig vil gavne arbejdsflowet på arbejdspladsen. Administrering af ventetid Da selve oprensningen på QIAsymphony tager 1 time og 6 minutter, kan der argumenteres for, at bioanalytikeren samtidigt kan benytte tiden andetsteds. Normalt benyttes tiden til fremstilling af mastermix til analysen på LightCycler 2.0. Dette udføres med manuelt pipette-arbejde, hvor 4 reagenser; H20, polymerasemix, sense primer og antisense primer, blandes. Polymerasemix en blandes af 2 reagenser. Mastermixen fra analysekittene til FIIM og FVL til LC-Genie III er færdiglavet fra LaCAR, hvilket betyder, at der ikke skal bruges tid på at fremstille den. Derfor er der ved brug af LC-Genie III ikke tid til at være andetsteds, da analysetiden er mellem minutter pr. analyse. Denne tid kan bruges til forberedelse af næste analyse og gør det ikke muligt at hjælpe andre steder før den sidste kørsel er sat over. Derfor er der ikke nogen fordel ved LC-Genie III i forhold til tid til at hjælpe andetsteds. Manuelle afpipetteringer - usikkerhed På LightCycler 2.0 skal der, til en analyse på 6 prøver og 5 kontroller, udføres 24 manuelle afpipetteringer, hvorimod der på LC-Genie III skal udføres 32 manuelle afpipetteringer for 6 36