Opsætning af real-time PCR til analyse af generne. VKORC1 og CYP2C9. hos patienter i Marevan behandling. Kathrine Gail Andersen

Transkript

1 Opsætning af real-time PCR til analyse af generne VKORC1 og CYP2C9 hos patienter i Kathrine Gail Andersen

2 Professionsbachelorprojekt Bioanalytikeruddannelsen, University College Sjælland Campus Næstved Set-up of real-time PCR analysis of genes VKORC1 and CYP2C9 for patients undergoing Marevan treatment Udarbejdet af Kathrine Gail Andersen Bn10s003 Projektperiode: 8. oktober januar 2014 I-vejleder: Merete Rasmussen Adjunkt University College Sjælland Campus Næstved K-vejleder: Marianne Birkekær Christensen Bioanalytikerunderviser Klinisk Biokemisk afdeling, Næstved Sygehus Antal anslag: Forsidebilledet er fundet [ ] på: Figur ved sidetal er fundet [ ] på: Denne opgave - eller dele heraf - må kun offentliggøres med forfatternes tilladelse jf. Bekendtgørelse af lov om ophavsret nr. 587 af

3 Baggrund Dosering af patienter i sker på baggrund af kliniske erfaringer. Der er mange parametre, der påvirker Marevan dosering såsom alder, køn, højde og genotypevariationer. Det er påvist, at variation i generne VKORC1 og CYP2C9 har påvirkning på Marevans effekt og metabolisme. Formål I dette studie undersøges sammenhæng mellem generne VKORC1 og CYP2C9 og vedligeholdelsesfasen af Marevan for udvalgte patientgrupper på AK-centret på Næstved Sygehus. Forsøget er opsat for at undersøge om en genotypebestemmelse af patienter i AK-behandling vil kumme forbedre doseringen af Marevan og mindske blødningskomplikationer. Materiale og metode Der er analyseret 22 fuldblodsprøver fra patienter fordelt på lav, normal og høj Marevan dosis. Til udførsel af forsøget er der anvendt real-time PCR og smeltekurve udført på LightCycler 480 II fra Roche Diagnostics med tilhørerende Simpelprobe og hybridiseringsprobe. Der blev for to alleler af både VKORC1 og CYP2C9 analyseret på patientmateriale, samt intern og eksterne kontroller. Resultater Genotyperesultaterne påviste intet mønster for patienter i lav, normal og høj Marevan dosis. Der kan ud fra χ 2 -test ikke udledes en sammenhæng imellem de testede VKORC1 og CYP2C9 genotyper og Marevan vedligeholdelsesdosis. Der var en tendens til, at variation TT i VKORC1 C1173T og AA VKORC1 G-1639A var fraværende fra høj dosisgruppe. Konklusion Der kan ikke konkluderes en direkte sammenhæng imellem vedligeholdelses Marevan dosis og de testede genotyper. En sammenhæng kan dog ikke afvises, idet der var inddraget for få patienter. Endvidere kan det ikke afvises, at der kan være en sammenhæng mellem dosis og genotyperne i indkøringsfasen af Marevan. 1

4 Resume... 1 Forord... 5 Introduktion... 6 Marevan og VKORC VKORC1 genet Marevan og CYP2C CYP2C9 genet Real-time polymerase chain reaction SimpelProbe Hybridiserings probe Color compensation Smeltekurve Problembaggrund Problemformulering Metodiske overvejelser og afgrænsning Emperi Etiske overvejelser Statistiske overvejelser Prøveudvælgelse Analyseudvælgelse Materiale og metode Materiale Prøvemateriale Apparatur Reagenser Oprensning Real-time PCR Color Compensation

5 Metode Oprensning af DNA Klargøring af reagenser til PCR Blanding af FastStart mix Opløsning af primere og prober Opløsning af kontrol DNA Klargøring af Mastermix samt opsætning af PCR-plade LightCycler 480 II Color Compensation Resultatbehandling Statistiske test Resultater Diskussion Resultaterne Statistiske test Stratificering af patienter Geninteraktioner imellem CYP2C9 og VKORC Indkørselsfasen versus vedligeholdelsesfasen Mulige fejl i genotypebestemmelse Patientprøverne Analysens validitet Patienter Sundhedsvæsnet Bioanalytiker Konklusion Perspektivering Referenceliste

6 Bilagsliste Bilag 1: Informations ark og samtykkeerklæring, 2 sider Bilag 2: Tabel over genotypiske fordeling af patienterne, 1 side Bilag 3: Analyseskema, 5 sider 4

7 Denne rapport er udarbejdet som mit skriftlige produkt i forbindelse med min afsluttende bachelor eksamen på bioanalytiker uddannelsen på University College Sjælland i Næstved. Projektet omhandler en genetisk og medicinal problemstilling, og er udført i samarbejde med Klinisk Biokemisk afdeling og AK-centret Næstved Sygehus. Projektet er udført i samarbejde med Louise Thornberg, Sofie Dinesen og Dea Lie Jørgensen i perioden fra d. 8. oktober 2013 til d. 3. januar Afsnittene materiale, metode og resultater er udarbejdet sammen med de tre andre fra gruppen. Dette projekt henvender sig primært til bioanalytikere, ansatte på Klinisk Biokemiske afdelinger og ansatte på AK-centret. Jeg vil gerne sige en stor tak til Louise Thornberg, Sofie Dinesen, Dea Lie Jørgensen og mine to vejledere Adjunkt Merete Rasmussen University College Sjælland Campus Næstved og Bioanalytikerunderviser Marianne Birkekær Christensen på Klinisk Biokemisk afdeling, Næstved Sygehus, for deres hjælpsomhed og engagement. Der gives ydermere en stor tak til de ansatte på de to afdelinger, men særligt: Kemiker Palle Lyngsie Pedersen, laborant Jette Ellehauge, bioanalytiker Carina Foldager Klinisk Biokemisk Afdeling, Næstved Sygehus, samt overlæge Maja Jørgensen, specialistbioanalytiker Jannie Aarkrogh Steen, specialist-bioanalytiker Britt Corfixen og bioanalytiker Camilla Heyn på AK-centret Næstved Sygehus. Til sidst skal der også gives en tak til Roche Diagnostics, der har leveret reagenser til analyserne til fordelagtige priser. 5

8 I 2008 mistede 17,3 millioner (1) mennesker livet som følge af hjertekarsygdomme, hvilket svarer til 30 % (1) af alle dødsfald på verdensplan. Dette gør hjertekarsygdomme til den største dødsårsag globalt (1). Hjertekarsygdomme forårsager mange komplikationer, og en af dem er tromber. Tromber kan forekomme både i arterier og vener. I arterier opstår tromber ofte, som følge af et brud på arterievæggen. Tromber i vener sker blandt andet i benene ved inaktivitet eller på grund af problemer med veneklapperne, hvor blodet koagulerer. Embolier kan fra begge tilfælde rive sig løs og danne nye tromber et sted hvor årerne er indsnævret på grund af åreforkalkning. Tromber behandles forbyggende med medicinering, der på forskellig vis har indflydelse på koagulationsprocessen. I Danmark var der i (2) patienter i antikoagulant (AK) behandling i primærsektoren. Ud af disse (2) patienter var der (2) i vitamin K antagonist behandling. De resterende (2) patienter var enten i heparin, blodplade-aggregationshæmmning, enzym, direkte thrombinhæmmer, direkte faktor a hæmmer eller anden antithrombose behandling. Ud af de (2) patienter i vitamin K antagonist behandling var (2) i, mens (2) var i marcoumar behandling (2). Det eksakte tal for patienter i AK-behandling i sygehus sektoren kendes ikke, da dette ikke er oplyst i det tilgængelige statistiske materiale. Den meget benyttede vitamin K-antagonist behandling, Marevan, er rettet mod vitamin K s afgørende rolle i blodkoagulationen. Marevan doseringen er svær i indkørselsfasen, på grund af de mange faktorer, der påvirker den individuelle behandling. Disse kan være kost, alder, køn, etnicitet, alkohol, medikamenter og genvariationer (3). I USA er der siden 2007 blevet anvendt gentestning til de patienter, der har behov for AK-behandling i form af Marevan. I den forbindelse blev der udarbejdet en database Wafarindosering.org til beregning af dosering til patienter i AK-behandling. Databasen fungerer ved at indtaste patientens parametre, som for eksempel International 6

9 Normalised Ratio (INR), race, vægt, højde, lever sygdomme samt de analyserede genotyper. Ud fra disse data udarbejder programmet en anbefalet dosis af Marevan til den enkelte patient. De anbefaler endvidere, at databasen anvendes efter gentestning og inden behandlingen påbegyndes. På databasen gør de opmærksom på, at hvis patienten har modtaget Marevan i mere end 6 dage, kan der ikke beregnes en dosismængde (4). I Danmark anvendes der ikke gentestning i indkørselsfasen af patienter i AK-behandling. Derimod er det overlæger og specialist-bioanalytikere, der varetager Marevan doseringen. Marevan doseringen af AK-patienter foregår ved en start dosis på to tabletter i fire dage, hvorefter patientens INR måles på den femte dag (5). Ud fra dette samt den kliniske erfaring fastlægges den individuelle dosis. Ved INR undersøges blodets evne til at koagulere. INR er en ratio imellem normalplasma koagulationstid og patient plasma koagulationstid. Metoden anvendes i forbindelse med kontrol af peroral antikoagulansbehandling, uklare blødningstilstande, samt til at bedømme leverens funktion ved mistanke om nedsat koncentration af de vitamin K afhængige koagulationsfaktorer (faktor II, VII og ) hos patienter, som ikke er i AK-behandling. Behandlingsintensiteten af patienter i AK-behandling bliver målt som prothrombin tid, der bliver udtrykt i INR-enheder. Patienter udenfor AK-behandling har en INR omkring 1,0, hvorimod patienter i AK-behandling tilstræbes at have en INR på 2,0-3,0 (6). For at mindske tromber hos AK-patienter benyttes et højere INR interval, så koagulationshastigheden bliver to til tre gange lavere end normalt. Tid i terapeutisk interval (TTR) er den tid en patient har haft en INR inden for INR acceptgrænsen 2,0-3,0. Patienter i AK-behandling får beregnet individuelt TTR, der er et krav for bedømmelsen af, om der gives den korrekt behandlingsdosis. Patienten skal ligge i TTR i 70 % af tiden. Såfremt en patient har en TTR under 70 % skal dosis reguleres (7). På Næstved sygehus er der tilknyttet et AK-center, som per 31. oktober 2013 havde 1088 (7) aktive patienter. Ud af de 1088 er 896 (7) selvmonitorerende, hvilket betyder, at de har afsluttet deres k-kurser og kun kommer ind på AK-centret til årskontroller. Et K-kursus består af tre undervisningsdage, K1, K2 og K3, og en eksamensdag, hvor 7

10 patienterne lærer, hvilke parametre, der påvirker deres respektive behandling, samt hvordan de skal forholde sig i bestemte situationer. De resterende 192 (7) patienter ud af 1088 er i gang med disse k-kurser. Udover de 1088 patienter er der yderlig 159 (7) på venteliste til indkaldelse samt 8 (7) der er indkaldt (7). Patienterne i AK-centret i Næstved er grupperet ud fra deres dosis af Marevan. Patienter der får imellem 1-7 Marevan tabeletter/uge er lav doseret. Patienter der ligger imellem 7,5-20 Marevan tabeletter/uge er normalt doseret, og patienter der får fra 21 Marevan tabletter/uge eller derover er høj doseret (7). Marevan og VKORC1 Kumarin er et stof, der danner grundlag for flere stoffer med antikoagulerende virkning som for eksempel Marevan. Marevan, der også benævnes Warfarin, er et antikoagulant medikament, der blokerer syntesen af vitamin K afhængige koagulationsfaktorer. Vitamin K er et lipidopløseligt vitamin, der optages fra colon og transporteres til hepar via kylomikroner. K-vitaminet figurerer på to aktive former, der er navngivet fyloquinon og menaquinon. Vitamin K er essentiel for syntesen af koagulationsfaktorerne II, VII, I og i hepar. Koagulationsfaktorerne dannes ved carboxylering af deres proteinforstadier ved hjælp af gamma glutamyl carbocylase (GGC). I processen bliver vitamin K oxideret til vitamin K 2,3 epoxid. Dette illustreres på figur 1. Vitamin K epoxide reductase complex subunit 1 (VKORC1) er et enzym, der kodes af VKORC1 genet. Proteinet VKORC1 genbruger vitamin K 2,3 epoxid til at danne vitamin K hydroquinone, hvis funktion er at fungere som en cofaktor for γ-glutamucarboxylase til de forskellige koagulationsfaktorer. De forskellige orale antikoagulerende medikamenter inhiberer VKORC1 s enzymatiske aktivitet og derved forhindres reduktionen af vitamin K 2,3 epoxid tilbage til vitamin K. Der sker herved en ophobning af vitamin K 2,3 epoxid. Ved ophobning af vitamin K 2,3 epoxid bliver der mindre vitamin K til rådighed, hvilket resulterer i inhibiering af koagulationsfaktor syntesen. Dette medfører en nedsat koncentration af koagulationsfaktorer i blodet og en mindre koagulerende effekt (8). 8

11 Figur 1. Illustrerer Marevans (= Warfarin) indvirkning på den enzymatiske aktivitet af VKORC1. Gamma glutamyl carboxylase (GGC) carboxylere koagulations faktorens proteinforstadierne. I samme proces oxideres vitamin K (= vitamin K (oxidized)) til vitamin K 2,3 epoxid (=vitamin K (reduced)). Marven inhiberer VKORC1 og forhindrer dermed reduktionen af vitamin K 2,3 epoxid tilbage til vitamin K (9). 9

12 VKORC1 genet I 1974 blev enzymet vitamin K epoxide reductase multiprotein complex (VKOR) identificeret. Enzymets funktion er som nævnt at omdanne vitamin K 2,3 epoxid tilbage til vitamin K. Det fremgår af Rost et al. (10), at genet VKORC1 blev identificeret i 2004 på kromosom 16p11.2. Genet er 5883 basepar langt, og indeholder 3 exons og 2 introns (11). På kromosomet blev der identificeret to genvariationer i form af single nucleotide polymorphism (SNP). VKORC1 C1173T i intron 1 på codon 1173 hvor basen C > T, se figur 2. Ved genotypning i forbindelse med Marevandosering analyseres der for vildtypen CC, variationen TT og heterozygoten CT. For den anden genvarianten VKORC1 G-1639A på codon 1639 i promotorregionen, ses baseudskiftningen G > A, se figur 3. Der analyseres her for vildtypen GG, varianten AA og heterozygoten GA (8,10,11). Variationerne er for begge SNP forbundet med lav Marevan dosering (11,12). Figur 2. Viser på hvilke codon, der er genvariationer for henholdsvis CYP2C9 og VKORC1. Genvariationerne af baserne er markeret med rødt og alle fire variationer er forbundet med lav Marevan dosering(13). 10

13 Marevan og CYP2C9 Cytokrom p450 enzymsystemet figurer i heparceller og omsætter lægemidler som for eksempel Marevan. Dette enzym sikrer at potentielle giftstoffer afgiftes. Et vigtigt trin i metabolismen af lægemidler er oxidation. Enzymerne indbygger et oxygen ved hjælp af hjælpeenzymet cytokrom p450-reduktase og cofaktorer oxygen og NADPH. Den oxiderede metabolit videreomdannes til en hydroxyleret eller demethyleret metabolit. Det primære metaboliserede enzym for S-Warfarin er CYP2C9 og de to primære metaboliserede enzymer for R-Warfarin er CYP1A2 og CYP3A4. S-wafarin er den mest aktive isomer, hvilket gør CYP2C9 mest betydningsfuld for omsætningen af Marevan. Den omdannede metabolit udskilles via galden og nyrerne som en inaktiv metabolit. Dette illustreres på figur 3 (3,14). Figur 3. Illustrerer metabolismen af Marevan ved hjælp af CYP2C9 (9). 11

14 CYP2C9 genet Ifølge Stubbins et al. (15) blev genet Cytochrome P450 2C9 (CYP2C9) identificeret på kromosom 10q24 i Genet er 55 kilobasepar (kb) langt og indeholder 9 exons. På kromosomet blev der identificeret to SNP genvarianter. Genvarianten CYP2C9*2 på codon 144 hvor C > T, hvor aminosyren arginin omdannes til cystein, se figur 2. I fobindelse med Marevandoeringen analyseres for vildtypen CC, varianten TT og heterozygoten CT. Den anden genvariant er CYP2C9*3 på codon 359 hvor basen A > T, hvor isoleucin omdannes til aminosyren leucin, se figur 2. Der analyseres her for vildtypen AA, varianten TT og heterozygoten AT. Genet CYP2C9 har en metabolisk betydning for Marevan (15). Begge gener CYP2C9*2 og CYP2C9*3 har en nedsættende indvirkning på Marevans metabolisme (16). Real-time polymerase chain reaction Real-time polymerase chain reaction (PCR) er en visualiseret enzymbaseret metode til amplificering af DNA-sekvenser. Den anvendte real-time PCR består af flere trin. Indledningsvist sker der en aktivering af polymerasen. Dernæst forløber PCR cyklus, der består af 3 dele. Den første del er denaturering, hvor hydrogenbindingerne brydes og dobbeltstrenget DNA bliver til enkeltstrenget DNA. Den anden del er annealing, hvor primer binder sig til de enkeltstrengede DNA-templates. Den sidste del i PCR cyklen er extension, hvor polymerasen amplificerer DNA strengene. I teorien bliver de amplificeret 2 n (17). I forsøget er der anvendt 2 forskellige prober i form af en Simpelprobe og en hybridiseringsprobe til detektion af genvarianterne. SimpelProbe Ved anvendelse af sekvensspecifikke prober, mærket med fluorescens, er analysen specifik. Grunden hertil er, at proben kun binder sig til den specifikke target sekvens, hvis den er tilstede i reaktionen (18). SimpelProbe er en singlemærket probe tilhørerende en speciel type af simplificerede hybridiseringsprober, der kan detektere SNP og mutationer. Denne probe er kun 12

15 mærket med et fluorescein og er designet til at hybridisere den target sekvens, der indeholder den specifikke SNP. Mutationen eller SNP skal placeres midt på probe strengen for at sikre at proben binder korrekt til DNA-sekvensen. Jo mere stabil hybridiseringen imellem proben og DNA-sekvensen er, jo højere er smeltepunktstemperaturen. Når proben binder sig til sekvensen sker et markant skift i fluorescensen hvilket ses som et resultat af hybridiseringsstatus. Grunden til at simpelproben anvendes til detektion af SNP og mutationer er dens evne til identificering af vildtyper, mutationer og heterozygositet (18). SimpelProben er designet således, at den er mærket i enten 3 enden eller 5 enden med en reporter (R), der er et fluorescein og en quencer (Q), der er en ikke fluorescent. Når proben er fri i reaktionen udskiller R lidt fluorescens, der bliver opfanget af den specifikke ikke fluorescerende Q. Når simpelproben hybridiserer target sekevensen bliver Q s opsugningseven reduceret og R fluorescerer grønt i detektionskanalen ved 530 nm(18). Figur 4. Illustrerer opbygningen af en SimpleProbe. SimpleProbe er mærket i enten 3 enden eller 5 enden med en reporter (R) og en quencer (Q). Når proben hybridisere templaten fluorescere reporteren og quencer mister sin opsugningsevne (18). I forsøget er det VKORC1 C1173T, CYP2C9*2, der detekteres ved hjælp af SimpelProbe i detektionskanal ved 530 nm (19,20). 13

16 Hybridiserings probe Hybridiseringsproben består af to specieldesignede oligonukleotider, der hybridiserer side om side på en intern sekvens af det amplificerede fragment under annealingsfasen. Proben fungerer optimalt under annalingsfasen, fordi distancen imellem proberne kun er én til fem baser. Såfremt der er længere imellem proberne, som ved denatureringsfasen, kan de to prober ikke fluorescere, idet det er Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) princippet, der anvendes ved de to prober. Princippet bygger på at transformere energien fra et fluorescent molekyle til et andet. De to molekyler fungerer som en donor og en acceptor. Den ene probe (donor) er mærket med fluorescens i 3 enden og den anden probe (acceptor) er mærket i 5 -enden. Når acceptor og donor har bundet sig til DNA-sekvensen, exciterer den ene probe lys ved 470 nm og overfører herefter energien til den anden probe, der emissioner ved 640 nm. Denne probe fluorescerer derfor i detektionskanalen ved 640 nm(18). Figur 5. Illustration af hvordan hybridiseringsproben transformere energi fra et fluorescent molekyle til et andet (21). I forsøget er det VKORC1 G-1639A og CYP2C9*3 der detekteres ved hjælp af hybridiseringsprober i detektionskanel ved 640 nm (19,20). Color compensation De to hybridiseringsprober anvender som tidligere nævnt forskellige detektionskanaler. De to farver fluorescein (530 nm) og LC red 640 (640 nm) overlapper hinanden i deres respektive emissions spektrum. Dette resulterer i, at der ikke kan udledes de korrekte resultater. Color compensation anvendes for at LightCycler 480 II kan adskille disse to signaler fra hinanden. Farverne analyseres i Lightcycler 480 II ved at opstille et color 14

17 compensations program (se materiale og metode afsnittet), og derved opnås et spektrum, for de forskellige anvendte farver (22). Smeltekurve Lightcycler 480 II anvendes som PCR apparatur, der efter PCR-reaktionen udarbejder en smeltekurve. Ved måling af fluorescens kan apparatet påvise smeltning af probe og target hybridisering, under temperaturstigning (18). En smeltekurve er en metode til at skelne imellem DNA produkter, primer-dimer og andre artifakt produkter, men i forbindelse med prober også til at skelne mellem de genotyper, som proben er designet til. Smeltekurven består af tre faser: denaturering, annealing og smeltepunktsmåling. Der bliver på baggrund af faserne udarbejdet en smeltepunktskurve. Analysen forløber ved at opvarme DNA-sekvenser langsomt fra 40 C til 85 C. Processen registreres ved at måle fluorescensen på proberne, der binder sig til target DNA og når DNA et bliver denatureret, falder proberne af og stopper med at fluorescere. Herved kan den eksakte melting temperature (T m ) - værdi fastsættes ved udformningen af smeltekurven. T m - værdien er den temperatur, hvor halvdelen af proberne er bundet og halvdelen er frie. Ved hjælp af tangenter udformes en smeltepunktskurve. Smeltepunktskurven er en differential udledning af smeltekurven. Smeltepunktskurven anvendes til at sammenligne den opnåede T m -værdi med andre kendte kurver, og derved ses det, om der er tale om den bestemte genvariant eller mutation (18). Problembaggrund Der er et stigende antal patienter i Danmark, der bliver sat i AK-behandling med vitamin K antagonist som for eksempel Marevan. Indkørselsfasen af disse patienter kan være kompliceret, idet Danmark ikke har nogen diagnosticerende retningslinjer for, hvilken dosis de forskellige patienter skal have. Det er tidligere nævnt, at der i USA anvendes genotypebestemmelse og databasen Wafarindosering.org, som efter indtastning af personspecifikke data kan udregne behandlingsdosis. Det vides, at der er to gener VKORC1 og CYP2C9, der kan påvirke Marevan dosering. Variationer i disse to gener, kan medføre, at Marevan ikke inhiberer vitamin K syntesen, eller at Marevan ikke bliver omsat og udskilt optimalt. I 2012 blev, der udført et videnskabeligt projekt (23), som 15

18 havde til formål at undersøge, om genvariationerne for CYP2C9 og VKORC1 havde en effekt på TTR for patienterne. Det blev konkluderet, at genvariationerne påvirker TTR, dog var det ikke muligt at bestemme graden af genvariationernes påvirkning (23). På baggrund af projektet i 2012 er der kommet fokus på genotypebestemmelse inden vitamin K antagonist behandling. AK-centret på Næstved Sygehus ønsker således belyst, om genotypebestemmelse skal implementeres som en del af diagnosticering og behandling af AK-patienter. Det skal eventuelt danner grundlang for en mulig indførsel af en genotypebestemt algoritme til dosis bestemmelse af AK-patienter. Problemformulering Hvilken betydning har genvariationerne CYP2C9*2, CYP2C9*3, VKORC1 C1173T samt VKORC1 G-1639A, i generne CYP2C9 og VKORC1, for doseringen af Marevan til patienter i AK-behandling? Metodiske overvejelser og afgrænsning Fokusområdet i dette projekt er at belyse om genvariationerne VKORC1 C1173T, VKORC1 G-1639A, CYP2C9*2 og CYP2C9*3 har en betydning for dosering af Marevan. Der skal desuden vurderes, om lav, normal og høj dosis kan udledes ud fra AK-patienters genotyper. Der blev benyttet en kvalitativt og eksperimentel tilgang til projektet. Denne videnskabelige metode havde den fordel, at kunne sammenligne dosis og genvariation i praksis. Emperi På baggrund af problemformuleringen er der søgt litteratur i databaserne Pubmed, Google Scholor og Google. I litteratursøgningen var der fokus på andres resultater, analyse- og metodevalg. Der blev yderligere fokuseret, på hvornår i AK-behandlingen andre artikler havde målt genotypebestemmelsen i forhold til prøveudvælgelsen. Etiske overvejelser Formålet med eksperimentet i dette projekt var at udføre en PCR analyse for at vurdere, om analysen skal implementeres, som en del af rutinen for dosis bestemmelsen af AKpatienterne. Eksperimentet var et kvalitetsprojekt, på grund af en mulig optimering af 16

19 udredningen af AK-patienter. En anden grund hertil er, at analysen måske skal implementeres på Klinisk Biokemisk afdeling Næstved Sygehus, så patienterne kan genotypebestemmes inden opstart af AK-behandling Der blev udarbejdet en samtykkeerklæring, hvor patienterne skrev under på, at de ikke fik svar på prøverne men deltog i forsøget, se bilag 1. Forsøget var et kvalitetsprojekt, og derfor skulle der ikke søges om tilladelse til udførsel af forsøget fra den nationale videnskabsetiske komité i henhold til punkt 2.5 i Vejledning om anmeldelse, indberetningspligt m.v. (sundhedsvidenskabelige forskningsprojekter) (24). Statistiske overvejelser Der er blevet udarbejdet en non-parametrisk test, da der skulle to parametre uden talværdier. Dette indebar, at der blev udarbejdet en χ 2 -test for at belyse H 0 hypotesen om, at genotypen og dosis var uafhængig af hinanden. Dette blev gjort ved et signifikantniveau ved 0,05 ( 5 %). Yderligere blev der beregnet den procentvise fordeling af genvarianterne for at vurdere, om den ene variant var mere hyppig end den anden. Et andet formål var at belyse, om genvarianterne viste en tendens til sammenhæng imellem lav, normal og høj dosering. Prøveudvælgelse Fra AK-patienter blev der indsamlet blod udtaget ved venepunktur inden forsøgsstart. De udvalgte patienter lå i henholdsvis lav, normal eller høj dosis af Marevan. Patienterne var alle af kaukasisk afstamning. Patienterne blev udvalgt i samarbejde med bioanalytikere på AK-centret Næstved Sygehus, for at sikre en så bred deltagelse som muligt. De udvalgte patienter havde været i behandling i mere end 3 måneder. Det betød, at de indsamlede prøver kom fra patienter, som enten var til årskontrol eller i K3 kursus. En af grundene til, at patienterne skulle have været i behandling i mere end 3 måneder var for at sikre, at de havde et terapeutisk interval, der enten kunne beregnes ud fra eller indhentes elektronisk via de personlige data. Det var, som udgangspunkt de patienter, der havde indkørselsvanskeligheder, der skulle indvies i projektet. Dette blev ændret undervejs, da det ikke var muligt at indsamle nok prøvemateriale. 17

20 Derefter blev forsøgsopsæt at indsamle prøver fra 10 patienter af lav dosis, 10 af normal dosis og 10 af høj dosis, så det samlede prøveantal ville blive på 30. Der blev opstillet inklusions- og eksklusions kriterier for de udvalgte AK-patienter. Inklusionskriterier var, at patienter med forskellige køn, alder, højde, føde og indtagelse af andre ikke AK-behandlende medikamenter kunne deltage. Eksklusionskriterierne var, at patienter der modtag anden form for oral antikoagulation end Marevan blev ekskluderet. Ekskluderet blev desuden de patienter, der kom fra andre AK-centre eller andre AK-skoler end Næstved AK-center. Patientprøve nr. 18 blev ligeledes ekskluderet fra χ 2 -test, da patienten ikke udviste nogen genotype for CYP2C9 genvarianterne. Da det kun var patienter til årskontrol og K3 kurser, der blev indsamlet prøver på, var det ikke muligt at indsamle 10 patienter af hver dosis. De fleste af de indkaldte til årskontroller lå i normal dosis. Der blev indsamlet 22 patientprøver, hvor der var seks patienter med lav dosis, 10 patienter med normal dosis og seks patienter med høj dosis. Analyseudvælgelse Det blev valgt at anvende en real-time PCR som analyseredskab og dertil blev valgt apparatet LightCycler 480 II fra Roche Diagnostics. Analysen og apparatet blev valgt på baggrund af, at Klinisk Biokemisk afdeling på Næstved Sygehus allerede anvender analysen og apparatet til MCM6 og andre genanalyser. En anden grund var, at analysetiden er relativt kort, hvilket er nødvendigt for at optimere og sikre AKpatienterne en korrekt dosering. Der er fravalgt sekventering på grund af forlænget analysetid, og at den ikke anvendes i rutinen. For at kvalitetssikre analysevalget blev der inkluderet tidligere diagnosticerede patient prøver fra Esbjerg Sygehus. Patientprøverne blev kørt med under analysen, som kvalitetskontrol. Analysen i Esbjerg er optimeret og indgår som et diagnosticeringsredskab. Skal analysen fremadrettet skal være en del af rutinen for AK-patienter, vil det være bioanalytikernes opgave at opsætte, implementere og udføre analysen. Derudover er der ansat bioanalytikere på AK-skolerne, som er en del af det daglige arbejde. Problemstillingen har derfor bioanalytikerrelevans(25). 18

21 Materiale Prøvemateriale Til forsøget blev der benyttet EDTA stabiliseret fuldblod, som blev indsamlet fra 22 patienter i Marevanbehandling fra AK-skolen på Næstved Sygehus. Der blev indsamlet 6 prøver fra lav dosis patienter, 10 prøver fra normal dosis patienter og 6 prøver fra høj dosis patienter. Prøverne blev indsamlet, i perioden d til og med d , ved venepunktur i et 2ml EDTA glas. Alle prøverne blev opbevaret på køl ved 5 C indtil analysering. Der blev tilsendt 4 anonymiserede prøver med oprenset DNA fra Esbjerg Sygehus, som var genotype bestemt. Disse blev benyttet som kontroller til kvalitetssikring af forsøg, metode og opsætning. Disse blev opbevaret på køl ved 5 C. Apparatur Til klargøring af reagenser blev der brugt mikrocentrifuge fra MERCK (Albertslund, Danmark) samt køleblok fra Roche Diagnostics (Mannheim, Tyskland, Kat. nr ). Alle reagenser blev opbevaret på køl eller frys ved temperatur på henholdsvis 5 C og -20 C. Til oprensning af DNA fra fuldblod blev der anvendt QIAxtrator model CAS8020 fra Corbett Robotics, (Australien). Real-time PCR blev udført på LightCycler 480 II fra Roche Diagnostics (Rotkreuz, Schweiz), med tilhørende 96 brønds PCR-plade fra Roche Diagnostics (Mannheim, Tyskland, Kat. nr ). Der blev ydermere anvendt Lightcycler 480 sealing foil fra Roche Diagnostics (Mannheim, Tyskland). Centrifugering af PCR pladen skete på en mivac DUO Concentrator centrifuge fra Barnstead Genevac (England). Derudover blev der anvendt diverse laboratorium utensilier. Reagenser Oprensning Til DNA oprensning af fuldblod blev reagenskittet Nucleospin 96 blood fra Macherey- Nagel (Düren, Tyskland, Kat. nr , Lot. nr. 1212/001) anvendt. Kittet indeholdt 19

22 lyseringsbuffer BQ1, vaskebuffer B5, vaskebuffer BW, frysetørret Proteinase K, Proteinase buffer og elueringsbuffer BE. Udover reagenser fulgte der 8 brønds strips, lysisplade, Captureplate plade og MN-tubes med kittet. Ydermere blev der benyttet Dulbecco s Phosphat Buffer Saline (DPBS) fra Gibco (Auckland, New Zealand, Kat. Nr , Lot. nr ) samt 99,8 % Fluka Analytical ethanol fra Sigma-Aldrich (Ukraine, Kat. nr L, Lot. nr. BCBJ7639V) til fortynding af reagenser og prøvemateriale (26). Real-time PCR Ved PCR reaktionerne for hhv. VKORC1 og CYP2C9 blev der benyttet FastStart mix. Denne blev blandet ud fra reagenskittet LightCycler FastStart DNA Master plus HybProbe fra Roche Diagnostics (Mannheim, Tyskland, Kat. nr , Lot nr ). Kittet indeholdte LightCycler FastStart Enzyme, LightCycler FastStart DNA Master plus Reaction Mix og DNA frit vand. Der blev yderligere benyttet MgCl 2 til re-analysering af fire prøver (27). Til detektion af VKORC1 blev der anvendt reagenskittet LightMix Kit human VKORC1 C1173T and G-1639A fra TIB MOLBIOL (München, Tyskland, Kat. nr , Lot nr ). Kittet indeholdte præblandet frysetørrede primere og prober. Detektion af C1173T foregik med en SimpleProbe i kanal 530 med filterkombination Detektionen af G-1639A foregik med hybridiseringsprobe i kanal 640 med filterkombination Kittet indeholdte yderligere seks forskellige DNA kontroller: 1173 vildtype CC, 1173 heterozygoten CT, 1173 varianten TT, 1639 vildtypen GG, 1639 heterozygoten GA og 1639 varianten AA (19). Til detektion af CYP2C9 blev der anvendt reagenskittet LightMix Kit human CYP 2C9*2 and CYP 2C9*3 fra TIB MOLBIOL (München, Tyskland, Kat. nr , Lot nr ). Kittet indeholdt præblandede frysetørrede primere og prober. Detektion af CYP2C9*2 foregik med en SimpleProbe i kanal 530 med filterkombination Detektion af CYP2C9*3 foregik med hybridiseringsprobe i kanal 640 med 20

23 filterkombination Kittet indeholdte yderligere seks forskellige DNA kontroller: CYP2C9*2 vildtypen CC, CYP2C9*2 heterozygoten CT, CYP2C9*2 varianten TT, CYP2C9*3 vildtypen AA, CYP2C9*3 variationen TT og CYP2C9*3 heterozygoten AT (20). Color Compensation Der blev til Color Compensation anvendt kittet LightCycler Color Compensation Set fra Roche Diagnostics (Mannheim, Tyskland, Kat. nr , Lot. nr ). Kittet indeholdte en blank standard buffer uden fluorochromer, Fluorescein Kalibrator, LightCycler Red 640 Kalibrator og en Cy5.5 Kalibrator (28). Metode Oprensning af DNA Til oprensning af fuldblod blev der benyttet QIAxtractor. På softwaren Robotics 4 blev der valgt oprensningsprogrammet Macherey-Nagel NucleoSpin(R) 8 Blood V01. Der blev herefter valgt, hvor mange rækker prøvemateriale, der skulle oprenses, hvorefter prøvernes placering på apparatet blev defineret ved indtastning af prøveid (26). Dernæst blev QIAxtractor opfyldt med bufferkar, pipettespidser, separationsplade, capture-plate plade, MN tubes og strips. Mængden af buffer, som skulle tilsættes bufferkar, blev beregnet af Wizarden. Til Buffer B5 blev der tilsat 400 ml 99,8 % ethanol, og frysetørret proteinase K fik tilsat 3,335 ml proteinase buffer. Proteinase K henstod, indtil opløsningen gik fra grumset til klar. Herefter blev buffer B5, buffer BW, buffer BE og endnu B5 (Overlay) hældt ned i deres respektive bufferkar (26). Prøvematerialet blev klargjort ved først at tilsætte 50 l DPBS til brøndene i lysispladen, hvorefter der blev tilsat 150 l prøvemateriale. Brøndene, som ikke indeholdt prøvemateriale, blev tilsat 150 l DNA frit vand. Dette fungerede som negativt oprensningsprodukt. Lysispladen blev herefter placeret på dens respektive plads på apparatet (26). 21

24 Bufferen BQ1 skulle blandes i to forskellige udgaver og blev blandet senest 10 min. før anvendelse. Mængderne, der skulle blandes, blev afpipetteret. Ydermere var det vigtigt, at opløsningerne blev blandet grundigt for at sikre virkningen af reagenset. Den første BQ1 buffer blev blandet i dens respektive kar i forholdet 50 % BQ1 og 50 % af 99,8 % ethanol. Den anden BQ1 buffer blev forsigtigt blandet i et 15 ml falconrør i forholdet 25 % opløst proteinase K og 75 % BQ1, hvorefter den blev hældt over i dens respektive kar. Efterfølgende blev oprensningsprogrammet startet, og efter oprensning blev DNA et opbevaret i MN-tubes på køl ved 5 C indtil anvendelse (26). Klargøring af reagenser til PCR Blanding af FastStart mix Reagenset FastStart mix blev benyttet til PCR for både VKORC1 og CYP2C9. Til blandingen af FastStart mix blev der benyttet rørene 1a, indeholdende enzymer, og 1b, indeholdende FastStart Reaction mix (27). Først blev FastStart Reaction mix optøet. Efter optøningen blev FastStart Reaction mix samt enzymerne centrifugeret. Herefter blev begge rør placeret i en køleblok. Imens rørene var placeret i køleblokken, blev der overført 10 µl af enzymerne til FastStart Reaction mix. Resten af enzymerne blev frosset ned ved -20 C (27). Blandingen af FastStart Reaction mix og enzymer blev blandet forsigtigt 10 gange med en pipette. Derefter blev blandingen mærket med etiketten LightCycler FastStart DNA Master plus HybProbe Mastermix og opbevaret på køleblok indtil brug (27). Opløsning af primere og prober Til PCR for henholdsvis VKORC1 og CYP2C9 blev der gjort brug af to ud af tre rør med primer og probe mix. Alle fire rør blev tilført 66 μl DNA frit vand. Efter tilsætning af DNA frit vand blev opløsningen blandet godt og efterfølgende centrifugeret ned. I hvert rør var der til 32 PCR reaktioner for både VKORC1 og CYP2C9. Dette var ensbetydende med, at der var til 64 PCR reaktioner for henholdsvis VKORC1 og CYP2C9. Efter opløsning kunne overskydende primer og probe mix opbevares i fem dage på køl ved 4 C (19,20). 22

25 Opløsning af kontrol DNA Til PCR for VKORC1 og CYP2C9 fulgte der seks forskellige rør med kontrol DNA med hvert kit. Alle 12 rør med kontrol DNA blev opløst med 160 µl DNA-frit vand. Opløsningen blev blandet ti gange med en pipette. I hvert rør med kontrol DNA var der til 32 PCR reaktioner. Efter opløsning kunne overskydende kontrol DNA opbevares i fem dage på køl ved 4 C (19,20). Klargøring af Mastermix samt opsætning af PCR-plade Mastermix blev klargjort i eppendorfrør. Nedenstående tabel 1 illustrerer blandingsforhold for Mastermix til én PCR reaktion. Volumenet blev ganget med antallet af reaktioner, og der blev lavet til to ekstra reaktioner (19,20). Tabel 1. Viser komponenter og volumener til mastermix for en PCR reaktion (19,20). Mastermix til VKORC1 Mastermix til CYP2C9 Én PCR reaktion Reagenser Én PCR reaktion Reagenser 11 μl DNA-frit vand 11 μl DNA-frit vand 2,0 μl VKORC1 primer og probe mix 2,0 μl CYP2C9 primer og probe mix 2,0 μl FastStart mix 2,0 μl FastStart mix 15,0 μl Totalvolumen af Matermix for én PCR reaktion 15,0 μl Totalvolumen af Mastermix for én PCR reaktion Mastermix en blev forsigtigt blandet og centrifugeret ned. For hver PCR reaktion blev der overført 15 μl mastermix til en PCR-plade til LightCycler 480 II. Herefter blev der tilført 5 μl oprenset DNA eller kontrol DNA til hver brønd. Dette gav et slutvolumen på 20 μl per PCR reaktion (19,20). Der blev desuden analyseret en negativ reagenskontrol og en negativ oprensningskontrol for både VKORC1 og CYP2C9. Dette svarede til fire negative kontroller i alt. I den negative reagenskontrol var der tilsat 15 µl mastermix og 5 µl DNA frit vand. Den negative oprensningskontrol bestod af 15 µl mastermix og 5 µl negativt oprensningsprodukt. Der blev i alt analyseret 22 patientprøver, fire Esbjerg prøver, seks positive kontroller og to negative kontroller for hhv. VKORC1 og CYP2C9. 23

26 LightCycler 480 II Analysen af det oprensede DNA blev udført på PCR apparatet LightCycler 480 II. Inden selve PCR kørslen blev der oprettet et PCR program til dette projekt. Programmet blev opsat i henhold til vejledningen fra producenten af kit (19,20). Første trin i PCR analysen var en aktivering på 95 C i 10 minutter. Det andet trin i programmet var PCR cyklus som bestod af tre dele. Den første del var denaturering på 95 C i 5 sekunder, dernæst annealing ved 58 C i 10 sekunder og til sidst extension ved 72 C i 15 sekunder. Tredje trin i programmet var smeltekurvens udarbejdelse, der ligeledes bestod af tre dele. Første del var denaturering ved 95 C i 30 sekunder, dernæst annealing ved 40 C i 2 minutter, og til sidst smeltepunkterne, som blev målt stigende fra 40 C til 85 C, fem målinger pr. gradstigning. Det sidste trin i PCR programmet var køling, som foregik ved 40 C i 30 sekunder. Dette illustreres i tabellen nedenfor, se tabel 2. Tabel 2. Viser en komplet oversigt over PCR programmets indstillinger (19,20). Program trin Aktivering Cyklus Smeltekurve Køling Analyse metode None Quantification Melting Curves None Cykler Target ( C) Tid (min:sek) 10:00 00:05 00:10 00:15 00:30 02:00 00:00 00:30 Måle metode None None Single None None None Continuous None Målinger pr. C Da programmet var opsat, blev der indtastet patient ID, så der var overensstemmelse med numrene anvendt i oprensningen. Ydermere blev de to negative kontroller for henholdsvis VKORC1 og CYP2C9, samt de blindede prøver fra Esbjerg Sygehus og de 12 positive kontroller, indtastet. Til sidst blev PCR pladen loadet på LightCycler 480 II, og PCR analysen blev påbegyndt. Der blev observeret, efter PCR analysen, at der var fire prøver, hvor fluorescenssignalet var for lavt til at konkludere en genotype. Disse fire prøver fik deres PCR analyse re- 24

27 analyseret, hvor annealing-temperaturen blev øget til 60 C og der blev tilsat MgCl 2 for at optimere analysen. Color Compensation Efter endt PCR analyse blev der opsat en color compensation. Dette blev gjort ved brug af kittet Color Compensation Set. Herfra blev der afpipetteret 20 µl blank standard buffer uden fluorochromer til 5 brønde på en PCR plade. Der blev ligeledes afpipetteret 20 µl Fluorescein Kalibrator til 5 brønde, 20 µl LightCycler Red 640 Kalibrator til 5 brønde og 20 µl Cy5.5 Kalibrator til 5 brønde. Color compensation blev lavet på LightCycler 480 II ved et manuelt indtastet program, som bestod af fire trin. Første trin var en aktivering ved 95 C i 30 sekunder, her var analyse metoden angivet til none. Det andet trin var PCR cyklus, som bestod af 40 cykler i hver tre dele og benyttede analyse metoden amplificering. Disse tre dele var en denaturering ved 95 C i 1 sekund, annealing ved 55 C i 10 sekunder og extension 72 C i 10 sekunder. Det tredje trin i programmet var en temperatur gradient. Denne bestod af en cyklus og brugte color compensation som analyse metode. Dette trin var også delt op i tre temperatur-step: 95 C i 1 sekund, 40 C i 5 sekunder og 95 C i 1 sekund. Det sidste trin i programmet var en køling, som blev lavet ved 40 C i 30 sekunder med analyse metode none. Trinene illustreres i tabel 3 (28). Tabel 3. Viser en komplet oversigt over color compensation programmets indstillinger (28). Program trin Aktivering Cyklus Temperatur gradient Køling Analysemetode None Amplificering Color compensation None Cykler Target ( C) Tid (sek) Måle metode None None Single None None None Continuous None Måling pr. C

28 Da PCR programmet til color compensation var indtastet, blev PCR plade med buffer og kalibratorer loadet på LightCycler 480 II. Color compensation blev påbegyndt. Efterfølgende blev color compensation gemt som Color Compensation Object. Resultatbehandling Der blev udført color compensation på PCR analyserne for henholdsvis VKORC1 C1173T, VKORC1 G-1639A, CYP2C9*2 og CYP2C9*3. Herefter blev der udarbejdet fire smeltekurver, som blev udskrevet fra LightCycler 480 II. På baggrund af hver smeltekurve blev der udarbejdet en smeltepunktskurve. Derudover blev der printet en fuldstændig rapport over genotyperne for samtlige prøver. Statistiske test Beregning til statistiske test blev udført i computerprogrammet Microsoft Office Excel 2007(Microsoft Corporation). På resultaterne blev der først lavet procentberegning for at vise den procentvise inddeling af genotyper hos patienterne. Da resultaterne var nonparametriske blev der udarbejdet en χ 2 -test for at belyse, om dosen var afhængig af genotypen. 26

29 Resultaterne af PCR analyse for hhv. VKORC1 C1173T, VKORC1 G-1639A, CYP2C9*2 og CYP2C9*3 blev gennemset manuelt på LightCycler 480 softwaren for genotypebestemmelse og kvalitetssikring. På figur 6-9 blev resultaterne afbilledet, hvor fluorescensen sås som en funktion af temperaturen. På graferne ses tre positive kontroller, fire kvalitetssikrings kontroller fra Esbjerg Sygehus, en negativ oprensningskontrol, en negativ reagenskontrol og patientprøver. På figur 6 ses resultaterne for genotypebestemmelse af VKORC1 C1173T for 22 patientprøver og diverse kontroller. Der var seks patienter, der fik genotypen bestemt til CC, som havde en T m -værdi på 54 C. Der var 10 patienter, som blev bestemt med genotypen CT, som havde en T m -værdi på 54 C og 61 C. De sidste seks patienter blev genotypebestemt til TT, som havde en T m -værdi på 61 C. Figur 6. Viser smeltepunktkurve for VKORC1 C1173T. På x-aksen ses temperaturen målt i C og på y-aksen ses den relative fluorescens. Hver enkelt genotype blev aflæst manuelt. De enkeltstående, mørkeblå toppe, der ses ved 54 C, viser CC. De enkeltstående, grønne toppe, der ses ved 61 C, viser TT. På de røde kurver, hvor der ses to toppe ved 54 C og 61 C, viser CT. De tre turkise kurver er hhv. negativ oprensningskontrol, negativ reagenskontrol samt en kontrol fra Esbjerg. 27

30 På figur 7 ses resultaterne for genotypebestemmelse af VKORC1 G-1639A for 22 patientprøver og diverse kontroller. Der var seks patienter, der fik genotypen bestemt til GG, som havde en T m -værdi på 52 C. Der var 12 patienter, som blev bestemt med genotypen GA, som havde en T m -værdi på 52 C og 61 C. De sidste fire patienter blev genotypebestemt til AA, som havde en T m -værdi på 61 C. Figur 7. Viser smeltepunktkurve for VKORC1 G-1639A. På x-aksen ses temperaturen målt i C og på y-aksen den relative fluorescens. Hver enkelt genotype blev aflæst manuelt. De enkeltstående, røde toppe, der ses ved 52 C viser GG. De enkeltstående, grønne toppe, der ses ved 61 C viser AA. På de blå kurve, hvor der ses to toppe ved 52 C og 61 C vises GA. Den enkelte bordeauxrøde top ved de 61 C er en positiv variant kontrol. Den grå og pink flade kurve er hhv. negativ oprensningskontrol og negativ reagenskontrol. Den flade bordeauxrøde kurve repræsenterer en kontrol fra Esbjerg. På figur 8 ses resultaterne for genotypebestemmelse af CYP2C9*2 for 22 patientprøver og diverse kontroller. Der var en patienter, der fik genotypen bestemt til TT, som havde en T m -værdi på 48 C. Der var to patienter, som blev bestemt med genotypen CT, som havde en T m -værdi på 48 C og 57 C. De 18 patienter blev genotypebestemt til CC, som havde en T m -værdi på 57 C. Den sidste patient prøve kunne ikke genotypebestemmes grundet mangel på signal. 28

31 Figur 8. Viser smeltepunktkurve for CYP2C9*2. På x-aksen ses temperaturen målt i C og på y-aksen ses den relative fluorescens. Farverne på figuren er tilfældigt tildelt af apparatet, og der kan derved ikke udledes noget af de respektive farver. Derfor blev hver enkelt genotype aflæst manuelt. De enkeltstående toppe der ses ved 48 C viser TT. De enkeltstående toppe der ses ved 57 C viser CC. På de kurve, hvor der ses to toppe ved 48 C og 57 C vises CT. De to turkise kurver uden toppe er hhv. negativ oprensningskontrol og negativ reagenskontrol. Den nederste bordeauxrøde kurve er patient prøve nummer 18. På figur 9 ses resultaterne for genotypebestemmelse af CYP2C9*3 for 22 patientprøver og diverse kontroller. Der var 19 patienter, der fik genotypen bestemt til AA, som havde en T m -værdi på 49 C. Der var en patienter, som blev bestemt med genotypen AC, som havde en T m -værdi på 49 C og 58 C. Der var en patient blev genotypebestemt til CC, som havde en T m -værdi på 58 C. Den sidste patient prøve blev ekskluderet grundet mangel på signal i analysen for CYP2C9*2. 29

32 Figur 9. Viser smeltepunktkurve CYP2C9*3. På x-aksen ses temperaturen målt i C og på y-aksen ses den relative fluorescens. Hver enkelt genotype blev aflæst manuelt. De enkeltstående blå toppe, der ses ved 49 C, viser AA. Den enkeltstående grå top, der ses ved 58 C, viser CC. På de røde kurve, hvor der ses to toppe ved 49 C og 58 C, vises AC. De to flade kurve, der er hhv. rød og grøn er negativ oprensningskontrol og negativ reagenskontrol. Den lilla top, der ses omkring 58 C, viser positiv CC kontrol. Der blev udarbejdet en χ 2 -test for hver af de fire genotyper, se bilag 2. Nul-hypotesen (H 0 ) sagde, at dosen var uafhængig af genotypen, og signifikansniveauet blev sat til 0,05 (5 %). Frihedsgraderne blev bestemt til 4, hvorpå acceptgrænsen blev aflæst til 9,49 i tabel 12.4 fra Noter i Statistik (29). Teststørrelsen for VKORC1 for henholdsvis C1173T og G-1639A blev beregnet 5,72 og 5,99. Teststørrelsen for CYP2C9*2 og CYP2C9*3 blev beregnet til henholdsvis 5,60 og 7,07. Da teststørrelserne for alle fire genotyper var under acceptgrænsen, blev H 0 accepteret i alle fire tilfælde. 30

33 Det er ifølge Wadelius et al. (30) påvist at 12 % af den individuelle Marevan dosis er forårsaget af CYP2C9 og 27 % af forskellen i dosis er forårsaget af VKORC1. Den hypotese, der skulle be- eller afkræftes i dette projekt, var sammenhængen imellem Marevan dosis og genotyperne CYP2C9 og VKORC1. Der blev på baggrund af hypotesen udført en genotypetestning af forskellige patientklasser ved hjælp af realtime-pcr og smeltekurve med tilhørerende SimpleProbe eller hybridiseringsprobe. Endvidere blev en χ 2 -test udført. For at kunne bekræfte den forudopstillede hypotese, skulle den opstillede nulhypotese for χ 2 -testen afkræftes. Nulhypotese for χ 2 -test var, at Marevan dosis og genotyperne CYP2C9 og VKORC1 var uafhængige af hinanden. Resultaterne Hypotesen før forsøgsstart om sammenhæng mellem Marevan dosis og genotyperne blev afkræftet, idet χ 2 -testen bekræftede den opstillede nulhypotese. Det kan dermed ikke afvises, at Marevan dosis og genotyperne VKORC1 og CYP2C9 er uafhængige af hinanden. Dog kan det heller ikke afvises, at der er sammenhæng imellem parametrene, på grund af det begrænsede patientmateriale og forsøgsdesign. Ud fra resultaterne forekommer der ikke et mønster i genvariationerne. Patienterne i normal dosis udviser ikke en bestemt genotypisk genvariant, der kan påvises på alle normal doserede patienter i forsøget. Det samme mønster gør sig gældende for patienterne i lav og høj dosis. Ud fra dette kan dosisbestemmelsen ikke simplificeres. Indledningsvis blev der ikke påvist sammenhæng imellem dosis og genvarianterne af VKORC TT og VKORC AA. Med forbehold kunne det se ud til at patienter, der har AA varianten i VKORC også bærer TT i VKORC1 1173, se bilag 2. Det kunne heraf tyde på at VKORC TT og VKORC AA er koblede gener. Derimod var der patienter med genotypevarianten TT i VKORC1 1173, der ikke bærer AA i VKORC1 1639, så koblingen er ikke 100 %. Der er ingen, af patienterne med varianterne 1173 TT og 1639 AA i VKORC1, der modtager høj Marevan dosis. De behandles enten med lav eller normal dosis. Der er konkordans med udsagnene fra Sconce et al. (12) og D Andrea 31

34 et al. (11), der henholdsvis beskriver, at patienter med genvarianten AA i VKORC behandles med lavere dosis end patienter med varianterne GA og GG. Det samme gør sig gældende i D Andrea et al. (11) og Skov et al. (23) der beskriver, at patienter med genvarianten TT i VKORC modtager lavere dosis end patienter med varianterne CC og CT. Det kan ud fra resultaterne diskuteres om genotypebestemmelse skal anvendes i forbindelse med indkørselsfasen i AK-behandlingen, da der ikke ses nogen sammenhæng i dette forsøg. Ud fra de anvendte artiklers udsagn påvises en sammenhæng imellem generne VKORC1 og CYP2C9 og deres påvirkning af Marevan dosis (3,11,12,30). Der er nogle parametre, der kan være skyld i at der ikke kan påvises en sammenhæng. Disse parametre vil blive diskuteret herunder. Statistiske test Såfremt der en sammenhæng mellem Marevan dosis og genotyperne, er der en række faktorer, der kan være skyld i manglende påvisning i dette forsøg. En årsag kunne være valget af statistisk test. Den statistiske styrke er svag, da patientmaterialet er for lille i forhold til χ 2 -testens krav. En χ 2 -test er en nonparametrisk signifikanstest, og patientmaterialet skal være uafhængigt af hinanden. Det er et krav fra χ 2 -test, at antallet af forsøgspopulationen skal være over 40 og en celles minimumværdi > 5. De krav blev ikke overholdt, idet der kun var 22 patientprøver, og flere celler havde en celleværdi på 0 eller under 5. På baggrund af det burde en anden teste være valgt. Alternativet kunne være Fishers eksakte test. Kravene til udførsel af Fishers eksakte test er, at data skal bestå af en stikprøve fra to populationer og observationer skal kategoriseres i én af de to grupper. De krav, der var for udførsel af denne test, kunne ikke opfyldes, idet der var tre dosisklasse og tre genotypeklasser for hvert locus, og der blev på baggrund af det besluttet, at χ 2 -test blev bibeholdt på trods af de nævnte forbehold (31). 32