(11) DK B1 (19) DANMARK. .24.w (12) PATENTSKRIFT FIG.I. Patent- og Varemærkestyrelsen

Transkript

1 (19) DANMARK (11).24.w (12) PATENTSKRIFT Patent- og Varemærkestyrelsen (51) Int.C1 6.: C 12 N 15/44 A 61 K 39/145 C 07 K 14/11 G 01 N 33/569 G 01 N 33/577 C 07 K 14/11 C 07 K 16/10 (21) Patentansøgning nr: PA (22) Indleveringsdag: (24) Løbedag: (41) Alm. tilgængelig: (45) Patentets meddelelse bkg. den: (30) Prioritet: US US (73) Patenthaver: The Research Foundation of State University of New York, P.O. Box 9, Albany, New York 12201, USA (72) Opfinder: Timothy F. Murphy, 110 Jeffrey Drive, Amherst, New York 14120, USA Michael A. Apicella, 5551 Tonawanda Creek Road, Pendleton, New York 14120, USA (74) Fuldmægtig: Hofman-Bang A/S, Hans Bekkevolds Allå 7, 2900 Hellerup, Danmark (54) Benævnelse: Fremgangamåde til detektering af Haemophilus influenzae og vaccinepræparat indeholdende Haemophilus influenzae. (56) Fremdragne publikationer: Infection and Immunity bind 36 (1942) side (57) Sammendrag: Et plasmid som indeholder en genetisk kode for en immunogen del, som er bevaret i mange stammer af Haemophilus influenzae uden typebetegnelse og bakterien indeholdende dette plasmid. Den immunogene del er foretrukkent en epitop på et ydre membranprotein af H. influenzae. Et monoklonalt antistof mod den immunogene del og hybridomaen, som vil producere det monoklonale antistof. DNAprobe konstrueret til at svare til de nucleinsyrer, som koder for den immunogene del. Denne probe kan være mærket med en radioaktiv markør og kan anvendes som diagnostisk værktøj til at prøve forskellige kliniske prøver for tilstedeværelsen af H. influenzae. 94K- 67K- 43K- 30K - ==, 20.1K - r 11W 16,6K~ 1 4,4K - FIG.I

2 1 Fremgangsmåde til detektering af Haemophilus influenzae og vaccinepræparat indeholdende Haemophilus influenzae. Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til 5 detektering af Haemophilus influenzae i en klinisk prøve. Fremgangsmåden er ejendommelig ved det i krav i anførte. Opfindelsen angår endvidere et vaccinepræparat omfattende immunogent Haemophilus influenzae overfladeeksponeret 10 ydre membranprotein med en molekylstørrelse på dalton. Vaccinepræparatet er ejendommeligt ved det i krav 3 anførte.

3 i a Haemophilus influenza type b har længe været erkendt som et hyppigt patogen, især hos spædbørn og børn, men først fornylig er H. influenzae uden typebetegnelse blevet erkendt som et vigtigt patogen. Det er nu godt fast- 5 slået, at H. influenzae uden typebetegnelse forårsager pneumonia, bacteremia, menigitis, postpartum sepsis og akut febril tracheobronchitis hos voksne. Desuden forårsager H. influenzae uden typebetegnelse neonatal sepsis og er ofte ætiologisk agens i akut otitis media 10 hos spædbørn og børn. Betydningen af opdagelsen af en metode til afprøvning af en klinisk prøve, såsom spyt, cerebrospinalvæske, blod og andet for tilstedeværelsen af H. influenzae er derfor klar. 15 Iagttagelserne af, at H. influenzae uden typebetegnelse forårsager alvorlig infektioner i voksne og børn har stimuleret interesse for studiet af patogenese og væsentlige virulensfaktorer forbundet med denne bakterie. Ribitolkapslen af H. influenzaetype b er en virulens 20 faktor for organismen, og antistof mod kapsel beskytter værten ved hjælp af baktericide og/eller opsoniserende virkninger. Disse iagttagelser har bevirket megen efterforskning af rollen for det kapsulære polysaccharid i infektionen med H. influenzaetype b og beskyttelse mod 25 disse infektioner. H. influenzae uden typebetegnelse mangler imidlertid en polysaccharidkapsel og på lignende måde som de ydre membraner af andre gram-negative bakterier er den ydre membran af H. influenzae sammensat af ydre membranproteiner (OMPer) og lipopolysaccharider 30 (LPS). Derfor fokuserer studier af forholdet mellem virulensen af H. influenzae uden typebetegnelse og overfladeantigener på OMPer og LPS..

4 2 Analyse af OMPfer af H. influenzae uden typebetegnelse har vist, at der er markante forskellige i OMP-sammensætning inden for forskellige stammer. Se f.eks. Murphy et al, "A Subtyping System For Nontypable Haemophilus 5 influenzae Based on Outer-membrane Proteins," J. Infect. Dis, 1983, 147:838-46; Barenkamp et al, Outer Membrane Protein and Biotype Analysis of Pathogenic Nontypable Haemophilus influenzae," Infect. Immun, 1982, 36:5-40; lorb et al, "Outer Membrane Protein Composition in 10 Disease Isolates of Haemophilus influenzae, Pathogenic and Epidemiological Implications," Infect. Immun, 1980, 30: Der er tidligere blevet udviklet et undertypesystem for 15 H. influenzae uden typebetegnelse, baseret på de hoved OMP'er, der tidligere er blevet udviklet. Hvis et overfladeudsat antigen (immunogen), som er konserveret i alle stammer, kunne findes, ville det være et vigtigt værktøj til at udvikle en fremgangsmåde til at identifi- 20 cere H. influenzae i kliniske prøver såvel som en vaccine mod H. influenzae. Det tilsigtes derfor med den foreliggende opfindelse at finde et overfladeudsat antigen i både typebestemt og ikke typebestemt H. influenzae, som er bevaret i alle stammer, herunder. H. influenzae uden 25 typebetegnelse, såsom type b, der er kendt for at forårsage bakteriel menigitis. Det tilsigtes yderligere med opfindelsen at udvikle et middel til at forudsige identificeringen af sådant bevaret overfladeudsat antigen. Det tilsigtes yderligere med den foreliggende opfindelse 30 at udvikle et monoklonalt antistof mod et sådant udsat antigen. Desuden tilsigtes det med opfindelsen at udvikle et middel til at producere store mængde af sådant antigen samt at isolere og indføre den genetiske sekvens for sådant antigen i et hidtil ukendt plasmid og at for-

5 DK Bi 3 årsage expression af en sådan sekvens i en bakterie, såsom E. coli for at producere sådant antigen. 1 0 Derudover tilsigtes det med opfindelsen at konstruere en 5 DNA-probe via kombinationen af de overfladeudsatte antigen i såvel typebestemt som ikke typebestemt H. influenzae, som bevares i alle stammer, og det monoklonale antistof, som kan anvendes til diagnostisk prøve til detektering af H. influenzae. I overensstemmelse med den foreliggende opfindelse t+1- vejebringes der et plasmid indeholdende en genetisk kode for en immunogen del af Haemophilus influenzae uden typebetegnelse, hvilken immunogene del er bevaret i 15 mange stammer af H. influenzae uden typebetegnelse. Opfindelsen omfatter yderligere en bakterie, som indeholder plasmidet, og som vil forårsage expression af den genetiske sekvens, og som indeholder et monoklonalt antistof mod den immunogene del og yderligere 20 hybridomaen, som vil producere det monoklonale antistof. Den immunogene del kan være og er foretrukkent en epitop på et ydre membranprotein af H. influenzae, og den kan specifikt være og er foretrukkent et dalton ydre 25 membranprotein. DNA-sekvensen for genet udtrykkende dette dalton ydre membranprotein menes at begynde ved nucleotid 125 og fortsætter indtil nucleotid 526. Den immunogene del kan produceres i ren tilstand eller som 30 en del af et længere kædet protein. En diagnostisk prøve for detektering af H. influenzae i kliniske prøver gør brug af en DNA-probe konstrueret til at svare til de nucleinsyrer, som koder for det immunogene protein bevaret i mange stammer af H. influenzae

6 4 uden typebetegnelse. Denne probe kan være mærket, f.eks. med en radioaktiv markør. Udtrykket "Haemophilus influenzae uden typebetegnelse" 5 som anvendt heri betegner H. influenzae, som mangler en polysaccharidkapsel, og som har en ydre membran omfattende ydre membranproteiner (OMP'er), og som også omfatter lipopolysaccharider (LPS). 10 Udtrykket "Immunogen del" betyder den del, som vil resultere i et immunologisk antistofrespons i en værtsorganisme. En sådan del kan betragtes som et antigen. Udtrykket "epitop" betyder den begrænsede immunogene 15 del, som resulterer i et specifikt immunologisk respons. I overensstemmelse med den foreliggende opfindelse blev der udviklet et musemonoklonalt antistof, der genkender en epitop på et dalton ydre membranprotein (p6) 20 mod Haemophilus influenzae uden typebetegnelse. Dette epitop var tilstede på alle 115 isolater af H. influenzae, der blev afprøvet, herunder -såvel stammer med som uden typebetegnelse. Screening af 89 stammer af andre bakterier viste, at denne epitop er en yderst specifik 25 markør for H. influenzae, fordi epitopen var tilstede i praktisk taget alle andre bakteriearter, der blev afprøvet. Western blot prøver blev foretaget med to normale humane serumprøver og serum fra en voksen i rekonvalescensfasen med bacteremi ā på grund af H. influenzae uden 30 typebetegnelse. Antistof mod det dalton ydre mem- branprotein var tilstede i alle tre humane serumprøver. Prototype stammer af H. influenzae uden typebetegnelse repræsenterende de otte OMP undertyper blev opnået fra

7 5 ansøgerens egen samling. Se Murphy et al., supra. Stamme 24 blev isoleret fra spyt fra en patient med kronisk bronchitis ved Erie County Medical Center (Buffalo, NY). Dr. S. Berk (V.A. Medical Center, Mountain Home, Tenn) 5 tilvejebragte 14 stammer H. influenzae uden 10 typebetegnelse fra blod eller transtracheal aspirater. De resterende stammer af H. influenzae uden typebetegnelse var kliniske isolater fra Erie County Medical Center og Buffalo V.A. Medical Center. Dr. J. Ward (University of California at Los Angeles)_ tilvejebragte 54 stammer af H. influenzae type b. De resterende stammer af H. influenzae type b var kliniske isolater fra Buffalo Children's Hospital. Referencestam- 15 mer af andre kapsulære serotyper af H. influenzae blev opnået fra Centers for Disease Control (Atlanta). Kopier af Haemophilus paraphrophilus ATCC 29240, Haemophilus segnis ATC 10977, Haemophilus parainfluenzae ATCC og 9276, Haemophilus aegypticus ATCC 11116, Haemophilus parahemolyticus ATCC 10014, H. influenzae uden typebetegnelse ATCC 19418, Actinobacillus actinomycetemoomitans ATCC 29522, ATCC 29523, ATCC 29524, NCTC 9707 og NCTC 9710, actinobaoillus equili ATCC 19392, Actino- 25 bacillus seminis ATCC og Actinobacillus suis ATCC blev tilvejebragt af Dr. J. Zambon (School of Dentistry, State University of New York at Buffalo). Isolater af alle andre arter blev opnået fra de kliniske mikrobiologi laboratorium ved Erie County Medical 30 Center. Identiteten af stammer af H. influenzae blev bekræftet ved kolonimorphologi og vækstkrav for hæmin og nicotinamid-adenindinucleotid. Kapsulære serotyper blev bestemt

8 DK Bi 6 5 ved CIE under anvendelse af referencestammer og antiserum fra Centers for Disease Control, Murphy et al., supra. Stammer blev opbevaret i Mueller-Hinton bouillon plus 10 % glycerol ved -70 C. BALB/c mus blev immuniceret i.p. med 0,1 ml af 10 9 celler H. influenzae uden typebetegnelse stamme 24 på dag nr. 0 og 28. På dag nr. 32 efter den indledende immunisering blev udvalgte dyr slået ihjel med chloroform, 10 deres milte blev fjernet, og miltlymfocytter blev høstet ved perfusion af miltpulp med minimalt essentielt medium. For at opnå hybridomaudvikling ved fusion af donar milt- 15 celler til NS 1 (non-sekreterende variant af IgG1 BA/c plasmacytom P3XAg8) blev plasmacytomaceller (opnået fra Salk Institute of Biology [La Jolla, Calif] under National Cancer Institute contrakt NO1-CB-23886), % polyethylenglycol anvendt i en modifikation af procedu- 20 ren af Kennett, Cell Fusion, Methods Enzymol, 1979, 58: Kort fortalt blev 10 7 miltceller kombineret med 10 6 NS-1 celler i minimalt essentielt medium med serum. Cellerne blev centrifugeret ved 170 g i 10 minutter ved 25 C. Alt den overliggende væske blev fjernet, og 25 pellet blev løsnet efter slag. To tiendedele ml %'s polyethylenglycol 1000 (Sigma Chemical Co., St. Louis) i minimalt essentielt medium uden serum blev tilsat, og blandingen blev omrørt forsigtigt og efterladt ved 25 C i 8 min, hvoraf de sidste 3 min bestod af centrifugering 30 ved 500 g for at opnå en pellet af cellerne. Ved afslutningen af de 8 min blev 5 ml minimalt essentielt medium (MEM) md serum tilsat og forsigtigt pipettere en gang for at gensuspendere pellet. Blandingen blev centrifugeret ved 250 g i 5 min ved stuetemperatur (25 C) al

9 7 overliggende væske blev fjernet. 5 ml komplet minimalt essentielt medium (medium med 4,5 mg/ml glycose og 20 % fetalbovinserum) blev tilsat for at resuspendere pellet. Blandingen blev overført til en 25 ml Erlenmeyer kolbe 5 indeholdende den passende mængde komplette minimale essentielle medium til opnåelse af 3 x 10 5 plasmacytomaceller/ml. Cellerne blev forsigtigt omrørt og fordelt i 0,05 ml prøver i mikrotiter brønde timer efter polyethylenglycolfusionen blev 0,05 ml medium indeholdende 13,6 gg/ml hypoxanthin, 0,36 gg/zr1 aminopterin og 3,87 pg/ml thymidin sat til hver brønd. Mikrotiterpladerne blev anbragt i en vævskulturinkubator ved 85 %'s fugtighed i en atmosfære med 5 % CO2 og 95 % 15 luft. Frisk medium indeholdende hypoxanthin, aminopterin og thymidin blev tilsat på dag nr. 7, og pladerne blev tjekket for makroskopiske plaks efter dag nr. 10. Den overliggende væske fra alle brønde blev prøvet for tilstedeværelsen af antistof ved en Elisa-prøve. 20 Elisa-prøver blev foretaget i mikrotiterplader af polyvinyl med 96 brønde (Dynatech, Alexandria VA), 200 gl volumen blev anvendt til hvert trin. Brønde blev overtrukket med et celleovertrækningspræparat en mængde på gg/ml H. influenzae uden typebetegnelse stamme 24 fremstillet ved metoden af Johnston, "Immunobiology of Neisseriagonorrhocae", American Society for Microbiology, 1978, Plader blev inkuberet ved 37 C i 1 time efterfulgt af inkubering natten over ved 4 30 C. Brøndene blev vasket tre gange med PBS (phosphatbufret saltvand) puls 0,05 % Tween 20 R overfladeaktiv middel mellem hvert trin. Ubundne steder på plasten blev blokeret med 3 % bovinserumalbumin PBS i to timer ved 37 C. Vævskulturoverliggende væsker (eller fortyndinger af

10 DK BI 8 museascitesvæske i efterfølgende eksperimenter) indeholdende monoklonal antistof blev inkuberet i brøndene natten over ved 4 C. Kaninantistof mod muse IgG og IgMblev derpå inkuberet i 2 timer ved 37 C efterfulgt af 5 protein A-peroxidase i 2 timer ved 37 C. 200 pl substrat blev derpå sat til hver brønd. Substrat blev fremstillet ved at opløse 10 mg o-phenyllendiamin i 1 ml methanol og sætte denne opløsning til 99 ml citrat/phosphat-puffer, ph 5,0, plus 0,1 ml 3 % H202. Efter inkube- 10 ring af substratet i 45 min i mørke ved stuetemperatur blev reaktionen - standset med 50 pl 4 N H2SO4. 0D490 blev målt. Hver sæt Elisa-prøver blev foretaget med en kontrol, hvori NS-1 vævskulturoverliggende væske eller ascitesvæske blev anvendt i stedet for det monoklonale an- 15 tistof, der skulle afprøves. På basis af resultaterne af Elisa-screening blev udvalgte kloner propageret ved påfølgende overførsel til større vævskulturbrønde. Store mængder antistof blev produceret i vævskultur og ved i.p. injektion af 10 5 hydridomaceller i pristan-primed 20 BALB/c mus. Den resulterende ascitisvæske blev høstet på 3 til 4 uger og prøvet for specificitet. De stammer, der skulle afprøves, blev dyrket på en chokoladeagar (eller et andet passende medium, afhængigt af 25 arten) natten over ved 37 C i en atmosfære af 95 % luft og 5 % CO2. Celler fra en plade blev høstet ved suspension i PBS og centrifugeret ved g i 20 min. Den resulterende pellet blev suspenderet i tilstrækkelig PBS til at gøre det muligt at trække suspensionen op i en 30 mikropipette. En tiendedel ml af suspensionen af bakterier blev sat til 0,4 ml prøvepuffer (0,06 M Tris, 1,2 % SDS, 1 % 6-mercaptoethanol og 11,9 % glycerol) og opvarmet i 5 min. i et kogende vandbad. De resulterende organismer benævnes helcellepræparat.

11 9 En 10 pl dråbe helcellepræparat blev anbragt på et mikrocelluloseark (Schleicher and Schuell, Inc., Keene, NH) og fik lov at lufttørre. Arket blev derpå anbragt i 3 %'s gelatine i puffer A (0,012 M Tris og 0,15 M NaC1, 5 ph 7,4) i 1 time. Efter skylning af arket med puffer A blev det anbragt i en passende fortynding af antistof og fik lov at ryste ved stuetemperatur natten over. Arket blev skyllet med puffer A og anbragt i en 1:3000 fortynding af protein A peroxidase (Zymed Laboratories, San 10 Francisco) og rystet i 1 time ved stuetemperatur. Arket blev skyllet og neddykket i peberrodperoxidase-farveudviklingsopløsning (0,015 % H202, Bio-Rad, Richmond, Calif.) i 45 min. Kontroller afprøvet på hvert ark omfattede prøverpuffer (negativ kontrol). Et negativt re- 15 sultat blev iagttaget, når pletten ikke var forskellig fra baggrundsfarven, og et positivt resultat blev optegnet, når pletten blev purpur-blå. Ca. 90 % af pletprøverne var utvetydigt positive eller negative. De stammer, der gav tvetydige resultater i pletprøven blev un- 20 derkastet Western blot-prøvning. Fremstilling af LPS Lipopolysaccharid (LPS) blev fremstillet ud fra H. in- 25 fluenzae uden typebetegnelse stamme 24 ved to metoder. Den første metode var en modifikation af phenol/vand-extraktionsmetoden af Westphal og Jann, "bacterial Lipopolysaccharides", Methods in Carbohydrate Chemistry, 1965, 5: Den anden metode var metoden af Hitchcock 30 og Brown, Journal of Bacteriology, 1983, 154: Sidstnævnte metode gør brug af enzymet proteinase K (Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim, Vesttyskland), som hydrolyserer proteiner, men ikke har nogen virkning på LPS.

12 10 Helcelle- og LPS-præparater blev underkastet SDS-PAGE (natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese) med enten 11 % eller 13,2 % separerende geler, Murphy etal, supra. Når elektroforesen var fuldstændig, blev gelen 5 anbragt med et nitrocelluloseark, der forud var blevet kogt i destilleret vand, og arket blev neddykket i 0,3 M natriumcitrat plus 3 M NaCl. Elektroforetisk overførsel 15 blev udført i en Trans-blot R celle (Bio-Rad) ved 50 V i 90 min. Elektrodepufferen var 0,025 M Tris, ph 8,3, 10 0,192 M glycin og 20 % methanol. Nitrocellulosearket blev derpå behandlet nøjagtigt som beskrevet for pletprøven; det blev blokeret med 3 % gelatine og inkuberet sekventielt med antistof 7F3, protein A-peroxidase og substrat peberrodperoxidase-farvefremkalder. I Radiomærkning af overflade OMPer Ydre mærkning af overflade-udsatte OMPer blev udført med en lactoperoxidase-katalyseret radioioderingsprocedure, 20 Hansen et al., Infect. Immun, 1981, 32: Elisa med ydre membraner af H. influenzae uden typebetegnelse stamme 24 overtrukket på mikrotiterplader viste, at den hydridoma, der betegnes 7F3, producerede 25 antistof 7F3, der genkendte en determinant i bakteriens ydre membran. Gelimmunodiffusion indikerede, at dette antistof var af IgG3 isotypen. Fig. 1 viser en Western blot, der indikerer, at den determinant, der genkendes af antistof 7F3, var på et protein med en molekylstør- 30 relse på dalton, bane A viser molekylvægtstandarder på nitrocellulosearket, og bane B viser dalton-proteinet genkendt af antistof 7F3 i et helcellepræparat af H. influenzae uden typebetegnelse stamme 24. Specifikt viser bane A molekylvægtstandarder overført

13 11 fra en 13,2 % gel, bane B viser et helcellepræparat af H. influenzae uden typebetegnelse stamme 24 inkuberet med antistof 7F3, protein A-peroxidase og peroxidsub7 strat, og bane C er en autoradiograf af et helcellepræ- 5 parat af H. influenzae uden typebetegnelse stamme 24 fremstillet ud fra bakterier ydre mærket med Alle tre baner var fra samme gel. Western blot-prøvning foretaget ved denne metode i 25 stammer H. influenzae viste, at antistof 7F3 genkendte en determinant på dette dalton-protein i hver stamme. Fordi antistoffet genkendte en determinant på et protein med identisk molekyl.= størrelse i flere stammer, screenede ansøgerne et større antal stammer med anvendelse af en pletprøve fremfor 15 Western blot. For at bestemme hvorvidt proteinet genkendt af antistof 7F3 kunne mærkes yderligt mærkedes H. influenzae uden typebetegnelse stamme 24 med Proteinerne blev underkastet SDS-PAGE og overført til et nitrocellulose- 20 ark. En bane blev exponeret med røntgenfilm, og en bane blev inkuberet med 7F3, protein A-peroxidase conjugat og 25 substrat. Fig. 1 viser, at det bånd, der blev genkendt af antistof 7F3 (bane B) svarer til et 125 -mærket-(bane C). For yderligere at vurdere, hvorvidt den epitop, der blev genkendt af antistof 7F3, var på et protein eller på LPS, blev der foretaget to yderligere eksperimenter. En Eliza-prøve blev foretaget som beskrevet i foregående, i 30 hvilken nogle brønde blev overtrukket med et celleovertrækningspræparat af H. influenzae uden typebetegnelse stamme 24, og andre brønde blev overtrukket med LPS fremstillet ud fra H. influenzae uden typebetegnelse stamme 24 ved phenol/vand-metoden, se Westphal et al.,

14 12 supra. Antistof 7F3 var reaktivt med et celleovertrækningspræparat (OD = 0,375), der indeholdt OMPer og LPS, se Johnston et al., supra, men var ikke reaktivt med_lps (OD = 0,062). Dette resultat indikerer, at den epitop, 5 der genkendes af antistof 7F3, sidder på en OMP. Fig. 2 viser en Western blot-prøve, der afbilder et andet forsøg udført for at vurdere, hvorvidt den epitop, der genkendes af antistof 7F3, sidder på et protein el- 10 ler på LPS. De baner, der er markeret med A, indeholder LPS fremstillet ved proteinase K lyse af celler af samme 24, Hitchcock et al., J. Bacteriol, 1983, 154:269-77, de baner, der er markeret med D, indeholder LPS fra stamme 24 fremstillet ved phenol/vand-metoden, se 15 Westphal et al., supra, og de baner, der er mærket med C, indeholder et heicellepræparat af stamme 24. Alle prøver blev prøvet på samme gel og overført til samme nitrocelluloseark. Fig. 2, venstre, blev inkuberet med antistof 7F3 (ascitesvæskefortynding 1:500), og fig. 2, 20 højre, blev inkuberet med antistof 3D2 (ascitesvæskefortynding 1:500), et monoklonalt antistof, der genkendte den lipide A del af H. influenzae LPS. Antistof 7F3 binder ikke til nogle af LPS-præparaterne cg binder kun til et bånd med en molekylvægt på i helcellepræpara- 25 tet. Denne iagttagelse viser, at antistof 7F3 genkender en epitop på et protein og ikke på LPS. Specifikt viser fig. 2 en Western blot-prøve fra en 13,2 % gel: (venstre) inkubering med antistof 7F3 og (højre) 30 inkubering med antistof 3D2, som genkender en epitop på lipid A fra R. influenzae. Banerne markeret A indeholder LPS af H. influenzae uden typebetegnelse stamme 24 fremstillet ved lyse af celler med proteinase K, banerne mærket med B indeholder phenol/vand-fremstillet LPS af

15 13 stamme 24, og banerne markeret C indeholder et helcellepræparat af stamme 24. Molekylvægtstandarder er anført til højre. 5 Studier blev foretaget til bestemmelse af arterne specifikt for det antigen, der blev genkendt af antistof 7F3. Helcellepræparater er 115 isolater af H. influenzae blev studeret ved enten pletprøve eller Western blot-prøve. Stammerne omfattede 73 type b, 37 uden typebetegnelse og 10 en af hver af typerne a og c til f. Alle 115 stammer af H. influenzae indeholdt den epitop, der genkendes af antistof 7F3, hvilket indikerer, at denne epitop er et fælles antigen blandt stammer af H. influenzae isolater af forskellige bakteriearter blev studeret for at bestemme, hvorvidt denne epitop er tilstede i andre bakterier end H. influenzae. Alle disse 60 stammer manglede den determinant, der genkendes af antistof 7F3 20 (tabel 1). 25

16 14 Tabel 1 5 Specificitet af antistof 7F3 for forskellige bakteriearter Bakterie Antal afprøvet Antal positive Gram-negative 10 Escherichia coli 10 0 Actinobacillus-arter 10 0 Proteus-arter 7 0 Pseudomonas-arter Klebsiella-arter 4 0 Serratia-arter 4 0 Enterobacter cloacae 1 0 Morganella morganii 1 0 Neisseria gonorrhoeae Neisseria-arter 2 0 Gram-positive Staphylococcus aureus Staphylococcus-arter 2 0 Viridans streptococci 1 0 Streptococcus faecalis 1 0 Diphtheroider Total stammer af Haemophilus-arter forskellige fra H. influenzae blev studeret. 25 af disse isolater manglede

17 DK Bi F3 epitopen (tabel 2). 2 stammer af H. parahemolyticus indeholdt determinanten. Desuden indeholdt en stamme af H. paraphrophilus og en stamme af H. aegypticus et daltonprotein, der blev genkendt af antistof 7F3. Tabel 2 10 Specificitet af antistof 7F3 for forskellige Haemophilisarter Art Antal Antal - afprøvet positive H. parainfluenzae 24_ 0 15 H. parahemolyticus 2 2 H. paraphrophilus 1 1* H. segnis 1-0 H. aegypticus 1 1* 20 Total *1 Western blot-prøven genkendte antistof 7F3 et daltonprotein i disse stammer. Humant serumantistof Humant serum blev afprøvet for tilstedeværelsen af antistof mod dalton OMP ved Western blot-prøve. Fig 3 30 viser helcellepræparater af H. influenzae uden typebetegnelse stamme 24, der blev afprøvet på samme gel og overført til nitrocellulosepapir; bane A blev inkuberet med 7F3 ascitesvæske og viser et enkelt bånd svarende til daltonproteinet, banerne B og C blev inkuberet

18 16 med to forskellige prøver humant serum, og bane D blev inkuberet med serum opnået fra en voksen 17 dage efter bacteremia på grund af H. influenzae uden typebetegnelse. Alle tre prøver af humant serum har antistof mod dalton OMP, der indeholder den determinant, der blev genkendt af antistof 7F3. DNA-sekvensen for det gen, der udtrykker dette dalton ydre membranprotein, menes at begynde ved nucleotid 125 og fortsætter indtil nucleotid 526. Denne aminosyresekvens er inde- 10 holdt som et protein af indsatsen. Genet menes at have følgende sekvens:

19 17 (a) Z <n Ø ATG -17 Restriktionskort k -. -tg bp Aminosyre DNA-sekvens (b) cmaagtaaaatttccagctiggiviccatacttaactaaatmaaapctcatttaggagaaatcta 1 met asn lys phe val lys ser leu leu val ais gly ser val ala ala leu MC AAC AAA TTT TCA TTA TTA GT? OCA OG? TCT GTA OCT OCA TTA 68 lgg ala ala ICys ser sec aer ;tan asn asp ala. &la asn gly ala-41a gin GCG (zar!rar Acr 1r ler»c AAC GAT GCT CCA Ø :Arr Ces' ter &".? CM thr phe gly gly tyr ser val ala arg tyr asn t?iri val Act"tbrr GGc CZA TAC TCT Gibr CC? GAT Clt CAA CAA 02"T TAe AAC AOC GTA 2CICI tyr phe gly phe asp lys tyr asp ile thr,gly glu. tyr vril gln ile leu TAT 'rrr cci"rrr GAT A» TAC GAC MC AM GCr chk TAC GTT CAN MC TTA asp ala his ales, ala tyr leu asn ala thr pro ala ala lys'-val leu,val GAT GCG CAC GCA CCA TAT TTA AAT 0A ACG.CCA C1 OCT AAA GTA TTA GTA 3GICI ; glu gly asn thr asp glu arg gly thr ala leu gly GAA GGT AM; ACT MT GU CC? GGT ACA CCA GAk 1'>4 AXC ATC.GCA TTA GGA gln arg arg ala asp ala val lys gly tyr led atei gly lys gly val asp CAA CGT GCA GAT GCA crr AAA GGT TAT TTA GCA GGT AAA Ger crr CAT - 4øø ala gly lys leu gly thr val ser tyr gly glu glu lys pro ala val leu OCT AAA TTA t;gc ACA GTA irer TAC GGT GAA AAA Cr *SCA GTA TTA gly his asp glu ala ala tyr ser lys asn arg arg ala val leu ala tyr GG T CAC GAT GAA ccr CCA TAT TCT AAA AAC OZT CGT GCA GTG TTA GCG TAC SCIG ternination TAA TTCrIGGTATTTCTAATACrTGAAAAACAGGATCCATTTTTTATMGA'n;CTGTTTI`GTTTTC ATCGTTTGTAATTTAACCAATTACCTTGAAAGAATGAATTTATTCTTTTGATTCT AAAATARATGCG 6130 TrA7CAsibrAACTCATCAACACAGTCGGICGTTAGerr-ACTCCGTAGACCACCC GACTPTTAMOCGT 700 TOSTCGAAGG'rreGAATCCTTCACMCCCACrACTOTCrGATITAATTMC CAGTTOGGTTGTTACCT C.AG=TAGACrACCGGACTCYTAATTCGTCGGTCGAGAGTTCGAGCCTCICACAXCCTACCATTCT 8C10 TACCG

20 18 Det er værd at bemærke, at dette bånd er blandt de mest overvejende, der genkendes af antistof i humant serum. Specifikt viser fig. 3 en Western blot-prøve fra en 13,2 5 % gel. Alle fire baner indeholder et helcellepræparat af H. influenzae uden typebetegnelse stamme 24 fra samme gel, men hver bane blev inkuberet med sit antiserum: bane A med antistof 7F3, banerne B og C med to forskellige prøver normalt humant serum (fortynding 1:500) og bane D 10 med serum opnået 17 dage efter bacteremia på grund af H. influenzae uden typebetegnelse hos en voksen (fortynding 1:500). Inkuberingen med antiserum blev fulgt af inkubering med protein A-peroxidase og peroxidsubstrat. Pilene indikerer, at alle tre prøver med humant serum indehol- 15 der antistof mod dalton OMP, der indeholder 7F3 epitopen. Molekylstandarder er indikeret til venstre. I overensstemmelse med opfindelsen er der blevet udviklet et IgG3 musemonoklonalt antistof, der genkender en 20 epitop på et dalton OMP på overfladen af H. influenzae uden typebetegnelse. Denne epitop er tilstede i alle 115 isolater H. influenzae, der blev afprøvet, herunder stammer med og uden typebetegnelse. Screening af 60 stammer af non-haemophilus-arter viste, at epitopen 25 ikke findes i nogle af disse bakterier. Epitopen var ikke tilstede i 24 stammer af H. parainfluenzae, men var tilstede i fire til fem stammer af andre Haemophilus-arter (tabel 2). Disse arter er sædvanligvis ikke patogener i mennesker. Ud fra kliniske relevante isolater har 30 antistof 7F3 derfor en høj specificitet for H. influenzae. Dette monoklonale antistof, der genkender en epitop, der er yderst specifik for H. influenzae, kan være nyttigt

21 19 som værktøj i det kliniske mikrobiologiske laboratorium. En hurtig prøve for at bekræfte identiteten af et kliniske isolat som H. influenzae (med eller uden typebetegnelse) kunne udvikles baseret på et sådant antistof. 5 For at konstruere en DNA-probe til at finde denne specifikke epitop bestemmes DNA-sekvensen for det gen, der indkoder p6. Baseret på DNA-sekvensen kan aminosyresekvensen for det aktive p6 protein afledes. Denne information kan anvendes til at foretage hvad der er kendt 10 som epitopkortlægning. Epitopkortlægning involverer konstruktionen af et antal små peptider og afprøvning af disse peptider for reaktivitet med monoklonalt antistof 7F3. Da den epitop, der 15 genkendes af 7F3, er specifik for H. influenzae, repræsenterer det tilsvarende peptid, der genkendes af dette antistof, den specifikke determinant på H. influenzae. Når først aminosyresekvensen for peptidet er kendt, kan DNA-sekvensen for dette segment afledes. Da H. influen- 20 zae indeholder det gen, som koder for dette epitop, er bakterien kendt som indeholdende DNA, som har en sekvens svarende til denne sekvens. En DNA-probe kan derfor konstrueres til at svare til de nucleinsyrer, som koder for den specifikke epitop på p6. Når først proben er kon- 25 strueret, kan den mærkes, f.eks. radioaktivt. Denne probe kunne derpå anvendes til at prøve en klinisk prøve, såsom spyt, cerebrospinalvæske, blod og andet for tilstedeværelsen af H. influenzae. Dette vil være muligt, fordi DNA-proben vil binde til dens 30 komplementære basepar, som er tilstede i genomen for H. influenzae. Når denne probe er konstrueret, ville denne tilnærmelse repræsentere en fordel frem for de for tiden almindeligt anvendte metoder til at vise vækstkrav for hæmin og nicotinamid-adenindenucleotid. En prøve med et

22 20 specifikt monoklonalt antistof ville give resultater 24 timer senere. OMPer og LPS er nært associerede på de ydre membraner af 5 gram-negative bakterier. Denne kendsgerning og den iagttagelse, at den determinant, der genkendes af antistof 7F3, ligger i molekylvægtsområdet, hvor LPS spaltes, fører en til at spørge, hvorvidt denne determinant sidder på et protein eller på LPS. Flere ting indikerer, at den 10 epitop, der genkendes af antistof 7F3, er på et protein. Først farvning med Coomasie blåt af SDS-geler viste tilstedeværelsen af et bånd genkendt af antistof 7F3 ved dalton i alle stammer af H. influenzae. Fordi Coomasie blåt farve protein, men ikke LPS, er denne 15 iagttagelse sandsynligt bevis for, at antistof 7F3 genkender en proteindeterminant. Dernæst var konfigurationen af båndet på SDS-PAGE og Western blot typisk for protein; LPS viste flere bånd, der var generelt mindre distinkte end det bånd, ved hvilket antistof 7F3 epito- 20 pen ligger. Dette punkt er yderligere bestyrket af den iagttagelse, at monoklonale antistoffer, der genkender LPS-determinanter udviste det typiske "LPS" mønster i Western blot-prøver af helcellepræparater i modsætning til det veldefinerede enkelte bånd, der genkendes af an- 25 tistof 7F3. For det tredie udviste antistof 7F3 ved Elisa reaktivitet med celleindhyldningspræparater, der indeholder OMPer plus LPS, men antistoffet udviste ingen reaktivitet med isoleret LPS. Endelig genkendte antistof 7F3 i Western blot-prøven (fig. 2) et bånd i et helcel- 30 lepræparat, men genkendte ikke determinanter på LPS, der var fremstillet ved anvendelse af to forskellige metoder. Samlet kan det siges, at disse iagttagelser indikerer, at den epitop, der genkendes af antistof 7F3, befinder sig på et OMP.

23 21 For at bestemme, hvorvidt OMP indeholdende antistoffet 7F3 epitopen var overfladeudsat, blev OMPer mærket ved anvendelse af en lactoperoxidase-katalyseret radioioderingsprocedure, se Hansen et al., supra. Fig. 1 viser, 5 at det protein, der indeholder antistof 7F3 epitopen, er radiomærket. Denne iagttagelse give formodning om, at dalton OMP er overfladeudsat. I den foreliggende opfindelse betyder "overfladeudsat" og "ydre membran" tilgængelig for antistofbinding. 10 OMPerne af H. influezae uden typebetegnelse udviser væsentlig variation fra stamme til stamme som vist ved SDS-PAGE analyse. Denne variation i hoved-omperne i til daltonområdet er basis for undertypeop- 15 delingssystemet for H. influenzae uden typebetegnelse, se Murphy et al., supra. Det er af interesse, at studier af OMPer af H. influezae fra tre laboratorier uafhængigt har bemærket tilstedeværelsen af et "16600"-dalton OMP i alle stammer af H. influenzae, der blev undersøgt, se 20 Murphy et al., Sarenkamp et al., og Loeb et al., supra. Det er dette protein, der indeholder den antigene determinant, der genkendes af antistof 7F3. De nu udførte studier indikerer, at den epitop, der genkendes af antistof 7F3 på dette OMP med lav molekylvægt er et antigen 25 fælles for alle stammer af H. influenzae. Identificering af fælles overfladeantigener blandt stammer er et nyttigt træk ud fra det synspunkt, at man kan fremstille vaccine, fordi immunisering med et enkelt fælles antigen kan give beskyttelse mod sygdom på grund af mange stam- 30 mer. Desuden har den iagttagelse, at dette daltonprotein varierede langt mindre end andre OMPer i løbet af tiden, fører til tanken om, at dette protein tjener en vigtig funktion for bakterien, og at dets funktion er nært beslægtet med bevaring af dets struktur.

24 22 De ydre membraner af gram-negative bakterier er immunologisk vigtige strukturer på grund af deres tilgængelighed for værtsforsvarsmekanismer. Antistof mod OMPer fra H. influenzae type b er faktisk i høj grad overvejende i 5 voksne og detekteres i serum fra spædbørn, som er rekonvalescenter fra infektioner med H. influenzae. Det er nu blevet vist, at antistof mod et dalton OMP (p6) er tilstede i humant serum (fig. 3). Tilstedeværelsen af antistof mod dette OMP i normal humant serum antyder, at 10 OMP er vigtig med hensyn til det humane antistofrespons mod H. influenzae. 15 Adskillige iagttagelser tyder på, at p6 er et vigtigt mål i immunitet mod Haemophilus influenzae: 1) Antistof dannet ud fra p6 isoleret fra en type b stamme beskytter i en rotteungemodel. 2) Et monoklonalt antistof, 7F3, rettet mod p6 blokerer 20 human baktericidaktivitet mod Haemophilus influenzae (NtHi). 3) Opbrug af normal human sera af p6 ved affinitetskromatografi resulterede i reduceret baktericidaktivitet af 25 sera for Haemophilus influenzae. 4) Immunorenset antistof mod p6 fra humant sera' var baktericidt. 30 Den foreliggende opfindelse omfatter derfor den molekylære kloning af p6 under anvendelse af H. influenzae som kilde for bakteriel kromosomal DNA, lambda gtll bacteriophag som vektoren i konstruktion af det genome bibliotek, puc18 plasmid som vektoren anvendt i subkloning

25 23 af genet for at lette sekvensering og E. coli som værtsstammerne. Resultaterne tillader yderligere analyse af den molekylære basis for såvel eksperimentel som human immunitet mod p6 og tillader produktion af store mængder 5 p6, når det en gang er blevet godkendt til anvendelse i vaccine Haemophilus influenzae. Molekylar kloning af p6: daltonproteinet, der heri betegnes p6, er derfor tilstede i de ydre membraner af såvel typebestemt som ikke typebestemte stammer af Haemophilus influenzae og kan være et vigtigt mål i immunitet mod Haemophilus influenzae. DNA-sekvensen for det gen, der udtrykker dette dalton ydre membranprotein, menes at begynde ved nucleotid 125 og fortsætter indtil nucleotid 526. I overensstemmelse med opfindelsen klones p6 molekylært under anvendelse af en stamme af Haemophilus influenzae uden typebetegnelse som kilde for bakteriel kromosomal 20 DNA, lambda gtll bakteriophag som vektoren i konstruktion af det genome bibliotek, puc 18 plasmid som vektoren i underkloning af genet for at lette sekvensering og E. coli som værtsstammen. De monoklonale antistoffer, der tidligere er diskuteret, og et polyklonalt antiserum 25 blev anvendt til at screene for expression af p6. En del af genombiblioteket blev screenet, hvilket resulterede i opdagelsen af fire positiver rekombinanter. En, klon 0, synes at producere et genprodukt med fuld længde udtrykt med høj frekvens. DNA-indsatsen i denne klon blev an- 30 vendt til at subklone genet i en plasmidvektor. En E. coli transformant, 7-9B, synes også at udtrykke en fuldlængdet genprodukt. Det er sandsynligt, at transkription initieres fra den faktiske promotor for p6-genet, da både klon 0 og transformant 7-9B udtrykker genproduktet i

26 DK Bi 24 både uinduceret og induceret tilstand. Isolering og sekvensering af genet for p6 tillader yderligere analyse af molekylbasis for såvel eksperimentel som human immunitet mod p6. 5 Mere specifikt blev rekombinant DNA teknologi anvendt til at klone genet for dalton-overfladeproteinet, p6, af Haemophilus influenzae uden typebetegnelse (NtHi) i Escherichia coli. Kromosomal DNA fra et klinisk isolat 10 blev klippet, ligeret til lambda gtll arme og pakket i pfaghoveder. Fire rekombinante phager blev detekteret - ved screening med monoklonale antistoffer og et polyklonalt antiserum. En klon 0 blev begrænset med EcoR1 og ligeret til plasmidvektor puc18 for at lette sekvense- 15 ring. E. coli bærende rekombinante plasmider blev screenet resulterende i en positiv, 7-9B. Både klon 0 og 7-9B producerer et protein med en tilsyneladende molekylvægt på eller i nærheden af molekylvægten for nativ p6 som bestemt ved Western blot-analyser. Ved screening blev 20 det bestemt, at transkription og translation af Haemophilus influenzae p6 genet eller generne ikke var afhængige af lac-operatoren og promotoren for hver vektor. Under anvendelse af immunofluorescens kunne det rekombinante genprodukts p6 epitoper lokaliseres på overfladen 25 af E. coli tilgængelige for antistof. 30 Haemophilus influenzae stamme 1479 blev dyrket ved 37 C i hjerne-hjerteinfusionsbouillon suppleret med 10 ug/ml hæm og 10 ug/m1 nicotinamid-adenindinucleotid. E. coli stamme y1090 (r-m+) blev anvendt til den lytiske vækst af bacteriophag lambda gtll og stamme JM83 som værten for plasmidet puc18. E. coli stammer blev dyrket i L-bouillon (LB) eller på LB-agar med eller uden 50

27 DK Bi 25 pg/m1 ampicillin, afhængigt af værtsstammen. En mere detajleret beskrivelse til anvendelse af de respektive værtsstammer findes andet steds. Young et al., Science 222: , Mersing Rec. DNA Tech. Bull. 2: En pellet af Haemophilus influenzae 1479 celler fra en 750 ml kultur blev resuspenderet i 10 ml 10 mm HEPES puffer, ph 7,4. Til denne blanding blev der sat EDTA til en koncentration på 5 mm og SDS til en koncentration på 10 0,5 % efter vægt/volumen og derpå inkuberet ved 60 C i 30 min. Dette lysat blev derpå nedbrudt med 0,5 ml pronase (10 mg/ml) ved 37 C i 2 timer og derpå underkastet 2 phenol/ciaa-extraktioner efterfulgt af en CIAA-extraktion. Natriumchlorid blev tilsat til en koncentration på 15 0,2 M til den vandige fase, og DNA blev udfældet med 2,5 volumen afkølet ethanol. Efter udfældning koldt blev DNA pelleteret ved centrifugering, resuspenderet i tris- EDTA-puffer og behandlet med DNase-fri RNase ved en koncentration på 0,1 mg/ml og 37 C i 1 time. Endelig blev 20 DNA extraheret med phenol/ciaa, udfældet med natriumchlorid og ethanol og pelleteret ved centrifugering. DNA blev resuspenderet i tris-edta-puffer, målt for koncentration ved A260/A280 og opbevaret ved 4 C. 25 Phagbiblioteket blev screenet med monoklonalt antistof 7F3. Ved screeningen blev endvidere anvendt kaninpolyklonalt antiserum produceret ved immunisering med solubiliserede p6 præparater af Haemophilus influenzae stamme

28 DK Bi Konstruktion af Haemophilus influenzae 1479 genombibliotek Måden til konstruktion af biblioteket, der er skitseret 5 i fig. 4, var i alt væsentligt som beskrevet af Young og Davis, 1985, bind 7, pp 29-41, Genetic Engineering, Plenum Press, N.Y. Haemophilus influenzae 1479 DNA blev klippet ved lydbehandling i en periode på 10 sek. (udgangskontrol indstilling ved 2) til en gennemsnitslængde 10 på 2-4 kilobase par (kb). Klipningsgraden blev vist ved agarosegelelektroforese. EcoRl-stederne i 50 lig af denne klippede DNA blev methyleret under anvendelse af EcoRl methylase. Enderne af den methylerede DNA blev gjort lige ved tilsætning af Klenow-polymerase og deoxynucleo- 1 tid-triphosphater. Efter denne reaktion og tilsætningen af natriumacetat til en koncentration på 0,3 M blev DNA udfældet. Efter centrifugering blev pellet resuspenderet i tris-edta-puffer. DNA blev derpå ligeret til EcoR1 linkere (Bethesda Research Laboratories, Bethesda, 20 Maryland), der var blevet phosphoryleret. Ligeringsreaktionen blev afsluttet ved opvarmning af blandingen til 70 C, og derpå blev overskud af EcoR1 linkere nedbrudt under anvendelse af et overskud af EcoRl. Den methylerede Haemophilus influenzae 1479 DNA blunt end-ligeret til 25 EcoR1 linkere blev renset fra overskud af linkere ved passage over en gelfiltreringskolonne (Biogel p60, BIO RAD laboratories, Richmond, CA) under anvendelse af en kolonnepuffer indeholdende 10 mm tris ph 7,5, 100 mm Vadi, i mm EDTA. Fraktioner blev vist ved A280 og agaro- 30 segelelektroforese. Fraktioner indeholdende DNA med ønsket størrelsesområdet blev samlet og udfældet. DNA blev pelleteret ved centrifugering og resuspenderet i 4 ul tris-edta-puffer. DNA blev ligeret til 3 ug dephosphorylerede lambda gtll arme (STRATAGENE Cloning systems, San 26

29 DK Bi 27 Dieto, CA) i et totalt reaktionsvolumen på 10 ul. Ligeringsblandingen blev pakket under anvendelse af to pakningsextrakter ifølge de retningslinier, der er givet af fabrikanten (Gigapack TM, STRATAGENE Cloning Systems). 5 Pakket phag blev pladeudbredt på E. coli stamme y1090 for at bestemme titeren af plakdannende enheder og for at bestemme den ikke-rekombinante baggrund ved vækst med IPTG og X-gal på LB + AMP flader. Biblioteket indeholder ca. 1,5 x 10 6 uafhængige rekombinante kloner med en bag- 10 grund på mindre end eller lig med 5 %. Screening af biblioteket Fig. 5 viser metoder anvendt ved screening. En portion 15 af y1090 plademateriale, 0,2 ml af en y1090 pellet resuspenderet i 10 mm MgSO4 blev inficeret med 1,5 x 10 3 pfu af lambda gtll biblioteket for hver 85 mm plade. Efter adsorptionsinkuberingen blev cellerne blandet med LB-agarosepuffer, udhældt og fordelt jævnt på en LB + 20 AMP plade. Pladerne blev derpå inkuberet ved 42 C i 3 timer. Hver plade blev dernæst overlagt med en tør nitrocellulosefilterskive, som forud var blevet mættet i 10 mm IPTG. Pladerne blev derpå inkuberet i 3 timer ved 37 C. Før fjernelse af filtrene blev orienteringen mar- 25 keret og filtrene og de respektive plader blev mærket. Filtrene blev skyllet kort med puffer A (0,01 M tris, 0,15 M NaC1, ph 7,4) og anbragt i 3 %'s gelatine i puffer A i 1 time. Efter skylning af filtrene endnu engang med puffer A blev de inkuberet i en screeningsblanding 30 af antistoffer natten over ved stuetemperatur. Screeningsblandingen var puffer A indeholdende 7F3 ascitesvæske med titere på 1:1000. Det anvendte monoklonale antistof delte ingen krydsreaktivitet med E. coli værtsstammerne, mens anti-1808 antiserum krævede en

30 28 arbejdsopløsning på 1:10000 for at opretholde følsomhed og specificitet. Filtrene blev skyllet med puffer A og anbragt i en 1:3000 fortynding af protein A-peroxidasekonjugat og rystet i 1 time ved stuetemperatur. Filtrene 5 blev igen skyllet med puffer A, dernæst neddykket i peberrodperoxidase-farvefremkalderopløsning (0,15 % H202, BIO RAD, Richmond, CA) i 45 min. Plaks, der syntes positive, blev fjernet fra deres respektive plader, resuspenderet i 500 ul SM-puffer og rescreenet. Plaks, der 10 var positive i rescreeningen, blev derpå igen rescreenet, men mod de individuelle antistoffer fremfor scresningsblandingen. Western blot-analyse 15 Haemophilus influenzae kontrol y1090 rekombinanter og molekylvægtsstandarderne blev fremstillet ved opvarmning ved 100 C i 5 min i en prøvepuffer indeholdende 0,06 M tris, ph 6,8, 1,2 % SDS, 5 % 8-mercaptoethanol, 11,9 % 20 glycerol og 0,003 % bromphenolblåt. Præparatet blev underkastet SDS-PAGE på en 15 %'s adskillende gel. Geler blev anbragt på et nitrocelluloseark, som forud var blevet kogt i destilleret vand og neddykket i en 0,3 M natriumnitrat, 3 M NaC1 opløsning. Elektroforetisk over- 25 førsel blev foretaget under anvendelse af en Transphor R elektroforeseenhed (Hoefer Scientific Instruments, San Francisco, CA) ved 50 volt i 90 min i en puffer af 0,025 M tris, ph 8,3, 0,192 M glycin og 20 % methanol. Blokeringen med påfølgende additioner af antistof, konjugat 30 og substratudvikling blev foretaget på samme måde som beskrevet for plakscreening.

31 DK Bi 29 Subkloning i en plasmidvektor Der blev udtænkt en strategi for at lette sekvensering. DNA-indsatsen (som består af 867 rester) af en rekombi- 5 nant phag udtrykkende p6 epitoper (som bestemt ved screening) blev subklonet ind i en plasmidvektor. puc18 blev valgt som plasmidvektoren for subkloning af flere grunde, herunder et middel for selektion, en inducerbar promotor og et EcoRl-restriktionssted, træk, der deles 10 af phagkloningsvektoren lambda gtll. DNA af en rekombinant phag blev begrænset med EcoR1 og derpå ligeret til puc18, som var blevet begrænset med EcoR1 og dephosphoryleret under anvendelse af kalvenyre-alkalisk phosphatase. Ligeringsblandingen blev anvendt til at transfor- 15 mere E. coli stamme JM 83. Transformanter blev udvalgt ved vækst på LB + AMP plader overlagt med IPTG og X-gal. Hvide koloniei', der mentes at repræsentere JM 83 indeholdende et plasmid plus indsats, blev individuelt udtaget og overført til brønde i mikrotiterplader indehol- 20 dende L-bouillon + AMP + 10 % glycerol. Pladerne blev inkuberet natten over ved 37 C. En kam blev anvendt til at inokulere fra mikrotiterpladerne på nitrocelluloseark, tidligere neddykket i IPTG, der lå over LB + AMP plader. Pladerne blev inkuberet natten over ved 37 C, 25 og derpå blev nitrocellulosearkene fjernet. Nitrocellulosen blev ophængt i 15 min i et kammer indeholdende chloroformdampe for at lysere kolonierne, blokeret i 3 % gelatine indeholdende 40 ug/ml lysozym og screenet på samme måde som genombiblioteket. 30

32 30 Resultater 5 Screenin af enombiblioteket o karakteriserin rekombinanter Ca plaks blev screenet, idet resten af det udfyldte bibliotek blev frosset i alikvoter ved -70 C i 7 % DMSO. Fire reaktive kloner betegnet lambda gtll - Haemophilus influenzae 1479 kloner 0, P, 8 og 10 blev 10 fundet. Man koncentrerede sig om kloner 0 og P, da de synes at udtrykke genprodukter, der forekommer i større mængde end 8 eller 10 og/eller i højere grad ligner det native protein p6 i formen. 15 Plader indeholdende kloner 0 og P blev forsigtigt skrabet af for at høste protein til Western blot-analyse. Western blot viser, at begge klonerne 0 og P producerer et protein, der er af samme eller lignende størrelse som nativt p6. Imidlertid producerer klon 0 proteinet i 20 større mængder sammenlignet med klon P. Derfor blev klon 0 udvalgt som den rekombinante phag som kilde for DNA til at subklone i en plasmidvektor. Subkloning i en plasmidvektor og karakterisering af 25 transformanten Tusind transformanter fra samme transformation blev screenet, før en, 7-9b, blev fundet positiv. For at sikre, at 7-9b var i ren kultur, blev positive kolonier op- 30 samlet, gennemgået og rescreenet. Western blot af 7-9b dyrkes på plader og i bouillon viser, at denne rekombinant også producerer et genprodukt, der er af en tilsyneladende molekylvægt lig med eller lignende molekylvægten for native p6. Det rekombinante plasmid isoleret fra

33 31 7-9b blev begrænset under anvendelse af EcoR1 og underkastet agarosegelelektroforese til bestemmelse af indsatsstørrelsen. Restriktionsanalyse, fig. 7, afslører tilstedeværelsen af en 2,5 kb DNA-indsats indeholdende 5 p6-genet. Diskussion Ved anvendelse af molekylar kloningsteknik blev der så- 10 ledes fremstillet såvel rekombinante phager som kombinant plasmid indeholdende genet kodende for Haemophilus influenzae 1479 p6, et 1,6 K dalton ydre membranprotein. Proteinet kan beskrives af nucleinsyresekvensen mellem nucleinsyre 125 og nucleinsyre 526, inklusive. Udtryk- 15 kelse af genproduktet ved phag klon 0 og ved rekombinant plasmid 7-9b er uafhængig af indføring af B-galactosidasepromotoren. Denne iagttagelse koblet med Western blotanalyse afslørende tilsyneladende ingen forskel i elektroforetiske mobiliteter mellem genprodukterne fra klon 20 0 og rekombinant 7-9b giver sandsynlighed for, at det rekombinante genprodukt initieres fra sin egen, p6 genets, konstitutive promotor. Epitoper af 16,6 K daltonproteinet er tilgængelige for 25 monoklonalt antistof 7F3 på overfladen af E. coli transformant 7-9b. Samlende kan det siges, at det gen, som koder for p6, blev klonet ind i E. coli under anvendelse af en phag- 30 vektor og plasmidvektor. E. coli rekombinanterne udtrykker proteinet på overfladen på en form, som er fuldt immunogen.

34 32 Med mindre andet er angivet er alle mikrobiologiske stammer almindeligt tilgængelige. Alle sådanne stammer som beskrevet heri er tilgængelige fra Dr. Timothy Murphy, Division of Infectious Diseases, State 5 University of New York Clinical Center, 462 Grider Street, Buffalo, NY H. influenzae stamme 24 og 1479, E. coli stamme JM83 indeholdende plasmid 7-9b og hybridoma 7F3 er deponeret i American Type Culture Collection (ATCC), Parklawn Drive, Rockville, 10 Maryland i overensstemmelse med Budapest-traktaten