Implementering af HLA- DQ2 & HLA-DQ8 som undersøgelsesmetode for Cøliaki

Transkript

1 Implementering af HLA- DQ2 & HLA-DQ8 som undersøgelsesmetode for Cøliaki Uddannelsessted: Klinisk uddannelsessted: VIA UC Bioanalytikeruddannelsen Klinisk Biokemisk Afdeling, Regionshospitalet Silkeborg Forfatter: Kjetil Børve Lund Studienr: K-vejleder: I-vejleder: Tegn: Bioanalytikerunderviser Jette Kofod-Nielsen, Lektor, Cand.scient. Jesper Voldby inkl. mellemrum

2 Forord Cøliaki er en sygdom der ikke er meget fokus på i hverken det danske samfund eller det danske sundhedsvæsen, i forhold til andre sygdomme. Ny viden om cøliaki og en nyudviklet PCR-metode gør dette projekt meget spændende med tanke på fremtiden for diagnosticeringen af cøliaki. I forbindelse med projektet vil jeg gerne takke dem der har bidraget til projektet: Bjarne Kristensen, Nordic Area Manager for Thermo Fisher Scientific, som har været meget behjælpelig med at låne os apparatur og reagenser til projektet, samt tålmodighed til at besvare alle de spørgsmål vi har haft. Jens Lundtoft, WebMaster for Dansk Cøliaki Forening, har været en meget god kontaktperson mellem os og Dansk Cøliaki Forening, og fortjener en stor tak. Personalet ved Biokemisk Afdeling på Regionshospitalet Silkeborg, og da specielt Afdelingsbioanalytiker Christian Simonsen, skal også have en stor tak for den hjælp de har været i løbet af projektforløbet, i form af tips, råd, information og tålmodighed. Projektet og kontakt med medlemmer af Dansk Cøliaki Forening har været inspirerende, samtidig har jeg fået en ny forståelse for de enkeltprocesser og detaljer, som bidrager, og dermed udgør arbejdet med at lave et større projektarbejde. Sted Dato Kjetil Børve Lund

3 Indholdsfortegnelse Resumé... 3 Introduktion... 3 Baggrund... 3 Formål & Problemformulering... 5 Målformulering... 5 Cøliaki... 6 Prevalence... 6 Gluten... 7 Symptomer... 7 Sammenhæng med andre sygdomme... 8 Vævstyperne HLA-DQ2 & HLA-DQ Serologiske analyser TGA Biopsi Diagnose & behandling Materiale og metode Prøveindsamling Prøveopbevaring Analysemateriale Etiske overvejelser Dataindsamling Databearbejdning Litteratursøgning Resultat Analyseresultater Økonomi & tidsforbrug Diskussion Resulter Metode Projektet Fejlkilder Perspektivering Konklusion Referenceliste Bilag... 37

4 Implementering af HLA-DQ2 & HLA-DQ8 som undersøgelses metode for cøliaki Side 3 Resumé Baggrunden for dette projekt er at der er kommet ny viden om cøliaki, og specielt hvorledes vævstyperne HLA-DQ2 og HLA-DQ8 er associeret med sygdommen. Samtidig har Thermo Fisher rettighederne til en metode til at screene og udføre allelbestemmelser af disse vævstyper. Formålet med projektet er derfor at undersøge om Thermo Fishers PCR-metode til analysering af HLA-DQ2 og HLA-DQ8 kan implementeres ved Klinisk Biokemisk Afdeling på Regionshospitalet Silkeborg. Projektet er udført for at undersøge om Thermo Fishers PCR-metode kan bruges til at bestemme cøliaki-associerede HLA-vævstyper som en del af diagnosticeringen af cøliaki. Dette blev gjort ved at undersøge 35 cøliakere og 10 raske personer for vævstyperne, samt transglutaminase og herefter sammenligne resultaterne med litteratur og andre studier. Resultaterne af vævstypebestemmelsen var at apparaturet kunne screene for vævstyperne, bestemme cøliaki-associerede allel og de serologiske haplotyper HLA-DQ2 og HLA-DQ8. Resultaterne kunne også relateres til andre undersøgelser og gældende teori. Resultaterne sammenholdt med andre undersøgelser viser at vævstype analysen kan implementeres som en del af diagnosticeringen af cøliaki, ved Klinisk Biokemisk Afdeling på Regionshospitalet Silkeborg. Introduktion Ved brainstorming for idéer omkring potentielle bacheloremner, fik vi i projektgruppen et tips af Afdelingsbioanalytiker Christian Simonsen om at det kunne være en god ide at kontakte Bjarne Kristensen omkring muligheden for at benytte Thermo Fishers apparatur til at bestemme vævstyperne HLA-DQ2 & HLA-DQ8, da de to overnævnte havde talt om en mulig implementering af dette på grund af nye diagnostiske guidelines for diagnosticering af cøliaki. Vi i projektgruppen synes det lød meget interessant og tog derfor kontakt med Bjarne Kristensen. Baggrund Cøliaki, også kendt som glutenallergi eller gluten intolerance, er en autoimmun sygdom, der forekommer i tyndtarmens slimhinder og medfører, at lymfocytter medierer en kronisk inflammation, der resulterer i villus-atrofi, og dermed en nedsat funktion af tarmen. Dette forårsager, at man har svært ved at optage næringsstoffer fra kosten.

5 Implementering af HLA-DQ2 & HLA-DQ8 som undersøgelses metode for cøliaki Side 4 Cøliaki er en livslang lidelse, men symptomerne kan undgås ved at holde en glutenfri diæt. Cøliaki kan forekomme i alle aldersgrupper, dog mente man tidligere, at det var en børnesygdom[1]. På nuværende tidspunkt diagnosticeres cøliaki på baggrund af antistoffer mod transglutaminase (TGA), samt en biopsi fra tyndtarmen. Cøliakere, som indtager en glutenholdig kost, vil have en forhøjet TGA. Op mod 10 % af cøliakerne har IgAmangel og da TGA analyseres på antistoffer af typen IgA-antistoffer, kan der forekomme falsk negative TGA-analysesvar. I disse tilfælde kan man foretage en TGAanalyse på antistoffer af typen IgG-antistoffer[1-4]. Indtil nu regnes biopsien for at være en guldstandart for diagnosticeringen af cøliaki. European Society for Pediatric Gastroenterology, Hepatology, and Nutrition påpeger dog i nye guidelines for diagnosticering af cøliaki ulemper ved biopsimetoden og fremhæver i stedet vævstypebestemmelse af HLA-DQ2 & HLA-DQ8. Udtrykkes en af de førnævnte vævstyper ikke, kan man heller ikke have cøliaki. Dog vil en positiv vævstypebestemmelse ikke være ensbetydende med cøliaki. Vævstypebestemmelsen skal dermed sammenholdes med en positiv TGA, kliniske symptomer som træthed, vægttab, diaré og anæmi[3], og evt. en biopsi for den endelige diagnose[1]. Den reelle prevalence for cøliaki er et omdiskuteret emne, men den regnes til at være underdiagnosticeret. Nyere studier påpeger at prevalence for cøliaki kan være som høj som lidt over 1 % af befolkningen, og højere blandt enkelte andre sygdomsgrupper[1,4,5]. På nuværende tidspunkt kan vævstyperne analyseres ved Statens Serum Institut (SSI). Denne analysepakke, cøliaki-antistoffer inkl. vævstyper, kan benyttes til diagnosticeringen af cøliaki[6,7]. Thermo Fisher har rettighederne til en molekylærbiologisk metode, BioRun, med et tilhørende apparatur, som er specifik for vævstyperne HLA-DQ2 og HLA-DQ8, udviklet af italienske BioDagene S.r.l. Metoden henvises herefter som Thermo Fishers analysemetode, da det er Thermo Fisher har rettighederne for apparaturet i Danmark, og leverer apparaturet. Thermo Fischer oplyser at denne metode vil være meget billigere sammenlignet med SSI s metode. Analyseprincippet bag BioRun er en PCR-metode med specifikke primers for de alleler, der koder for vævstyperne HLA-DQ2 og HLA-DQ8[8].

6 Implementering af HLA-DQ2 & HLA-DQ8 som undersøgelses metode for cøliaki Side 5 Emnet er meget interessant, fordi cøliaki er en underdiagnosticeret sygdom, som der blandt befolkningen og klinikere ikke er meget fokus på. I dag tager det forholdsvis lang tid at stille diagnosen cøliaki, og Thermo Fishers PCR-metode vil potentielt kunne stille diagnosen hurtigere for nogle patienter, og udelukke diagnosen for andre patienter. Vævstyperne, HLA-DQ2 og HLA-DQ8, bruges i dag kun i mindre grad til diagnosticeringen af cøliaki og de nye guidelines anbefaler netop at anvende vævstyperne som et diagnostisk værktøj[1]. Formål & Problemformulering Hvilke konsekvenser vil det have for Klinisk Biokemisk Afdeling (KBA) på Regionshospitalet Silkeborg (RSI) og for patienterne, der skal udredes for cøliaki, at indføre Thermo Fishers PCR metode og tilhørende BioRun apparatur, til bestemmelse af vævstyperne HLA-DQ2 og HLA-DQ8 og samtidig med anbefaling fra de nye guidelines undersøge patienterne for TGA for at sammenholde denne med vævstypebestemmelsen. Målformulering Vi vil undersøge om KBA på Regionshospitalet Silkeborg kan implementere Thermo Fishers PCR metode og tilhørende BioRun apparatur til bestemmelse af vævstyperne HLA-DQ2 & HLA-DQ8, sammenholdt med en TGA-analyse, som en del af diagnosticeringen til cøliaki. Dette gøres ved hjælp af litteraturstudier og patientforsøg på både cøliakere, som vi antager at have vævstypen HLA-DQ2 eller HLA-DQ8 og en positiv TGA, og formodede ikke-cøliakere, der kan have vævstypen HLA-DQ2 eller HLA-DQ8 og en negativ TGA. Vi vil undersøge, om Thermo Fishers PCR metode er billigere end Statens Serum Instituts metode, ved at studere omkostningerne på Regionshospitalet Silkeborg. Vi vil undersøge, om klinikerne kan få et hurtigere analysesvar til fordel for patienterne, ved at benytte Thermo Fishers apparatur i forhold til dagens metoder.

7 Implementering af HLA-DQ2 & HLA-DQ8 som undersøgelses metode for cøliaki Side 6 Cøliaki European Society for Pediatric Gastroenterology, Hepatology, and Nutrition (ESPGHAN) har nylig lavede nye guidelines til diagnosticering af cøliaki[1], og har kommet frem til følgende definition af hvad cøliaki er: Cøliaki er en immun-medieret systemisk lidelse, fremkaldt af gluten og tilsvarende prolaminer, hos genetisk disponerede individer. Cøliaki er karakteriseret af tilstedeværelsen af varierende kombinationer af kliniske symptomer, cøliaki specifikke antistoffer, de serologiske haplotyperne HLA-DQ2 & HLA-DQ8 og histologisk forandring i tyndtarmen[1,4,5]. Prevalence De sidste 20 år har antallet af cøliakidiagnoser steget kraftig. Kneepkens et al[4] nævner at antallet diagnoser i Nederland har gået fra 0,1 0,2 per 1000 fødsler mellem 1970 og 1980, til 0,54 per 1000 fødsler i 1994, til 1,1 per 1000 fødsler i Denne trend har så fortsat i samme spor, og i 2010 tilsvarende andel 1,5 per 1000 fødsler. I den samme artikel skriver de at dette tal nok kun er en lav andel af det faktiske antal cøliakere, da populations-studier i vestlige land, anslår at den sande prevalence for cøliaki er tættere på 1 per 100 fødsler. Andre undersøgelser understøtter den øgede prevalence for vestlige lande, og kommer frem til at prevalence for cøliaki er fordoblet siden Samtidig mener forfatterne at den øgede mængde stillede cøliaki diagnoser ikke kun kan ses på som et produkt af forbedret diagnostik, men at prevalence for cøliaki også er øget, sammen med det stigende antal af diabetes mellitus type 1 (T1DM) og allergier[1,4,5]. Studier viser at ældre mennesker har en øget prevalence for cøliaki[5,9]. Der er enighed om at cøliaki er en meget underdiagnosticeret sygdom, da mellem % af cøliakerne ikke er diagnosticeret[1,4], tallet vil dog variere fra land til land. I Danmark mener man at ca. 10 % af cøliakere er diagnosticeret[2]. Cøliaki er derfor en af de mest udbredte, livslange madrelaterede sygdomme i vestlige land[5]. Cøliaki er arveligt, og 10 % af cøliakere har førstegrads slægtninge som også har eller udvikler cøliaki. En undersøgelse er kommet frem til at arveligheden ikke er ens for begge køn. I tilfældig cøliakers familie er der 17,6 % chance for at cøliakerens søster også har eller udvikler cøliaki. For cøliakerens bror er chancen 10,8 %, og for forældre (køn ikke opgivet) er den 3,4 %. I en cøliakers familie hvor vævstyperne HLA-DQ2

8 Implementering af HLA-DQ2 & HLA-DQ8 som undersøgelses metode for cøliaki Side 7 eller HLA-DQ8 identificeret er chancerne 29 % for en søster, 15 % for en broder, og 6 % for forældre[4]. Gluten Gluten er et samlenavn for den alkoholopløselige del af hvede, og består af en heterogen blanding af gliadin og glutenin. Gluten er resistent mod enzymnedbrydelse, og immunogene glutenpeptider kan derfor nå tyndtarmens overflade. Andre kornarter indeholder lignende prolaminer, sekalin (rug), hordein (byg), avenin (havre) og kan derfor forårsage en tilsvarende effekt. Avenin har dog færre antigensekvenser, og ren, behandlet havre regnes for at være trygt for cøliakere[4,5,9]. Gluten findes dog i rigtig mange produkter, ikke kun i brød og pasta, men også i saucer, supper og mediciner. Pga. tilstedeværelsen af gluten ligger indtaget af gluten mellem gram per dag i vestlige land, og cøliakere kan have problemer med at holde en glutenfri diæt[10]. Symptomer Sygdommen cøliaki kan optræde meget forskelligt fra patient til patient, og kan have følgende symptomer: Tabel 1: Symptomer ved cøliaki Typiske symptomer: Vægt tab Diaré Opkast Mavesmerter (børn) Mistrivsel (børn) Mindre typiske symptomer: Kronisk træthed Osteoporose Anæmi jern og folinsyre Dermatitis herpetiformis Tandemalje defekt Listen af symptomer i tabel 1 er ikke fuldendt, da de enkelte cøliakere også kan have andre, mere diffuse symptomer, men tabellen viser de mest typiske symptomer, og de symptomer som ikke er specielt typiske for cøliaki, som dog stadig ses relativt ofte i forbindelse med cøliaki[1,4].

9 Implementering af HLA-DQ2 & HLA-DQ8 som undersøgelses metode for cøliaki Side 8 Sammenhæng med andre sygdomme Cøliaki ses relativt ofte sammen med nogle andre sygdomme og syndromer. Specielt personer med Downs syndrom, Williams syndrom eller Turner syndrom har en øget risiko for at udvikle cøliaki[1,4]. Også børn med andre autoimmune sygdomme har en øget risiko for at udvikle cøliaki. Cøliaki ses derfor specielt ofte ved børn med T1DM, men også de med IgA mangel, autoimmun thyroiditis, autoimmun hepatits, alopecia areata, rheumatoid arthritis og Crohns sygdom[1,4]. Nogle få cøliakere udvikler også en type cøliaki som er associeret med entropatiassocieret T-celle lymfom[4]. Vævstyperne HLA-DQ2 & HLA-DQ8 Studier viser at vævstyperne HLA-DQ2 og HLA-DQ8 er stærkt associeret med cøliaki, så stærkt at man ikke kan udvikle cøliaki uden at have en eller begge vævstyper. Et sammendrag af studier påpeger at DQ2 og DQ8 udgør ca % af den genetiske risiko for at udvikle cøliaki og nyere studier har indtil videre fundet over 40 gener, som både øger og mindsker risikoen for cøliaki. Af disse genetiske faktorer som ikke hører under HLA-vævstyperne, er et mindre tal (1/3) associeret med cøliaki alene, mens de resterende (2/3) er associeret med andre genetiske sygdomme som: hæmologiske-, metaboliske-, neurologiske-, onkologiske- og specielt immun-relaterede sygdomme. Den største genetiske sammenhæng ses ved T1DM, rheumatoid arthritis og Crohns sygdom, som er med at forklarer hvorfor cøliakere også har en relativt højere prevalence af de overnævnte lidelser[1,4,11]. Vævstyperne DQ2 og DQ8 er en del af det som går under fælles benævnelsen human leukocyt antigen (HLA) klasse II haplotyper og er en del af MHC II-familien (major histocompatibility complex), og generne som koder for HLA er lokaliseret på den korte arm af kromosom 6. Disse MHC II antigensystemer præsenterer antigener på ydersiden af T- cellemembranen, og er med til at stimulere hjælper T-celler, som så stimulerer antistofproducerende B-celler til at producere antistoffer til specifikke antigen[4]. Mellem 30 og 40 % af den kaukasiske befolkning har DQ2 og/eller DQ8, men få, mellem 1 3 %, DQ2- og DQ8-positive udvikler cøliaki[1,4,12].

10 Implementering af HLA-DQ2 & HLA-DQ8 som undersøgelses metode for cøliaki Side 9 Studier indenfor vævstyperne er kommet frem til at 95 % af cøliakere har vævstypen DQ2, mens DQ8 står for tæt på de resterende 5 %[1]. DQ2 repræsenterende celler kan danne antigen-antistof reaktioner til et stort antal glutenpeptider, i forhold til DQ8, og DQ2 binder også peptiderne mere stabilt. Dette er med til at forklare sammenhængen mellem HLA-allelstatus og risikoen for at udvikle cøliaki. Personer med homozygot DQ2 har en relativt høj risiko for at udvikle cøliaki, personer med heterozygot HLA-DQ2 har en relativt moderat risiko, og personer med HLA-DQ8 har en relativt lav risiko[4,12]. Vævstypebestemmelse af vævstyperne HLA-DQ2 og HLA-DQ8 udføres i dag af Statens Serum Institut, på bestilling[6,7]. Thermo Fisher oplyser at de har en analysemetode og apparatur, BioRun, til at analysere vævstyperne HLA-DQ2 og HLA-DQ8, samt udføre en allelbestemmelse. Analyseprincippet bag Thermo Fishers analysemetode er forklaret i figur 1. Det er vigtig at bemærke sig at PCR-metoden inkluderer primere for vævstyperne HLA-DQ2 og HLA-DQ8, samt for et husholdningsgen som alle mennesker har. Husholdningsgenet fungerer som en intern kontrol da den altid skal være positiv. Derudover analyseres der en positiv kontrol og en kontaminationskontrol. Den positive kontrol sikrer at enzymet er aktivt, bufferen er optimal, at primerne primer de rigtige DNA-sekvenser og at thermal cycleren benytter den korrekte protokol. Kontaminationskontrollen sikrer at prøveblandingen ikke er kontamineret af fremmed DNA[8,12]. Protokollen for vævstypescreening, men protokollen for allelbestemmelse er næsten ens. Forskellen ligger i at der i allelbestemmelsen benyttes en strip med 8 PCR-rør til den enkelte patient, mens vævstypescreeningen benytter et PCR-rør til hver patient. Derudover har PCR-rør til allelbestemmelsen nogle andre prædispenserede primere end PCR-rør til vævstypescreening.

11 Implementering af HLA-DQ2 & HLA-DQ8 som undersøgelses metode for cøliaki Side 10 Figur 1: Analyseprincip for PCR Trin 1: Denaturering Prøveblandingen varmes op til 94 C, således at DNA denaturer. Trin 2: Hybridisering Prøveblandingen afkøles til 52 C, og primerne hybridiserer til det komplementære mål-dna. (DNA og primere i billedet er ikke nødvendigvis repræsentativt for det reelle DNA for HLA-DQ-alleler) Trin 3: Polymerisering TAQ-polymerasen syntetiserer mål- DNA ved 52 C, fra de to original DNA-tråde, som nu er hybridiseret med primere. Trin 4: Gentagelse Trin 1 3 gentages 40 gange. Figur 1 viser en beskrivelse af analyseprincippet bag Thermo Fishers PCR-metode bestemmelse af HLA-DQ2 & HLA-DQ8. Figurerne er lavet i Paint af undertegnede efter beskrivelser fundet i BioRun indlægssedler[13,14] og Molecular Diagnostics, s [11].

12 Implementering af HLA-DQ2 & HLA-DQ8 som undersøgelses metode for cøliaki Side 11 I Thermo Fishers PCR-metode indgår følgende elementer: Lyseringsbuffer: Lyserer leukocytter således at DNA er frit i væsken. Bufferen indeholder også elementer som gør forholdene for enzymreaktion og DNA hybridisering optimale. Primer: Primerne er homologe til områderne på DNA-kæden som sidder til siden for målområdet. Primeren er dermed med og angiver hvor polymerasen starter syntetiseringen af mål-dna. Polymerase: Polymerasen som benyttes i Thermo Fishers PCR metode er TAQ, som er modstandsdygtig mod varmeinduceret protein-denaturering. Aflæsningen gøres ved at primerne fluorescerer, som kan måles fluorometrisk af BioRun apparaturet. Vævstypescreening kommer med et positivt eller negativt svar, hvor et positivt svar påviser tilstedeværelsen af HLA-DQ2 og/eller HLA-DQ8. Et negativt svar betyder at personen vi analyser, ikke har HLA-DQ2 eller HLA-DQ8. Allelbestemmelsen angiver de specifikke allel, serologisk haplotype(r), og homozygot- eller heterozygotstatus for allel DQB1*02, for dem der har den serologiske haplotype HLA-DQ2. Serologiske analyser Serologiske analyser udgør en stor del af de diagnostiske værktøjer som bruges til at diagnosticere cøliaki, pga. den høje specificitet og sensitivitet de enkelte analyser har[1,15]. TGA TGA (transglutaminase) er et calcium-afhængig enzym, som normalt befinder sig inaktivt intracellulært, og frigives i den extracellulære matrix ved mekanisk og inflammatorisk stress. TGA er identificeret til at være en cøliaki specifikt autoantigen, som gør at man kan analysere for TGA ved mistanke om cøliaki. Analysen gøres på IgA-klasse TGA-antistoffer, og har en sensitivitet på mellem % og specificitet på mellem %, afhængig af den aktuelle analysemetode. Der kan opstå falsk negativ analysesvar for personer med IgA-mangel, i disse tilfælde kan TGA analyseres på IgG-antistoffer[5,15,16].

13 Implementering af HLA-DQ2 & HLA-DQ8 som undersøgelses metode for cøliaki Side 12 Ved Regionshospitalet Silkeborg analyseres TGA vha. en automatiseret EliA metode på apparaturet Phadia 250. Analysen udføres på EDTA stabiliseret plasma, og analyseprincippet er beskrevet i figur 2[16]. Figur 2: Analyseprincippet for TGA analysen på Phadia 250: Trin 1: Det antigen der undersøges for, og som EliA-brøndens polystyrenoverflade er coatet med, reagerer med det specifikke IgA i den fortyndede serumprøve fra patienten. Trin 2: Efter at ikke-specifikt IgA er vasket væk, tilsættes enzymmarkerede antistoffer mod IgA for at danne et kompleks. Trin 3: Efter inkubation vaskes ubundet enzym-anti IgA væk, og det bunde kompleks inkuberes derfor med et udviklingsmiddel. Trin 4: Når reaktionen er stoppet måles reaktionsproduktets fluorescens. Jo højere fluorescens, desto mere specifikt IgA er der i prøven. For evaluering af test resultaterne sammenlignes responsen for patientprøverne direkte med responsen fra kalibratorerne.

14 Implementering af HLA-DQ2 & HLA-DQ8 som undersøgelses metode for cøliaki Side 13 Figur 2 er en detaljeret forklaring på analyseprincippet for EliA-analyse af TGA. Figuren er udarbejdet efter brugermanual til Phadia 250, s101[17]. Analysen regnes som negativ ved resultat mellem 0-6 U/ml, og positiv ved resultater mellem U/ml. Mellem 6 7 U/ml er en gråsone, hvor analyseresultatet ikke er definitivt negativt eller positivt. Analyseapparaturet benyttes ikke eksklusivt til TGA-analyser[5,15,16]. EMA EMA (endomysium) er en meget specifik antistof-analyse til diagnosticering af cøliaki, men den har ikke en lige så høj sensitivitet som TGA, da mellem % af udiagnosticerede cøliakere får et negativt analysesvar. Derudover er analysen dyr og arbejdskrævende. Analysen udføres ikke ved Regionshospitalet Silkeborg[5,15]. AGA AGA (gliadin) er en anden serologisk analyse som kan benyttes til diagnosticering af cøliaki. Analysen har dog lavere specificitet og kan give falsk positiv ved andre sygdomme som allergi, rheumatoid arthritis, psoriasis m.m. Analysen udføres ikke ved Regionshospitalet Silkeborg[5,15]. Biopsi Tyndtarmsbiopsi er historisk set, et af de vigtigste diagnostiske værktøjer til at stille en sikker cøliaki-diagnose. Biopsien udføres mens den formodelige cøliaker holder en normal, glutenholdig diæt, som giver muligheden for at foretage en histologisk vurdering af tarmens slimhinde. Cøliakere vil have villus-atrofi med krypt hyperplasi. Villus-atrofi er dog ikke ensartet med cøliaki, og kan ses ved andre sygdommer som autoimmun entropati, komælk-allergi, rotavirus og giardiainfektion. Villus-atrofi kan også være begrænset til mindre områder af tyndtarmens slimhinde[1,4,5,16,18]. Den histologiske vurdering udføres efter Marsh-skalaen, som går fra Marsh 0 (normal slimhinde) til Marsh III (villus-atrofi) som er beskrevet i figur 3.

15 Implementering af HLA-DQ2 & HLA-DQ8 som undersøgelses metode for cøliaki Side 14 Figur 3: Marsh klassifikation Figur 3 viser de forskellige trin i Marsh-skalaen. Billedet er fundet i Kneepkens C. M. et als artikkel Clinical Practice Coeliac Disease, s3. Fra venstre til højre: Marsh 0 (normal), Marsh I (øgning af intraepitheliale lymfocytter), Marsh II (øgning af intraepitheliale lymfocytter og krypt hyperplasi), Marsh IIIa (delvis villus-atrofi), Marsh IIIb (nær total villus-atrofi) og Marsh IIIc (total villus-atrofi)[4,5]. I løbet af de sidste par år har flere studier påvist at tyndtarms biopsier måske ikke er den guldstandard som tidligere antaget. Der er fundet flere problemer som underbygger denne tvivl, blandt andet at der er flere sygdomme som kan danne villusatrofi, villus-atrofi kan opstå pletvis, og kan være ikke-tilstedeværende. Specielt for cøliakere med kort sygdomsforløb kan der være tale om at intet eller svag villus-atrofi, da skaden på slimhinden sker gradvis over tid. Tolkning af gråzonetilfælde er også meget svært, selv for erfarne patologer, og fremstillingen af biopsierne kan være svær, pga. lejring af villier og biopsien må ramme præcis hvor villus-atrofi har opstået[1,5]. Diagnose & behandling I dag stilles diagnosen ved normal glutenholdig diæt. Diagnosen stilles på baggrund af en eller flere serologiske test(s), som TGA, EMA og/eller AGA. Ved Regionshospitalet Silkeborg benyttes der kun TGA, og sygehuset udfører TGA-analysen for et stort flertal af sygehuse og praktiserende læger i Region Midt. Derudover udføres der en biopsi som vurderes af en patolog. Vævstypebestemmelse af HLA-DQ2 og HLA-DQ8 udføres mere som et undtagelse, end som et fast diagnostisk værktøj, selv om den har en høj negativ prædikativ værdi[1].

16 Implementering af HLA-DQ2 & HLA-DQ8 som undersøgelses metode for cøliaki Side 15 Der er ingen form for behandling for en cøliaker, men ved at følge en livslang glutenfri diæt vil man holde sig symptomfri[1,4,5]. Materiale og metode Undersøgelsen er en randomiseret, kvalitativ undersøgelse af vævstyperne HLA-DQ2 og HLA-DQ8 vha. Thermo Fishers BioDiagene PCR-metode sammenholdt med en TGA-undersøgelse. Undersøgelsen blev udført ved at undersøge medlemmer af Dansk Cøliaki Forening, som bekræftede at de har fået diagnosen cøliaki, samt en kontrolgruppe bestående af formodede raske personer. Prøvematerialet til vævstypeundersøgelsen bestod af EDTA-fuldblod og EDTAplasma til TGA-analysen. Derudover bidrog Thermo Fisher og KBA, RSI med de nødvendige apparaturer og reagenser for at udføre projektet. Prøveindsamling Vores inklusionskriterium for at deltage i projektet var at personen skulle være diagnosticeret med sygdommen cøliaki, efter de gældende retningslinjer i det danske sundhedsvæsen. Diagnosen blev kun bekræftet af den aktuelle cøliaker, eller cøliakerens forælder/værge for børn, da vi anså det til at være tilstrækkelig i den her sammenhæng, med tanke på at cøliakerne er medlem af Dansk Cøliaki Forening. Det skal dog nævnes at nogle af cøliakerne er familiemedlemmer eller bekendte med nogle af os i projektgruppen, og der var en cøliaker der var diagnosticeret i Tyrkiet, ikke Danmark. Det var målet at anskaffe prøvemateriale fra 50 cøliakere og 10 personer til kontrolgruppen. På grund af tidsrammen for bachelorprojektet, den tid det tog at komme i kontakt med og interessere cøliakerne, og tilrettelægge tidspunkter for blodprøvetagning blev der kun tid til at indsamle prøver fra 35 cøliakere. Men vi i projektgruppen blev enige om at det var nok prøvemateriale, da det sammen med kontrolgruppen, overholder de formelle krav til videnskabelige undersøgelser hvor der skal være en prøvemængde på mindst 40 prøver, og hvor mindst 50 % falder udenfor normalområdet[19]. Cøliakerne var af begge køn, dog med en overvægt af kvinder, og i alderen 4 ca. 80 år. Til sammen var der 35 cøliakere der deltog som forsøgspersoner, og de har haft diagnosen i alt fra inden for det sidste år til 40 år tilbage i tid. Cøliakerne bestod af kaukasiere, somaliere og tyrkere, med en hovedvægt på kaukasiere.

17 Implementering af HLA-DQ2 & HLA-DQ8 som undersøgelses metode for cøliaki Side 16 Derudover benyttede vi os af en kontrolgruppe som bestod af formodelig raske personer. Deltagere i kontrolgruppen var seks tilfældigt udvalgte bioanalytikere ved KBA, RSI og os fire bioanalytikerstuderende som lavede projektet. Kontrolgruppen bestod derfor af personer i alderen 23 ca. 50 år, og af de samme etniske grupper som cøliakerne. Lige som ved cøliakerne var der en overvægt af kvinder i kontrolgruppen. Her var inklusionskriteriumet at personer i kontrolgruppen ikke skulle være diagnosticeret med cøliaki. Prøveindsamlingen foregik ved at projektgruppen kontaktede Dansk Cøliaki Forening og venner af gruppens medlemmer som er tidligere diagnosticeret med cøliaki. Prøvemateriale fra kontrolgruppen blev indsamlet fra tilfældigt udvalgte bioanalytikere ved KBA, RSI, og projektgruppens medlemmer. Prøvematerialet blev indsamlet i form af to EDTA-blodprøver, hvor en blev centrifugeret og EDTA-plasma afpipperet til TGA-analysen, og en blodprøve med EDTA-fuldblod til vævstypebestemmelsen. Vi lavede et opslag som kan ses i bilag 1. Opslaget kom med på foreningens internetside og nyhedsbreve for at interessere medlemmer af foreningen, og give medlemmerne en mulighed for at kontakte os. Vi var også tilstedet ved to af foreningens arrangementer, et ved Løvbjerg i Fredericia og et udenfor Odense. Prøvemateriale indsamlet ved arrangementerne eller ved RSI blev behandlet som beskrevet nedenunder i Prøveopbevaring. Nogle cøliakere kontaktede os og fik tilsendt et brev som kan ses i bilag 2, således at de fik taget blodprøverne på deres lokale sygehus. Brevet indeholdt også oplysninger til bioanalytikerne som tog blodprøverne om hvorledes prøverne skulle behandles og sendes. Prøvematerialet blev nummereret løbende efter som det ankom på afdelingen, det vil sige at den første blodprøve vi tog af en cøliaker blev markeret som nr. 1 og den sidste som nr. 35. Kontrolgruppen havde sin egen nummerrække fra EDTAfuldblod og EDTA-plasma fra den samme person fik det samme nr.

18 Implementering af HLA-DQ2 & HLA-DQ8 som undersøgelses metode for cøliaki Side 17 Prøveopbevaring Prøvemateriale til TGA-analysen blev centrifugeret, og EDTA-plasma afpippeteret. Derefter blev EDTA-plasma til TGA-analysen og EDTA-fuldblod til vævstypebestemmelsen nedfrosset ved -20 C. EDTA-plasma til TGA-analysen og EDTA-fuldblod til vævstypebestemmelsen har en holdbarhed på 1-2 år (måske længere) ved -20 C[16,21]. Analysemateriale Herunder bruges referencerne[13,14]. Reagenser: Ekstrationsbuffer Primer mix TAQ mix Primer mix for kontrol cøliaki gen TAQ mix for kontrol cøliaki gen Apparatur og utensilier: Thermal cycler for 0,2ml brønde BioRun aflæser Vortexer Mini centrifuge for 0,2ml brønde (6000 rpm/2000xg) Voks Låg til 0,2ml brønde Barkode til cøliaki gen bestemmelse 10µl og 200µl justerbare pipetter og pipettespidser m. filter Sterile 1,5 ml eppendorf-rør Engangshandsker Etiske overvejelser Cøliakerne blev tydeligt oplyst om at prøverne blev behandlet anonymt, og at der efter analysering ikke blev videregivet tilbagemeldinger om analyseresultaterne, uanset analysesvar. Dette blev oplyst mundtlig når vi i projektgruppen tog blodprøverne, og i de breve vi sendte til cøliakerne som fik taget blodprøverne ved andre sygehuse. I de tilfælde hvor vi tog blodprøver af børn blev både barnet (når de var gamle nok til at forstå sammenhængen) og forældre orienteret om anonymiteten. Samtidig med at vi tog blodprøverne forklarede vi, hvorledes blodprøverne blev behandlet videre i projektforløbet.

19 Implementering af HLA-DQ2 & HLA-DQ8 som undersøgelses metode for cøliaki Side 18 Dataindsamling Analysedata blev fremskaffet ved at analysere prøvematerialet for vævstyperne HLA- DQ2 og HLA-DQ8 ved at anvende BioDiagene fra Thermo Fisher, og ved at analysere prøvematerialet for TGA ved at anvende Phadia 250 fra Thermo Fisher. Vævstypebestemmelsen blev udført ved at alt prøvemateriale blev screenet vha. et screeningskit, derefter udførte vi en allel bestemmelse på de prøver der fik et positivt screeningsresultat. Der skal dog nævnes at der var en af cøliakerne der blev screenet til at være negativ, men pga. at alle cøliakere formodelig skulle få et positivt screeningsresultat, blev den screenet to gange og taget med videre til allel bestemmelsen. TGA blev, af praktiske årsager, analyseret over to analyseringskørsler. Alle kontroller, til de respektive analyser blev analyseret til at være normale. Analyserne foregik efter respektive brugervejledninger, BioDiagene og Phadia 250, begge fra Thermo Fisher[13,14,17]. Analyseforskriften kan også ses i bilag. Inden forsøget påbegyndte blev apparaturet testet under vejledning af Bjarne Kristensen. Analysen af prøvematerialet foregik i uge 15 16, i henhold til de formelle krav til videnskabelige undersøgelser hvor der skal analyseres over minimum 5 dage[19]. De overnævnte analysemetoder blev valgt da de er en del af formålet for bachelorprojektet. Vævstypebestemmelen skulle i teorien være positiv for alle cøliakere, da HLA- DQ2 og HLA-DQ8 er en af de grundlæggende ting der skal være tilstedet for at man kan udvikle sygdommen cøliaki, og forsøgspersonerne blev også derfor udvalgt med det i tankerne, for at vise at Thermo Fishers apparatur kunne påvise vævstyperne i allerede diagnosticerede cøliakere. Samtidig var det et mål at vise at vævstyperne også ses i den øvrige befolkning, blandt raske mennesker. TGA analysen derimod var forventet at variere, altså både positive og negative resultater for cøliakerne, da nogle cøliakere er rigtig dygtige til at holde en glutenfri diæt, mens andre er mindre gode. TGA for kontrolgruppen var forventet at være negativ. TGA bruges i dag primært til at stille diagnosen cøliaki og har op mod 100 % specificitet, over 90 % sensitivitet og en negativ prædikativ værdi tæt på 100 %. Vævstypebestemmelen bruges i dag kun i mindre grad, på grund af prisen på forsendelse og analysering ved SSI.

20 Implementering af HLA-DQ2 & HLA-DQ8 som undersøgelses metode for cøliaki Side 19 Der blev ikke udført en dedikeret pilottest, men de første forsøg på at udføre vævstypebestemmelsen, endte dårlig, således at de kan anses for at være en pilottest af vores egne evner til at udføre noget ukendt, og arbejde sammen i praktiske udførelser. Det var uanset en erfaring, som vi blev klogere af, og analysering efterfølgende gik meget bedre. Der opstod dog problemer i form af afsmit, sort belæg på vores PCR-brønde. Dette førte til at BioDiagene apparaturet fik problemer med at aflæse prøverne fluorometrisk, og apparaturet opgav derfor nogle forskellige fejlmeldinger. Problemet opstod når PCR-brøndene blev mixet med vortexer, og dele af gummibelægningen på vortexeren klæbet sig på PCR-brøndene, og smeltet fast i Thermal Cycleren. Undertegnede så de sorte pletter efter en lang række fejlmeldinger ved aflæsningen, og vi kom derfor til at pudse PCR-brøndene med en kombination af linsepapir og alkoswabs, som normalt bruges til desinficering inden blodprøvetagning. I nogle tilfælde blev vi også nødt til at fjerne prøvemarkeringen, før apparaturet kunne aflæse PCR-brønden. Analyserne skulle i udgangspunktet kun udføres en gang, med det forbehold at kontrollerne var normale. En del allel bestemmelser blev dog udført flere gange pga. fejlmeldinger, som skyldes snavs på ydersiden af PCR-røret. Ligeledes blev den ene prøve fra en cøliaker der blev analyseret til negativ, genanalyseret for at krydstjekke svaret, og ud af nysgerrighed da det ikke passede med vores teori. Der blev også udført allel bestemmelse af den enkelte negative cøliakiprøve. Denne kom så ud med vævstypen HLA-DQ8, som vi så lavede igen, da det ikke passede med screeningsresultatet. Den anden gang vi udførte allel bestemmelsen fik vi en fejlmelding, som vi så genanalyserede efter vi opdagede problemet med snavs, og fik et resultat der passede med screeningsresultatet. Alle af projektgruppens medlemmer var ansvarlige for gennemførelsen af projektet. I de tilfælde at nogle var syge, var der enighed om at de der var tilstedet udførte de opgaver som skulle laves, og tog de beslutninger som var nødvendige på vegne af gruppen. Analyseresultaterne blev registreret løbende efter hver analyse, i et analyseskema designet af undertegnede. Analyseskemaerne er derfor vores rådata, og kan ses som bilag 4 og 5.

21 Implementering af HLA-DQ2 & HLA-DQ8 som undersøgelses metode for cøliaki Side 20 Databearbejdning Ved projektopstart var det meningen at vi skulle bruge et dataprogram designet til BioRun for at overføre data fra apparaturet til en computer, men dataprogrammet ville ikke fungere uden den tilhørende Cd-rom, og når vi opdagede det var Cd en allerede sendt tilbage til Thermo Fisher. Derfor benyttede vi os af et analyseskema designet for projektet. Der var et skema for screeningsundersøgelsen, og et kombineret skema for allel bestemmelsen og TGA analysen, kontrollerne kan ses i bilag 6 og 7. Registrering af vævstypebestemmelses data blev udført ved at en i projektgruppen læste analysesvaret op, en anden skrev det ind i analyseskemaet, og en tredje tjekkede at det blev skrevet korrekt. TGA-analysesvaret blev ligeledes læst op og indført i skemaet. Ved registrering af vævstypebestemmelsen noterede vi også det arkivnr. prøven fik i BioRun, således at vi kunne gå tilbage og tjekke resultatet hvis der var tvivl om analysen. Arkivnummeret blev blandt andet brugt til at dobbelttjekke den hetero- eller homozygot allelstatus. I forbindelse med en mere systematisk opstilling af analyseresultaterne har jeg benyttet mig af Microsoft Excel Den beskrivende statistik jeg har brugt er tabeller og fordeling i procent[21]. Litteratursøgning For at finde relevant litteratur til opgaven har jeg benyttet mig af PubMed som søgedatabase, og jeg har brugt følgende søgeord: coeliac disease, guidelines, prevalence, diagnosis, genetics, advances in, diabetes type, HLA, DQ2 DQ8 Søgeordene kombinerede jeg så i søgefraser, som blandt andet: coeliac disease diagnosis HLA coeliac disease diabetes type DQ2 DQ8 coeliac disease advances in DQ2 DQ8 guidelines Der skal nævnes at de engelske artikler bruger både coeliak og celiak, således at jeg har brugt begge betegnelser når jeg har søgt efter artikler. Artiklerne som jeg har brugt i opgaven er fundet vha. de overstående søgefraser og referencelister i de artikler jeg søgte mig frem til.

22 Implementering af HLA-DQ2 & HLA-DQ8 som undersøgelses metode for cøliaki Side 21 Jeg har i stor grad valgt at benytte mig af nyere artikler, artikler udgivet i løbet af de sidste 1-2 år, da der har kommet en stor mængde ny viden omkring cøliaki de sidste år, og for at forholde mig til den nyeste viden tilgængelig. Artiklerne omhandler demografiske områder som kan sammenlignes med Danmark, så som de øvrige skandinaviske lande, vesteuropæiske lande som Nederlandende og til dels USA. En af de vigtigste artikler for opgaven har været ESPGHNs guidelines for diagnosticering af cøliaki, som blev udgivet i februar 2012, som projektgruppen blev gjort opmærksom på af Bjarne Kristiansen, som har haft tilgang til artiklen under revideringsprocessen. Udover PubMed har jeg også dels benyttet søgedatabasen Google for at finde internetsider som Lægehåndbogen, Sundhedsstyrelsens hjemmeside og Statens Serum Institut. Resultat I dette afsnit vil jeg nævne de resultater som er indsamlet i løbet af projektforløbet, og som relaterer til projektets målformuleringer. Resultaterne omfatter derfor analyseresultaterne fra vævstypebestemmelsen og TGA-analysen udført på RSI, og mere abstrakte resultater som økonomiske aspekter vedrørende relevante analyser og tidsforbrug for de samme analyser. Analyseresultater Her er tabeller som beskriver analyseresultaterne for vævstype-analyserne og de tilhørende TGA-analyser. Tabel 2: Screening af cøliakipopulation Fordeling i Svar Antal procent Tabel 3: Screening af kontrolpopulation Fordeling i Svar Antal procent Positiv 34 97,1 % Positiv 5 50,0 % Negativ 1 2,9 % Negativ 5 50,0 % I tabel 2 ses, at der er en af de formodede cøliakere som blev analyseret til at være negativ for vævstyperne HLA-DQ2 og HLA-DQ8. Den efterfølgende allelbestemmelse viste at personen ikke har allel som er associeret med cøliaki. De øvrige formodede cøliakere fik positive screeningsresultat. Samtidig viser tabel 3 at halvdelen af kontrolgruppen har enten vævstypen HLA-DQ2 eller HLA-DQ8, og den andre halvdel ikke har vævstyper associeret med cøliaki.

23 Implementering af HLA-DQ2 & HLA-DQ8 som undersøgelses metode for cøliaki Side 22 Tabel 4: Haplotyper for cøliakere med positiv screening Tabel 5: Fordeling af haplotyper af kontrolpopulationen Serologisk Haplotype Antal Fordeling i procent Serologisk Haplotype Antal Fordeling i procent DQ ,4 % DQ2 4 40,0 % DQ8 2 5,9 % DQ8 1 10,0 % DQ2 & DQ8 4 11,8 % DQ2 & DQ8 0 0,0 % Negativ 5 50,0 % I tabel 4 er den ene formodede cøliaker som var negativ i screeningsundersøgelsen udeladt, for at kunne sammenligne fordelingen af vævstyperne med andre undersøgelser. Pga. at BioRun viser både HLA-DQ2, HLA-DQ8 og HLA-DQ2/ HLA- DQ8 serologiske haplotyper er de taget med i skemaet. Undersøgelsen viser at antallet af HLA-DQ2-positive cøliakere er meget større end HLA-DQ8-positive cøliakere. Tabel 5 viser at der er et overtal af HLA-DQ2-positive personer i kontrolpopulationen, i forhold til HLA-DQ8-positive. De fem som fik negative screeningssvar, fik ikke lavet en allelbestemmelse, men resultatet fra screeningen er brugt for at vise antal negative i populationen, for at give et repræsentativt mål for vævstyperne i den danske befolkning. Tabel 6: Fordeling af hetero- og homozygot status for DQB1*02 iblandt HLA-DQ2-populationen i projektet Status Antal Fordeling i procent Heterozygot 23 63,9 % Homozygot 13 36,1 % I tabel 6 ses, at lidt under 2/3 af alle HLA-DQ2-positive personer i projektet er heterozygot for allel DQB1*02, og over 1/3 er homozygot. Populationen inkluderer både formodede cøliakere og HLA-DQ2-positive i kontrolpopulationen.

24 Implementering af HLA-DQ2 & HLA-DQ8 som undersøgelses metode for cøliaki Side 23 Tabel 7: Fordelingen af TGA i cøliaki populationen Svar Antal Fordeling i procent Tabel 8: Fordelingen af TGA i kontrol populationen Svar Antal Fordeling i procent Positiv 6 17,1 % Positiv 0 0,0 % Gråsone 3 8,6 % Gråsone 0 0,0 % Negativ 26 74,3 % Negativ ,0 % Tabel 7 viser at et overtal af de formodede cøliakere var negative for TGA og et mindretal var enten positive eller i gråzonen. Derimod var alle, tabel 8, i kontrolpopulationen negative for TGA. Økonomi & tidsforbrug Herunder er tabeller som viser hvor meget relevante analyser koster og hvor lang tid det tager inden et analysesvar sendes til rekvirenten. Tabel 9: Udgifter for analyser ved RSI TGA Reagenser: kr 47 Løn og andre udgifter: kr 108 Summeret: kr 155 Vævstypebestemmelse BioRun Reagenser: ca. kr 250 Løn og andre udgifter: ca. kr 108 Summeret: ca. kr 358 Totalt: ca. kr 513 Tabel 9 er udarbejdet efter personlige kommentarer fra Afdelingsbioanalytiker Christian Simonsen ved KBA, RSI[22]. Priserne for vævstypebestemmele er ca. priser pga. at apparaturet, og derfor reagenser, ikke er tilbudt på afdelingen endnu, men forventede priser opgivet af Bjarne Kristensen[20]. Tabel 10: Udgifter for analyser ved SSI Pakke for cøliaki-antistoffer kr 3 208,00 inkl. vævstype: Tabel 10 viser prisen for analysepakken for cøliaki-antistoffer inkl. vævstypebestemmelse, oplysningerne er fundet på Statens Serum Instituts hjemmeside.

25 Implementering af HLA-DQ2 & HLA-DQ8 som undersøgelses metode for cøliaki Side 24 Tabel 11: Udgifter for biopsier Ambulant patient: 0-6 år: kr år: kr Indlagt patient: 0-16 år: kr år: kr Tabel 11 viser en oversigt over priserne for tyndtarmsbiopsier i RegionMidt. Priserne inkluderer sygehusophold, som varierer fra ambulante til indlagt patienter, og analysepris ved Patologisk Institut[23]. Tabel 12: Tidsforbrug for analyser RSI SSI Biopsi TGA analyseres en til to gange per uge Vævstyperne kan analyseres efter behov; 1-2 gange per uge Svartid for vævstypebestemmelse og serologiske prøver er op til 10 dage Ambulant prøvetagning for tyndtarms biopsi; 1 dag Svartid for biopsi ved Patologisk Institut; 6 dage (gennemsnit) Totalt: Optil 7 dage Optil 10 dage 2-19 dage, gennemsnit: 7 dage Tabel 12 er en liste over hvor lang tid det tager fra prøvemateriale modtages på afdelingen til et analysesvar er sendt til rekvirenten. Svartiden for Statens Serum Institut er opgivet på deres hjemmeside[7]. Svartiden for biopsierne er indsamlet fra Patologisk Institut, Sygehus Vendsyssel Hjørring, og er udarbejdet vha. data fra til [24]. Derudover kommer ventetiden ved sygehuset for at komme til en speciallæge der kan udføre biopsien.

26 Implementering af HLA-DQ2 & HLA-DQ8 som undersøgelses metode for cøliaki Side 25 Diskussion Herunder bliver resultatafsnittet forklaret, og diskuteret i forhold til relevant teori og artikler, for at vise hvorledes analyseresultaterne relaterer til andre studier. Priserne for analyser, og tidsforbrug for de forskellige analyser, bliver vurderet op imod hinanden, for at give et tydeligere billede, over hvor der kan blive aktuelt at spare tid og penge, og stadig afgive den mest korrekte cøliakidiagnose. Derudover diskuteres der om metoden bag projektet, og hvad der kunne være gjort anderledes. Resulter Vævstyperne HLA-DQ og HLA-DQ8 er som nævnt tidligere meget tæt associeret med cøliaki, så tæt at det at have cøliaki uden at have HLA-DQ2 og/eller HLA-DQ8 anses til at være meget usandsynligt[1,4]. Det var derfor en forundring når en formodet cøliaker blev screenet til at være negativ for HLA-DQ2 og HLA-DQ8, men på den anden side blev de resterende 97,1 % af de formodede cøliakere screenet til at være positive for vævstyperne. Et meget stort overtal af projektets cøliaki-population stemmer overens med den teori som andre undersøgelser og artikler understøtter[1]. Screeningen af kontrolpopulationen i tabel 3, kan også sammenholdes med prevalencen for cøliaki i den kaukasiske befolkning. Vores kontrolgruppe var ikke udelukkende kaukasisk, med 8 kaukasiere, en tyrker og en somalier. Ligeledes er vores kontrolgruppe kun på 10 personer, men screeningsundersøgelsen viser en tendens som passer overens med den accepterede teori, hvor % af den kaukasiske befolkning er positive for HLA-DQ2 og/eller HLA-DQ8, som understøttes af flere artikler[1,4,6,10,12]. Det formodes at de to ikke-kaukasiere ikke udgør en signifikant forskel i en kontrolgruppe på 10 mennesker, da det formodes at prevalence for cøliaki ikke er signifikant større eller mindre blandt tyrkere eller somaliere i forhold til kaukasiere. Den formodede cøliaker som blev screenet til at være negativ, blev screenet flere gange. Argumentet for at analysere en prøve mere end en gang, var ikke tvivl om analyseresultatet da kontrollerne var korrekte, men det var simpelthen så uventet at en formodet cøliaker, ikke var positiv for hverken HLA-DQ2 eller HLA-DQ8. Den samme prøve fik også udført en allelbestemmelse, ud af ren videbegærlighed og et ønske om at se hvorledes apparaturet ville give analyseresultatet for en negativ prøve. Den første

27 Implementering af HLA-DQ2 & HLA-DQ8 som undersøgelses metode for cøliaki Side 26 allelbestemmelse fik resultatet HLA-DQ8, men da det ikke stemte overens med screeningsresultatet, lavede vi den om og fik et resultat som konstaterede at prøvematerialet ikke indeholdt allel som var associeret med cøliaki. Grunden til det negative analyseresultat, kan have forskellige årsager, som diverse fejlkilder, at personen er negativ for HLA-DQ2/ HLA-DQ8, eller at personen har HLA-DQ-allel som også koder for HLA-DQ2 eller HLA-DQ8, men som BioRun ikke har primere for. Fejlkilderne bliver beskrevet nedenfor, men det kan ses som usandsynlig at det negative analyseresultat skyldes en fejlkilde da den interne kontrol, positiv kontrol og kontaminations kontrol var alle normale. Det er en mulighed at personen har HLA-DQ-allel som ikke indgår i analysen, som kan associeres med cøliaki, men med tanke på at mellem % af cøliakere har kendte HLA-DQ-allel[1] som BioRun analyserer for, anses det som usandsynlig at en ud af 35 formodede cøliakere har en HLA-DQ-allel kombination som indtil nu ikke har været associeret med cøliaki. Derfor genstår der et alternativ, at denne formodede cøliaker ikke har en serologisk haplotype som er associeret med cøliaki, og derfor ikke har cøliaki. Alle der deltog, udenom kontrolpopulationen, var formodede cøliakere, men vi havde ingen mulighed for at garantere for diagnosen, så der kan argumenteres for at en tilfældig person har deltaget i projektet for at prøve at få en tilbagemelding om sin egen vævstype eller tilfældigvis fik lyst til at deltage. Det er dog mindre sandsynligt, da alle der deltog, blev klart og tydelig informeret om at der ikke ville blive givet nogen form for tilbagemelding efter analyse. Det mest sandsynlige er at denne person er fejlagtig diagnosticeret med sygdommen cøliaki, måske på baggrund af gråzone serologiske analyser og dårlige eller fejlagtig vurderede biopsier. Som nævnt tidligere kan biopsierne være svære at få lavet gode nok, og der er flere andre sygdomme som kan give et tilsvarende histologisk billede. Til trods af en negativ screening, vurderes den totale screeningsundersøgelse til at være tilfredsstillende og dækkende efter de forventninger projektgruppen havde inden analysen af prøvematerialet. Baggrunden for dette er at de resterende formodede cøliakere, 97,1 %, blev screenet til at være positiv for HLA-DQ2 og/eller HLA-DQ8, hvor det formodede tal var 100 %. Selv om der er tale om en falsk negativ, har BioRun en sensitivitet tæt på, om ikke 100 %, og apparaturet kan fange både positive og negative analyseresultater.

28 Implementering af HLA-DQ2 & HLA-DQ8 som undersøgelses metode for cøliaki Side 27 Ved RSI benyttes TGA-analysen som et diagnostisk værktøj til at stille diagnosen cøliaki, og afdelingen analyserer TGA for en stor del af Region Midt. Det samme apparatur blev derfor benyttet til at analysere projektets deltageres TGAværdier. Som forklaret i resultatafsnittet viser tabel 7 og 8 at, alle i kontrolpopulationen og 74 % af cøliakipopulationen havde negative TGA-analyser. Kontrolpopulationen var som forventet, men at den store andel af formodede cøliakere var TGA-negative var ikke som forventet. Det har dog en simpel forklaring, da cøliakere der følger en glutenfri diæt går fri for symptomer og både serologiske og histologiske markører forsvinder med tiden. Derudover var 17 % af cøliakerne TGA-positiv og 8,6 % var i analysens gråzone. Kontrollerne som blev analyseret sammen med TGA-analyserne var også normale[bilag 6 og 7], så analyseresultaterne skal være korrekte. EMA og AGA bliver ikke udført ved RSI, men er heller ikke nødvendig ifølge ESPGHAN guidelines[1], med tanke på at TGA-analysen bliver udført. Allel- og serologisk haplotype bestemmelse er heller ikke et krav for at stille en sikker cøliaki diagnose, men det kan være et meget godt diagnostisk værktøj i de tilfælde hvor en person i en risikogruppe tjekkes for muligheden for at udvikle cøliaki. Det vil sige for eksempel en første grads slægtning af en cøliaker, en med Downs syndrom eller T1DM. Da personer tilhørende nævnte grupper (og andre grupper), har en forhøjet sandsynlighed for at udvikle cøliaki, kan det være meget interessant for en kliniker at vide om patienten i det hele taget har generne til at udvikle cøliaki, og eventuelt hvor sandsynligt det er. Et specifikt eksempel kan være en T1DM-patient, med en første grads slægtning med cøliaki. I udgangspunktet har T1DM-patienten en relativ høj sandsynlighed for at udvikle cøliaki, og en screeningsundersøgelse for vævstyperne HLA-DQ2 og HLA- DQ8 kan udføres. Er screeningen negativ er sandsynligheden for at T1DM-patienten udvikler cøliaki meget lav, kliniske symptomer der minder om cøliaki kan i først omgang tilskrives noget andet. Er screeningen positiv kan der udføres en allelbestemmelse, således at klinikeren kan vide om sandsynligheden for cøliaki er høj eller lav. Flere undersøgelser påpeger at dem med HLA-DQ2 har en højere sandsynlighed for at udvikle cøliaki end dem med HLA-