Kapitel 2 Intro. 2.1 og 2.2) Lysmikroskopi (s. 26) 2.2 og 4.7) Gram-farvning (s. 27 og s. 84)

Transkript

1 Kapitel 2 Intr 2.1 g 2.2) Lysmikrskpi (s. 26) Reslutinen (evnen til at skelne mellem t nærliggende bjekter sm separate) er afgørende fr, hvad man kan se med lysmikrskp g ikke frstørrelsen Lysmikrskp-reslutin er 0,2 um Lysmikrskp, der bruger synligt lys, findes i flere typer: Lysfeltmikrskpi: her ses frskelle i absrptin, bjekter visualiseres grundet kntrastfrskelle (densitet), der eksisterer mellem dem g det mgivende medium. Bakterieceller er svære at se i lysfeltmikrskpi grundet manglende kntrast med mgivende medium (farvestffer kan dg bruges til at farve cellerne, hvrmed kntrasten øges, men dg dræbes cellerne) Fase-kntrast mikrskpi: her ses frskelle i brydningsindex g bruges, når levende ufarvede bakterier skal undersøges, fx fr egentbevægelighed. Mørkfeltmikrpskp: lysmikrskp, hvr lys når bjektet fra siderne kun. Det eneste lys, der når linsen, er spredt af bjektet, hvrfr man ser bjektet lys på en mørk baggrund Neddypning i lie øger lysintensiteten af linsen 2.2 g 4.7) Gram-farvning (s. 27 g s. 84) Krystal-vilet-id-kmpleks: bakterierne ptager farven Affarvning med ethanl: gram-psitive behlder farven grundet deres tykke peptidglykan-lag, der dehydreres med alkhl, så prerne i væggen lukker g indkapsler farvekmplekset i bakterien. Gram-negative med deres meget tynde peptidglykan-lag affarves ved, at ethanlen trænger ind igennem den lipidrige ydre membran g ekstraherer farvekmplekset ud af cellen. Farvning af gram-negative: med fx safranin Gram-psitive: vilette/blå Bacillus, Clstridium, Carynebakterium diphteriae, Lactbacillus, Staphylcccus aureus/epidermidis, Streptcccus Gram-negativ: røde E. Cli, Pseudmnas aeruginsa, Salmnella, Vibri chlerae manan.dk Side 1 af 28

2 Kapitel 4 Cellestrukturer 4.5) Transprtsystemer (s. 75) Der findes mindst 3 transprtsystemer i bakterier: simpel transprt, gruppe translkatin g ABCsystemet. 3 transprtudfald: Uniprt: prteiner, der transprterer et mlekyle envejs gennem membranen Symprter: prteiner der transprterer et mlekyle med anden substans, typisk prtn Antiprter: prteiner, der transprterer t mlekyler gennem membranen i hver deres retning Simpel transprt: fx Lac Permease hs Escherichia Cli Simpel-transprteren, Lac permease, er en symprter, der transprterer laktse ind i E. Cli. Energifrbrug gennem prtn-drivkraft med ctransprt af prtn til cytplasma (psitiv ladning uden fr membran g negativ i cytplasma) Gruppe-translkatin: fx Phsphtransferase systemet Glukse, mannse g fruktse mdificeres ved phsphrylatin ved transprt med phsphtransferase systemet i E. cli. Periplasmisk-bindeprteiner g ABC-system I gram-negative bakterier: Periplasmisk-bindeprteiner: transprtprteiner i periplasma ABC-transprt system: transprtsystem bestående af periplasmisk bindeprteiner kblet med en membrantransprter g ATP-hydrlyserende prtein. De har høj substrataffinitet I gram-psitive bakterier: ABC-transprt systemet: ingen periplasmisk bindeprteiner g i stedet specifik substratbindeprteiner bundet til det ydre lag af cytplasmamembranen Prtein-eksprt Transprt af stre mlekyler sm fx prteiner hs bakterier fregår vha. prteiner kaldet translcaser. Sec-systemet: (sec fra secretry=sekretin) et væsentligt translcase Prtein-eksprt er essentiel, idet mange bakterielle enzymer virker uden fr cellen, exenzymer, fx amylase eller cellulase der spalter hhv. stivelse eller cellulse til glukse, uden fr cellen 4.6) Cellevægge hs bakterier (s. 78) Cellevægges funktin: giver frm g stivhed til bakterier frhindrer lysis, ødelæggelsen af cellemembran grundet det smtiske tryk inde i cellen fra den høje kncentratin af pløste stffer i cellen. manan.dk Side 2 af 28

3 Peptidglycan Bakteriers cellevæg er peptidglycan (hs gram-negative er der ekstra lag) Peptidglycan: plysakkarid bestående af t sukkerderivater, N-acetylglucsamine g N- acetylmuraminsyre g ngle aminsyrer, fx L-alanin, D-alanin. Bestandsdelene frbinder sig til en gentagende struktur, glycan-tetrapeptid. Cellevægge hs gram-psitive bakterier 90% af cellevæggen består af flere lag peptidglykan Mange gram-psitive har teichinsyre indlejret i cellevæggen, der grundet dens negative ladning er delvis ansvarlig fr celleverfladens negative ladning (ngle teichinsyrer er kvalent bundet til membranlipidet, hvrfr de kaldes lipteichinsyrer) Lyszyme g prtplast Enzymet, lyszyme kan ødelægge peptidglykan ved at bryde ϐ-1,4-glyksidbindingen mellem N- acetylglucsamin g N-acetylmuraminsyre, hvrved vand kan trænge igennem g lysere cellen Prtplast: en bakterie, der har mistet dens cellevæg uden at lysere (under istniske frhld hvr lyszyme bruges til at nedbryde peptidglykanlaget uden at vand trænger igennem til cellen) Ngle prtplaster kan verleve i naturen, fx mycplasmas (gruppe patgene bakterier), frdi de enten har en ualmindelig stærk cytplasmamembran eller lever i smtisk beskyttet miljø. 4.7) Gram-negatives ydre membran (s. 82) 10% af cellevæggen består af peptidglykan Resten er lipplysakkarid-lag (LPS), der er et ekstra dbbelt lipidlag, der udver phsphlipid g prteiner gså indehlder plysakkarid. Plysakkarid-delen består af: cre(=kerne) plysakkarid g O-plysakkarid Lipid-delen af LPS, kaldes lipid A LPS erstatter det meste af phsphlipiderne i den ydre halvdel af den ydre membran, mens strukturen af den indre halvdel minder mere m den cytplasmatiske membran, dg indehlder den stadig lidt lipprtein manan.dk Side 3 af 28

4 Endtxiner Den ydre membran er tksisk/giftig fr dyr, g de tksiske egenskaber stammer fra lipid A Endtxin: refererer til denne tksiske del af LPS, dvs. lipid A Priner Mdsat plasmamembranen, er den ydre membran hs gram-negative, gennemtrængelig fr små mlekyler grundet tilstedeværelsen af prteinerne, priner, men er dg ikke gennemtrængelig fr enzymer eller andre stre mlekyler Priner fungerer sm kanal fr ind- g udgang fr hydrfile, lav-mlekylære stffer Ikke-specifikke priner: vandfyldte kanaler, hvrigennem ethvert lille stf kan passere Specifikke priner: indehlder et bindingssted fr strukturrelaterede stffer Periplasma Periplasma: mrådet mellem den ydre membran g plasmamembranen, hvr der er flere typer prteiner, der hldes tilbage af den ydre membran. De fleste af disse prteiner kmmer til periplasmaet via Sec-prtein-eksprt-systemet. 4.9) Celleverfladelag (s. 86) Mange prkaryte rganismer udskiller slimet materiale på deres celleverflade, der består af plysakkarid/prtein. De kaldes kapsler g slim-lag g har til funktin at hjælpe til at binde mikrrganismerne til faste verflader, fx verfladen af værtvæv. Kapsler: hvis materialet er tykt g bundet sikkert til cellevæggen Slim-lag: hvis materialet er mere let-frmet g er bundet mere løs til cellevæggen Fimbriae g Pili (ental: pilus) De er trådfrmede strukturer af prtein, der strækker ud fra verfladen af celler Fimbriae: gør det muligt at klæbe ved verflader, fx dyrevæv, fx hs Salmnella Pilus: ligesm fimbriae men er længere g kan være receptr fr bestemte vira 4.12) Endsprer (s. 91) Ngle bakterier prducerer strukturer kaldet endsprer gennem sprulatin-prcessen. Endsprer virker sm en verlevelsesstruktur i hårde tider, fx ved høje temperaturer, tørke eller næringsmangel. Bacillus g Clstridium er de bedst studerede endspre-frmerende bakterier Evnen til at prducere endsprer er kun fundet hs en bestemt slægt af grampsitive bakterier Endspre-frmering Sprulatin finder sted, når cellen er stppet med vækst, når fx et essentielt næringsstf sm carbn er begrænset manan.dk Side 4 af 28

5 Endsprer kan relativt hurtigt vende tilbage til en vegetativ celle igen g prcessen består af tre trin: Aktivering: at varme nylig frmede endsprer i få minutter Spiring: ved tilstedeværelse af specifikke næringsstffer (bestemte aminsyrer, fx alanin) Udvækst: synlig svulmen grundet vandindtagelse g syntese af ny RNA, prtein g DNA, g cellen begynder nu med vegetativ vækst igen Spre-struktur Endsprer er strukturmæssigt mere kmplekse end vegetative celler Yderste lag er exsprium, tyndt prtein lag, hvrunder er sprekappen med flere lag sprespecifikke prteiner, hvrunder er crtex (bark) med løstsiddende peptidglykan, g inden i crtex er kernen med kernevæg, plasmamembran, cytplasma, nucleid, ribsmer m.m. Dipiclinsyre er karakteristisk hs endsprer g mangler hs vegetative celler Endsprekernen g SASP er Spre-kernen er meget frskellig fra den vegetative celle, den var frmet af Kernen dehydreres gennem sprulatin, hvilket øger varmemdstanden af makrmlekylerne i spren (ngle sprer kan mdstå varme p til 150 grader) g kan give mdstand til kemikalier sm hydrgenperxid, H 2O 2 Spre-kernen indehlder høj kncentratin af small-acid-sluble-prteins (SASP), sm har 2 funktiner: Binder sig tæt til DNA g beskytter den md skade fra ultravilet stråling, udtørring g tør varme. Fremstår sm carbn- g energikilde ved udvæksten af nye vegetative celler i spiringsprcessen Sprulatinsprcessen Bacillus subtilis sprulatinsprces: Prcessen tager ca. 8 timer Begynder med assymetrisk celledeling Mere end 200 gener er specifikke til prcessen Syntesen af prteiner nødvendige fr funktinen af vegetative celler skal stppes Specifikke endspre-prteiner skal fremstilles manan.dk Side 5 af 28

6 Kapitel 5 Næring ) Mikrbiel næring (s. 108) Hetertrfe: rganismer, der bruger rganiske frbindelser fr carbn g energi Auttrfe: rganismer, der er i stand til at bygge alle deres cellulære strukturer fra CO 2 Ved tørvægt: bakterie indehlder 50% carbn g 12% nitrgen E. cli kan vkse i et simpelt defineret medium, dvs. at det kan syntetisere alle dets rganiske bestandsdele fra en enkel carbnkilde. Kapitel 6 Mikrbiel vækst 6.1) Cellevækst g binær fissin (s. 142) Mikrbilgisk vækst: frøgelse af celleantal Binær fissin: når en celle deles i t nye celler Septum: skillevæg, når en celle sm fx E. cli bliver ca. dbbelt så lang g deles derefter i t nye celler ved septum Generatinstid: tiden, der går, fr at en celle deles i t Balanceret vækst: når de cellulære bestandsdele vkser prprtinal i periden af en generatin Generatinstiden fr en kultur af E. cli er ca. 20 min. 6.2) Fts prteiner g celledeling (s. 142) Fts (filamentus (=trådfrmede) temperature sensitive) prteiner er essentielle fr celledeling hs prkaryte FtsZ er et vigtigt Fts prtein, der har været studeret grundigt hs E. cli g hs andre bakterier Fts-prteiner g celledeling Fts prteiner interagerer g danner et celle-delings-apparatur kaldet divism Hs stav bakterier begynder divism-dannelsen med, at FtsZ frbinder sig i en ring præcis rundt m centret af cellen g definerer derved celledelingsplanen Ringen tiltrækker andre divism-prteiner, inkl. FtsA (hjælper til at frbinde ringen til plasmamembranen g rekrutterer andre divism prteiner) g ZipA (et anker, der frbinder ringen til plasmamembranen g stabiliserer den) manan.dk Side 6 af 28

7 Divism dannes et gdt stykke efter, at frlængelsen af cellen er startet (hs E. cli fx dannes den ¾ inde efter celledelingsbegyndelsen) Divismet indehlder gså Fts prteiner nødvendige fr peptidglykan-syntesen, fx FtsI, sm er et af flere penicillin-bindeprteiner (dvs. de blkeres af penicillin) Hs kkker vkser cellevæggen i mdsat vej ud fra FtsZ-ringen, mens den vkser flere steder langs cellen hs stav-bakterier. DNA replikatin, Min-prteiner g celledeling DNA replikeres før FtsZ-ringen dannes Ringen dannes i rummet mellem de duplikerede nukleider, idet de før isleringen blkerer fr dannelsen af ringen Min-prteiner letter dannelsen af ringen i det ønskede sted MinD findes sm en spiral-struktur på plasmamembranen g svinger frem g tilbage fra pl til pl MinC g MinD frhindrer dannelsen af ringen, g frdi de befinder sig mest ved plerne, er der i cellemidten lav kncentratin af disse prteiner, hvrfr cellecentret er stedet, hvr FtsZ-ringen dannes 6.4) Peptidglykan syntese g celledeling (s. 145) Autlysiner: enzymer, der virker sm lyszymer, laver små huller i FtsZ-ringen Nye cellevægsmateriale er derefter tilføjet henver hullerne Vigtigt at nye cellevægs precursrs (fx muraminsyre, glucsamin) splittes på eksisterende peptidglykan på en krdineret måde, så der ikke pstår brud ved splejsningsstedet, hvrmed autlysis (spntant celle lysis) hindres Bisyntese af peptidglykan Lipid-carrier mlekylet bactprenl transprterer peptidglykan precursrs ver plasmamembranen til periplasmaet, hvr de interagerer med enzymer kaldet glyklaser, der indfører precursrs i den vksende ende af cellevæggen g katalyserer glyksidbindingsdannelsen. Transpeptidatin Transpeptidatin: sidste trin i cellevægssyntesen, der danner peptid-kryds-bindinger mellem muraminsyrerester på nærliggende glykan-kæder I E. cli er FtsI hvedprteinet i transpeptidatinen Penicillin hindrer transpeptidatinsreaktinen ved at binde sig til penicillin-bindeprteiner, der mister deres katalytiske aktivitet, g ny cellevægsyntese phører samtidigt med frtsat autlysinaktivitet, der svækker cellen g leder til lysis. Mennesker er eukarya g har derfr ikke peptidglykan, hvrfr penicillin nrmalt er ikketksisk. Alle patgene bakterier har peptidglykan g er derfr ptentielle mål fr penicillin manan.dk Side 7 af 28

8 6.6) Eksptentiel vækst (s. 148) Eksptentiel vækst: antallet af celler frdbles i et knstant tidsinterval (1 bliver til 2 g hver af de 2 bliver til nye 2 sv.) Efter en peride med eksptentiel vækst gælder følgende sammenhæng fr antal celler: NN = NN nn nn = llllllll llllllnn 00 = 33, 33(llllllll llllllnn 00, ) N = endeligt antal celler, N 0 = initial celletal g n er antal generatiner i løbet af den eksptentielle vækst Generatinstiden (g) fr en eksptentiel vksende ppulatin er t/n, hvr t er varigheden af væksten i dage/timer/minutter. Andre vækstudtryk På semilgaritmisk plt af en eksptentiel vækst kan generatinstiden bestemmes ved 00, gg = ssssssssssssssss vvækkkkkkkkkkkkkk = kk Divisinsraten v = 1/g g udtryk fr antal generatiner pr. tidsenhed i en eksptentiel vksende kultur 6.7) Vækstcyklus (s. 149) En kultur vksende i en lukket behlder kaldes en batch kultur g her frtsætter den eksptentielle vækst ikke uendeligt. I stedet tegner man en vækstkurve med flere faser af vækstcyklussen: Lagfase: den peride, der går før vækst begynder, fx grundet at celler er udtømt fr essentielle bestandsdele, der kræver tid fr at blive bisyntetiseret Eksptentielle fase: celler i eksptentiel vækst er typisk i deres bedste tilstand Statinære fase: Når den eksptentielle vækst phører g der ikke er nget nett frøgelse/mindskelse af celleantallet. Mange cellulære funktiner kan dg frtsætte. Kryptisk vækst: når ngle celler vkser, mens andre dør, så ingen nett frøgelse/mindskelse af antallet i den statinære fase. En af disse t faktrer eller begge begrænser væksten, hvrmed den statinære fase indtræder: Et essentielt næringsstf er pbrugt Et affaldsprdukt af rganismen hber sig p g hæmmer væksten Dødsfasen: når cellerne begynder at dø, ngle ved cellelysis. Dødsfasen er gså en eksptentiel funktin men dg meget langsmmere end vækstfasen. manan.dk Side 8 af 28

9 6.10) Vitaltælling (s. 153) Viable celle = levende celle, der er i stand til deles g give et afkm Vi tæller prøven, der er i stand til at danne klnier på en passende agarplade med antagelse m, at hver celle kan vkse g deles til at give en klni, så klni- g celleantal er prprtinale Frtynding af celle-suspensin før udpladning Nødvendigt at klniantal på pladen ikke er fr str eller fr lille (på verfyldte plader ngle celler vil ikke danne klnier, g hvis man har fr få klnier, vil man have en lav statistisk sikkerhed) Derfr bør klniantal være mellem 30 g 300 Svært at estimere celleantal g derfr nødvendigt at lave en serie frtyndinger Fejlkilder ved vitaltælling Antal klnier afhænger af udpladningsvlumen, levedygtigheden af kulturen, kulturmediet, inkubatinslængde. Hvis t eller flere celler klumper sammen, så vil de kun danne én klni, g derfr er data udtrykt sm clny-frming units (cfu) i stedet fr antallet af levedygtige celler, idet en cfu kan indehlde flere celler Direkte mikrskpi-tælling på naturlige prøver viser typisk flere rganismer end talt på en plade, hvilket kan skyldes: Mikrskpiske metder tæller døde celler gså Frskellige rganismer kan have frskellige næringsbehv g vækstbetingelser end labratriekulturer 6.11) Turbiditetsmåling (s. 156) Her måles ttale cellemasse, sm er prprtinal med celleantal g dermed kan man med turbiditetsmåling bestemme celleantallet i en vksende kultur Afhænger af, hvrdan cellerne spreder lys, der sendes igennem en cellesuspensin Følsmheden er bedst ved krte bølgelængder, men ved tætte cellesuspensiner er længere bølgelængder bedst Enheden fr turbiditet er ptical density (OD) Relatere OD til celleantal Turbiditetsmålinger kan bruges sm erstatning fr vitaltælling, men kræver dg brugen af en standardkurve med fx vitaltælling sammenhldt med turbiditet Prprtinaliteten med celleantal g turbiditet hlder dg til en vis grænse, fr ved høje cellekncentratiner, kan celleverlapninger påvirke lysspredningen g give fejlresultater (dvs. linearitets-afvigelse i standardkurve) manan.dk Side 9 af 28

10 ) Temperatureffekt på vækst (s. 157) Kardinal (=hved-) temperaturer fr en mikrrganisme er min., ptimum g maks. temperaturerne. Fire grupper mikrrganismer i relatin til deres væksttemperaturptimum: Psykrfile: lav temp. ptimum (ptimum 15ºC eller lavere, maks. <20ºC, min. 0ºC eller lavere) Psykrtlerante: vkser ved 0ºC, men har ptimum mellem 20-40ºC Der er påvist vækst ved -12ºC men ikke derunder. Selvm frysning stpper vækst, frårsager det ikke nødvendigvis celledød, idet enzymer frtsat kan virke ved under væksttemp. Mesfile: midt temp. ptimum, udbredt i naturen, fx E. cli (ptimum 39ºC, maks. 48ºC g min. 8ºC) Thermfile: høj temp. ptimum (ver 45 ºC) Hyperthermfile: meget høj temp. ptimum (ver 80 ºC) 6.15) Vækst ved lav eller høj ph (s. 165) Syrefile bakterier vkser ptimalt ved lav ph, typisk ph under 6. Ngle prkaryte er bligat syrefiler = ikke i stand til at vkse ved neutral ph Høje kncentratiner af hydrgininer ved lav ph er essentiel fr membranstabilitet fr syrefile bakterier, hvis plasmamembran ellers ville ødelægges ved højere ph Basefile bakterier: ptimal vækst ved ph 9 eller derver. Bacillus-slægten er et eksempel på basefile bakterier. Bacillus firmus har et utypisk vækstinterval, ph 7,5-11. Den ydre membranverflade af basefile bakterier er mgivet af hydrxidiner, hvrmed prtndrivkraften nrmalt ikke ville fungere (bienergisk prblem fr fx ATP-syntese). B. firmus løser prblemet med at have en Na + -drivkraft, der fx driver transprtreaktiner. Neutrfile bakterier: ptimal vækst ved ph mellem 6 g 8 Intraceullulære ph skal være relativt tæt på neutralitet fr at undgå ødelæggelse af cellens makrmlekyler, fx er DNA syrelabil g RNA baselabil Buffere bruges i batch-kulturer fr at hlde ph relativ knstant, idet ph kan variere ved vækst, når der bruges eller prduceres syre- eller basesubstanser. Fr neutrale ph-mråder bruges ptasiumfsfat, KH 2PO 4 g calciumcarbnat CaCO 3 manan.dk Side 10 af 28

11 6.16) Osmtisk effekt på vækst (s. 166) Psitiv vand balance: når en celle har højere slute-kncentratiner end miljøet, så vandet diffunderer til cellen Halfile: kræver NaCl i det ydre miljø fr at vkse Ikke-halfile: fx E. cli, hvis vækst stpper brat ved selv lave NaCl-kncentratiner Haltlerante: vkser bedst ved fravær af pløste stffer, men kan tlerere miljøer med lav vandaktivitet Gram-psitive kkker af stammen Staphylkkker er haltlerante Osmfile: i stand til at vkse i miljøer med høj kncentratin af sukker Xerfile: i stand til at vkse i meget tørre miljøer Kmpatible slutes: slutes, der bruges inden i cellen fr at regulere vandaktivitet g er ikke hæmmende på bikemiske prcesser i cellen, fx vandpløselig sukkermlekyler eller aminsyrer 6.17) Oxygen g vækst (s. 168) Aerbe: kan vkse ved fuld xygen-spænding g gså ved høje kncentratiner af xygen Mikraerfile: aerber, der kan bruge xygen kun når det er tilstede i lavere mængde end i luften Ngle aerbe er fakultative, dvs. under passede nærings -g kulturbetingelser kan de vkse med ilttilstedeværelse eller mangel men dg bedst med xygentilstedeværelse, fx E. cli Anerbe kan ikke respirere xygen Aertlerante anaerbe kan tlerere xygen g vkse ved dets tilstedeværelse men dg uden at bruge det Obligat anaerbe hæmmes eller dræbes af xygen, fx bakterier fra Clstridium-stammen Reducerende agenter bruges til et kulturmedium af en anaerb bakterie, så at de kan reducere xygen til H 2O, fx thiglyclat manan.dk Side 11 af 28

12 Kapitel 7 Transkriptin, translatin m.m. 7.2) Duble-helixen (s. 177) Adenin med Thymin (Uracil i RNA) g Guanin med Cytsin med hhv. 2 g 3 hydrgenbindinger mellem de tilsvarende baser DNA med højere prcentdel GC-bp smelter ved højere temperaturer i frhld til mlekyle med samme størrelse men mere AT-bp. I duble-helixen er der t render (grves), den stre rende, hvr mange prteiner, der interagerer specifikt til DNA, nrmalt binder grundet større plads Mange mulige duble-spiral-strukturer er mulige fr DNA DNA mlekyle med fx 1000 basepar er 1 kilbase (kb) af DNA, g hvis DNA er duble-helix g har 5000 basepar, så er den 5 kilbase-par (kbp). E. cli har ca kbp af DNA i dets krmsm, dvs. 4,64 Mbp Lange DNA-mlekyler er fleksible men på under 100bp bliver de mere rigide 7.5) Templates (skabelner) g enzymer (s. 182) DNA-replikatin er semiknservativ, dvs. når DNA-duble-helixen åbnes p, vil en ny streng syntetiseres ud fra en template-streng, så man ender med t duble-helixer hver med en template g ny tilhørende streng DNA-replikatin fregår altid fra 5 -enden til 3 -enden Precursren til hver ny nukletid er dexynuklesid-5 -triphsphat, sm sættes på en 3 - OH. De t yderste phsphatgrupper fjernes g den interne phsphatgruppe bindes til kæden DNA plymerase g primase DNA plymeraser: enzymer, der katalyserer tilføjelsen af dexynukletiderne I E. cli er der 5 frskellige plymeraser, DNA plymerase I, II, III, IV g V DNA plymerase III (Pl III): primærenzymet fr krmsm-dna-replikatin Pl I: gså invlveret i replikatin men i mindre grad De resterende hjælper med reparatin af beskadiget DNA Disse enzymer kan kun tilføje en nukletid til en allerede eksisterende 3 -OH-gruppe Primer: en nukleinsyre, typisk et krt stykke af RNA, bruges fr at starte en ny kæde, hvrtil DNA plymerase kan fastgøre den første nukletid Primase: et enzym, der syntetiserer RNA-primeren=11-12 nukletider, der er kmplementære til DNA-templaten manan.dk Side 12 af 28

13 7.9) Oversigt ver transkriptin (s. 189) Transkriptin fra DNA til RNA fregår vha. RNA plymerase, der katalyserer dannelsen af phsphdiester-binding mellem ribnukletider Frudsætter DNA sm template RNA plymeraser hs bakterier har 5 dele, der interagerer fr at danne det aktive enzym, RNA plymerase hlenzyme. β g β (beta prime) ligner hinanden α findes i t kpier σ (sigma): er ikke stærkt bundet sm de andre g spaltes nemt fr at danne RNA plymerase kerneenzyme, der kan syntetisere RNA alene, mens sigma-faktren genkender det passende sted på DNA fr RNA-syntese-start, kaldet prmter RNA plymerasen binder til prmteren g DNA-duble-helixen åbnes p Prmterne retter plymerasen i enten den ene eller anden retning langs DNA en Når et krt stykke RNA er dannet, spaltes sigma-faktren g frlængelsen af RNA mlekylet sker vha. kerneenzymet alene Transkriptinen slutter ved transkriptin terminatrs Når det nye RNA spaltes fra DNA-mlekylet, vender det åbne DNA tilbage til duble-helix-strukturen ω (mega): bruges til at samle kerneenzymet g ikke til RNA-syntesen RNA-syntesen: en ribnukleside-trifsfat bindes til 3 -OH af en ribse af en nukletid. Energi fra de t energirige fsfatbindinger fra trifsfaten RNA plymerasen kan i mdsætning til DNA plymerase påbegynde en ny streng selv g derfr intet brug fr en primer manan.dk Side 13 af 28

14 7.13) Den genetiske kde (s. 194) Translatin: syntese af en nukleinsyre-template med et prtein sm prdukt Den genetiske kde: verensstemmelsen mellem nukleinsyre-template g aminsyre-sekvens af plypeptid-prduktet Cdns: en kmbinatin af 3 baser, der kder fr en specifik aminsyre Cdns skrives sm mrna (fx UUU/UUC, der kder fr phenylalanin) 64 mulige cdns (4 3 ) Mange aminsyrer er kdet af flere cdns En cdns er genkendt ved specifikke base-pardannelser med en kmplementær sekvens af tre baser, kaldet anticdn, fundet på trna, Fx dannes der basepar mellem de tre baser fundet i cdns GCU g baserne i anticdns CGA Wbble(=vaklen)-fænmen: Ved specielle tilfælde kan et trna genkende flere cdns, hvr den så danner standard basepar ved de første t psitiner på cdns kun. Stp- g startcdns Få cdns kder ikke fr en aminsyre, UAA, UAG g UGA, g kaldes stpcdns/nn-sensecdns g signalerer fr slutning på translatin af en prtein-kdende sekvens på mrna en Start-cdn, AUG, begynder translatin ved at indkde en kemisk mdificeret methinin, N- frmylmethinin Inden fr en kde-regin vil AUG dg kde fr aminsyren, methinin, men t frskellige trna er dg invlveret, en trna til start g en trna til methinin Det er essentielt, at ribsmet finder den krrekte start-cdn g bagefter bevæger sig tre baser pr. gang langs mrna, idet det ønskede prtein ellers ikke vil blive syntetiseret. 0-rammen er den krrekte læse-ramme, der translateres til prteinet, der er kdet af genen. rrna (ribsmal RNA) genkender en specifik AUG på mrna en sm startcdn med hjælp af en md-strømmen-sekvens i mrna, kaldet Shine Dalgarn sekvens Open Reading Frames (ORF) En anvendt metde fr at identificere prtein-kdende gener er ved at finde ORF, sm er start cdn (typisk AUG), efterfulgt af et antal cdns g så en stp-cdn (typisk 100 aminsyrer i længden) Cdn-bias Cdn-bias: ngle cdns er fretrukket ver andre, selvm de kder fr den samme aminsyre fx i E. cli er kun 1 ud af 20 isleucin-rester i prteiner kdet af isleucin-cdn, AUA Afhænger af trna-kncentratiner; en trna krrespnderende til en sjælden brugt cdn vil findes i lav kncentratin manan.dk Side 14 af 28

15 7.14) Transprt-RNA (s. 196) Aminacyl-tRNA syntetaser: enzymer, der bringer trna med dens specifikke krrekte aminsyre Reaktinen mellem aminsyren g trna begynder med aktivering af aminsyren ved reaktin med ATP: Aminsyre + ATP aminacyl-amp + P-P Aminacyl-AMP frbliver nrmalt siddende på enzymet indtil kllisin med trna, hvrefter den bindes til trna g danner en ladet trna: Aminacyl-AMP + trna aminacyl-trna + AMP trna indehlder ngle puriner g pyrimidiner, der er lidt frskellige fra de nrmale baser fundet hs RNA trna indehlder gså ngle duble-strengede mråder, sm dannes ved intern base-parring, når det single-strengede mlekyle flder m sig selv Ved 3 -enden findes tre uparrede nukletider, der er essentielle fr funktin, CCA De er ikke indkdet af trna-gener på krmsmet men tilføjet en efter en af CCA-addingenzyme manan.dk Side 15 af 28

16 Kapitel 8 Eukarytisk mikrbilgi 8.5) Gener g krmsmer i eukaryte (s. 213) Prtein-kdende gener er spaltet i t eller flere kdende reginer, exner, med ikke-kdende reginer, intrner, der separerer dem Eukaryte indehlder typisk meget mere DNA end nødvendig til indkdning af prteiner (hs mennesker indkder kun 3% af DNA et prteiner), g det ekstra DNA er enten tilstede sm intrner eller sm gentagne sekvenser Eukaryte har flere lineære krmsmer i nukles, g frdi ribsmerne er i cytplasmaet, er transkriptin g translatin separate prcesser Det lineære DNA-mlekyle er viklet mkring prteiner kaldet histner, der danner strukturer kaldet nuklesmer. DNA-kmplekset plus histner kaldes krmatin. 8.9) Transkriptin g translatin i eukaryte (s. 220) Eukaryte har flere frskellige RNA-plymeraser: RNA plymerase I: transkriberer gener fr t stre rrna mlekyler RNA plymerase III: transkriberer gener fr trna g andre små rrna mlekyler RNA plymerase II: transkriberer prtein-indkdende gener Cytplasmiske ribsmer af eukaryte (80S ribsmer) er større end bakterielle ribsmer (70S ribsmer) g indehlder mere rrna g prteiner Eukarytisk mrna er mncistrnisk, dvs. den bærer kun et gen der giver et enkelt prtein (i mdsætning til prkaryte, hvis mrna er plycistrnisk g kan give flere prteiner) manan.dk Side 16 af 28

17 Kapitel 9 Regulering af genekspressin 9.1) Majr mdes f regulatin (s. 225) Genekspressin: transkriptin g translatin til et specifikt plypeptid T niveauer af regulering i celler: Regulering af prteinaktivitet (hurtig, sekunder eller mindre) efter at det er blevet syntetiseret, fx at enzymet (sm de fleste prteiner j er) hæmmes g ikke katalyserer den ønskede reaktin Regulering af prteinmængde syntetiseret (langsm, flere minutter), der kan frekmme ved enten: Regulering af transkriptin: ved at tilpasse mængden af dannet mrna, mest væsentlige regulering i prkaryte Regulering af translatin: ved enten at versætte eller ikke versætte mrna et 9.2) DNA-bindingsprteiner (s. 226) Regulering af fx transkriptin sker vha. prtein-nukleinsyre interaktiner, der enten kan være: Ikke-specifikke: histner er et eksempel på ikke-specifik bindingsprtein hs eukaryte, idet de er psitivt ladede g bindes derfr til det negativt ladet DNA (negative fsfatgrp). Når DNA et er dækket med histner, kan RNA plymerase ikke bindes, hvrmed transkriptin ikke kan frekmme Specifikke: de fleste DNA-bindingsprteiner interagerer med DNA på en sekvens-specifik måde, dvs. de binder sig kun til DNA indehldende en specifik base-sekvens. De er fte hmdimere, dvs. indehldende t identiske plypeptider, sm hver binder sig til hver af de t DNA-strenge Strukturen af DNA-bindingsprteiner DNA-bindingsprteiner indehlder flere dmæner, der er nødvendige fr krrekt binding til DNA: Helix-turn-helix mtiv: med t plypeptidkæder, alpha-helixer: Genkendelseshelix, der interagerer specifikt med DNA et Stabiliseringshelix, der stabiliserer den første helix Zink-finger: fundet hs regulerende prteiner hs eukaryte Leucin-zipper: prteiner, der indehlder leucin-rester, der er placeret så de minder m et lynlås manan.dk Side 17 af 28

18 9.3) Negativ kntrl af transkriptin: repressin g induktin (s. 228) Enzym repressin (undertrykkelse) frekmmer når et specifikt enzym ikke syntetiseres, idet prduktet, sm enzymet ellers ville katalysere syntesen af, er tilstede i rigelige mængder Dette sikrer, at rganismen ikke spilder energi g næring ved at syntetisere unødvendige enzymer Substanser, der undertrykker enzymsyntese kaldes crepressr I enzym induktin syntetiseres et enzym kun, hvis dets substrat er tilstede, fx beta-galaktsidase, der kløver laktse til glukse g galaktse i fx E. cli, syntetiseres mgående, når laktse er tilføjet til et medium, hvr E. cli vkser Substanser, der inducerer enzymsyntese kaldes inducere Mekanismen af repressin g induktin Effektrerne (crepressr g inducere) virker ved at binde sig til specifikke DNA-bindeprteiner, sm så påvirker transkriptinen. Repressin: Fx bindes effektren til et specifikt repressr-prtein, sm så aktiveres g bindes til et specifikt mråde på DNA tæt på prmteren af genet, peratren (generne, der er kntrlleret af peratren, kaldes pern) Når repressren bindes til peratren, er transkriptinen fysisk blkeret, idet RNA plymerasen ikke kan binde eller frtsætte Induktin: Kan gså kntrlleres af et repressr-prtein, sm så er aktiveret ved fravær af induceren, hvrved transkriptinen er blkeret. Når induceren er tilføjet, kmbineres den med repressren, sm deaktiveres, g transkriptinen kan frtsætte 9.4) Psitiv kntrl af transkriptin (s. 230) I psitiv kntrl af transkriptin aktiverer et regulatr-prtein fr bindingen af RNA-plymerasen til DNA. Et eksempel er maltse-katablismen i E. cli: Enzymet fr maltse-katablismen i E. cli syntetiseres kun efter, at maltse er tilføjet mediet Transkriptinen kræver bindingen til DNA med en aktivatr-prtein, sm frudsætter at det selv er bundet til induceren, maltse Området på DNA hvr aktivatren virker, kaldes ikke peratr, men aktivatr-bindingssted Når maltse-aktivatr-prteinet bindes til DNA, vil RNA plymerasen få lv til at begynde transkriptinen Binding af aktivatr-prteiner Prmterne af psitivt kntrllerede perns har nukletidsekvenser, der binder RNA-plymerasen svagt, hvrfr den har svært ved at binde sig til disse prmters trds tilstedeværelsen af sigmafaktren Aktivatr-prteinet hjælper RNA-plymerasen til at genkende prmteren g begynder transkriptinen ved fx at lave de rigtige kntakter med prmteren manan.dk Side 18 af 28

19 Operns versus regulns I E. cli er generne, der er nødvendige fr maltseudnyttelse spredt ver krmsmet i flere perns, maltse-aktivatr-prteinet kntrller derfr transkriptinen af flere perns Operns, der kntrlleres af et enkelt regulerende prtein, kaldes reguln Kapitel 10 Virlgi 10.1) Generelle egenskaber af virus (s. 252) Virus er ikke celler g derfr ikke-levende. De er bligat intracellulære parasitter, der er afhængige af at kmme ind i en passende værtscelle fr at gennemføre deres replikatinscyklus (infektinsprcess) Virus har dg deres egne genetiske infrmatin g er derfr uafhængige af værtscellens genm Virus kan verdrage vigtige nye egenskaber til værtscellen, sm vil arves, når cellen deler sig, hvis hver ny celle gså arver den virale genm (kan både være skadelig g gavnlig) Virus kan eksistere i både en ekstracellulær eller intracellulær frm: I dens ekstracellulære frm er virus en mikrskpisk partikel, kaldet virin, indehldende nukleinsyre mringet af prtein g ngen gange andre makrmlekyler Viriner er metablisk inaktive g gennemfører hverken respiratin/bisyntese Når en virus er kmmet ind i en celle, træder den intracellulære fase med at virus replikeres Nye kpier af virus genmet er prduceret g bestandsdelene, der udgør viruskappen er syntetiseret Virus genmer kan klassificeres i frhld til, hvad enten nukleinsyren i virinen er DNA eller RNA g yderligere hvad enten den er single- eller duble-strenget, lineær eller cirkulær. manan.dk Side 19 af 28

20 10.2) Naturen af viriner (s. 253) Nukleinsyren i virinen er altid placeret i partiklen g mringet af en prteinkappe, kaldet kapsid, der består af flere kapsmers, en subenhed bestående af kemisk frskellige prteiner. Nukleinkapsid er den kmplette kmpleks af nukleinsyre g prteinpakningen Indhylstrede (envelped) virus Indhylstrede virus indehlder en membran, der mringer nukleinkapsidet g består af et lipiddbbeltlag (kmmer fra værtscellens membran) med prteiner (indkdet af viral genmet), typisk glykprteiner, indlejret i den. Prteinerne er vigtige fr vedhæftning af virinen til værtscellen ved fx infektin Enzymer i viriner Ngle viriner indehlder enzymer, der er vigtige ved infektin Fx indehlder ngle bakterifager (bakterielle virus) enzymet, lyszyme, sm de bruger til at lave små huller i bakteriens cellevæg fr at kunne kmme ind. Lyszyme prduceres gså senere fr at frårsage lysis Ngle virus indehlder deres egne nukleinsyre plymeraser fr replikatin af viral genmet g fr transkriptin af virus-specifik RNA. Ngle virus indehlder enzymer, der hjælper til med frigørelsen fra værten, fx neuraminadaser hs dyrevirus 10.4) Kvantificering af virus (s. 257) Når en virin begynder en infektin på et lag af værtsceller, der vkser på en flad verfalde, vil man se et tmt mråde, plaque, på den vksende værtscelle sm indikatin på lysis. Det antages, at hvert plaque kmmer fra replikatinen af en enkelt virin Antal plaque-frming units er altid mindre end antallet fundet ved elektrnmikrskp, hvilket kan betyde, at ngle virus ikke var succesfulde med inficering af celler 10.5) Virus replikatin (s. 258) Virus replikatin kan inddeles i fem faser: Vedhæftning (adsrptin) af virinen til et mdtagelig værtscelle Penetrering (injektin) af virinen eller dens nukleinsyre i cellen (prteinkappe frbliver udenfr) Syntese af virus nukleinsyre g prtein af cellemetablismen dirigeret af virus Samling af kapsider (g membranbestandsdele i indhyllede virus) g pakning af viral genmer til nye viriner. Hele prcessen kaldes mdning Frigørelse af mdne viriner fra cellen under lysis af værtscellen I de første få minutter efter infektin vil virus gennemgå en eclipse (frmørkelse), dvs. at de smittende partikler ikke kan ses i kulturmediet Eclipse g mdnings periderne kaldes tilsammen den latente peride manan.dk Side 20 af 28

21 10.7) Prduktin af virus nukleinsyre g prtein (s. 261) Baltimre klassifikatinsskema Klasse I: duble-strenget DNA virus Klasse II: enstrenget DNA virus, sm bliver til en duble-strenget DNA i replikatinen Klasse III-VII er RNA virus Klasse IV: Psitiv-strenget RNA virus: en virus hvis enkelt-strenget RNA genm har samme retning sm dets mrna Idet RNA-plymerase nrmalt ikke katalyserer dannelsen af RNA fra RNAtemplate, fungerer genmet her direkte sm mrna mrna indkder et virus-specifikt RNA-plymerase, kaldet RNA-replikase, der danner kmplementære minus-strenge af RNA g bruger dem derefter sm template til at lave flere plus-strenge med Klasse V: Negativ-strenget RNA virus: en virus hvis enkelt-streng RNA genm er kmplementær til dets mrna RNA et her kan ikke fungere sm mrna pga. frkert retning, g derfr bærer disse virus på RNA-plymeraser i deres viriner. RNA-plymerasen syntetiserer plus-strenge, sm bruges sm mrna g template til at lave flere negativ-strenge med. Retrvirus Retrvirus er dyrevirus, der frårsager cancer g AIDS. De har enkeltstrengede RNA i deres viriner De laver mvendt transkriptin (RNA til DNA) g bruger derfr enzymet reversetranskriptase, sm de har i deres viriner Virus prteiner Når mrna er lavet, syntetiseres nu virale prteiner: Tidlige prteiner, lige efter infektin Sene prteiner manan.dk Side 21 af 28

22 Kapitel 11 Genetik 11.2) Plasmider (s. 282) Mange prkaryte indehlder plasmider, genetiske elementer, der replikerer uafhængigt af cellens krmsm g eksisterer i cellen sm frie g typisk cirkulære DNA Plasmider indehlder kun ikke-essentielle, men fte meget gavnlige, gener De består af duble-strenget DNA g er mindre end 5% i størrelsen af krmsmet Frskellige plasmider er tilstede i celler i frskellige antal, kaldet kpiantal T plasmider kan være ufrenlige (incmpatible, Inc), hvis fx et plasmid verføres til en celle, der allerede har et plasmid, så vil sidstnævnte plasmid ikke ses efter replikatin Epismer, plasmider, der kan integrerer sig i krmsmet, hvrmed deres replikatin styres af krmsmet Eksempler på phentyper givet af plasmider i prkaryte: Pseudmnas: nedbrydelse af bl.a. ktan, naphtalene Clstridium: dannelsen af acetne g butanl Staphylcccer: pigmentprduktin Salmnella, Shigella: dyrecelleindtrængen Bacillus antrachis: txiner g kapsler Escherichia: entertxin (prteintksin frigivet af mikrrganismen i tarm), K antigen Celle-til-celle-verførsel af plasmider Plasmider, der frigøres ved død g lysering af deres tidligere værtsceller, kan blive taget af en vært Hvedmekanismen bag celle-til-celle plasmidverførsel er knjugatin, sm kntrlleres af et sæt gener på plasmidet, kaldet tra (transfer)-reginen 11.3) Plasmidtyper (s. 283) R plasmider, resistante plasmider kan give resistens til antibitika g andre væksthæmmere Plasmid R100 bærer på gener, der indkder resistens til bl.a. streptmycin (inhibiterer ribsmtransprt), tetracyclin (inhibiterer binding af aminacyl-trna til ribsmet) Plasmid R100 kan verføres mellem tarmbakterier af stammen, Escherichia, Klebsiella, Prteus, Salmnella g Shiegella Plasmider, der indkder txiner g andre virulenskarakteristik Virulens: 1) evnen af patgenet til at vedhæfte g klnisere specifikke værtsvæv g 2) prduktin af substanser (bl.a. txiner, enzymer), der medfører skade til værten I mange patgene bakterier er virulens-egenskaber indkdet af plasmidgener, mens andre virulensfaktrer kan være indkdet af andre mbile genetiske elementer sm transpsns g bakterifager. Fx kan enterpatgene stammer af E. cli klnisere lilletarmen g danne tksiner, der giver diarre Mindst t tksiner er kendt hs disse stammer af E. cli: manan.dk Side 22 af 28

23 Hemlysin: lyserer røde bldceller Entertksin: inducerer verdrevet udskillelse af vand g salte Klnisatin frudsætter et celleverfladsprtein kaldet clnizatin factr antigen indkdet af et plasmid g giver evnen til at vedhæfte sig epiteliale celler af tarmen Baktericiner Baktericiner: prteiner prduceret af bakterier, der kan hæmme g dræbe nærbeslægtede stammer g gså andre stammer af samme art De er fte nævnt efter stammen af rganismen, der prducerer dem, fx cliciner fra E. cli (indkdet af Cl plasmider) Cliciner bindes til receptrer på verfladen af mdtagelige celler g dræber cellerne ved at frstyrre ngle vigtige cellefunktiner, fx ved at lave kanaler i membranen, så kaliuminer g prtner siver ud, g cellen mister evnen til at genere energi 11.4) Mutatiner g mutanter (s. 285) En mutatin er en arvelig ændring i basesekvensen af genmet En mutant er en celle- eller virusstamme, der bærer på en ændring i nukletidsekvensen Genttype vs. Phentype I bakteriegenetik angives gentypen af en rganisme med tre små bgstaver efter et strt bgstav indikerende et bestemt gen, fx hisc genet af E. cli indkder et prtein kaldet HisC, der medvirker i bisyntesen af histidin. Mutatiner i hisc genet angives sm hisc1, hisc2 sv. Phentypen angives med et strt bgstav efterfulgt af t små med enten et plus eller minus efter fr at indikere tilstedeværelsen eller fraværet af den pågældende egenskab, fx en His + stamme af E. cli er i stand til at lave dens eget histidin mdsat His - Selektive g ikke-selektive mutatiner Selektive mutatiner giver klare frdele til mutantstammen under bestemte miljømæssige frhld, fx antibitiskresistente mutanter, der er i stand til at vkse ved tilstedeværelsen af antibitika Et eksempel på en ikke-selektiv mutatin er farvetab hs en ellers pigmenteret rganisme. Islering af auxtrfe g penicillin-selektin Næringsdefektive mutanter kan påvises ved replica-plating-teknik (kpi-beklædningsteknik) Et aftryk af klnier fra en plade afsættes på en agarplade, der mangler næringsstffet De riginale klnier vil vkse nrmalt mdsat mutanterne, hvrmed klnien på riginalpladen krrespnderende til det tmme mråde på kpipladen, nu kan isleres g karakteriseres Auxtrfe er mutanter med næringsstfsbehv fr vækst (frældrerganismen kaldes prttrf) Penicillin-selektinsmetden: Penicillin dræber kun vksende celler, g hvis den derfr tilføjes en ppulatin med celler, der vkser i et medium, der mangler det næringsstf, sm den ønskede mutant kræver, vil frældrecellerne blive dræbt, mens mutanterne frbliver upåvirkede manan.dk Side 23 af 28

24 11.5) Mlekylær grundlag fr mutatin (s. 287) Inducerede mutatiner laves med vilje. Spntane mutatiner kmmer uden menneskelig interventin fra fx bestråling Punktmutatiner: mutatiner, der ændrer kun et basepar g stammer fra basepar-substitutin i DNA et eller fra tab eller tilføjelsen af et enkelt basepar. Basepar-substitutin Idet at flere aminsyrer kdes af samme cdns, er det ikke alle mutatiner i basesekvensen, der indkder et plypeptid, der ændrer plypeptidprduktet. Denne mutatinstype kaldes stillemutatin, der altså ikke påvirker cellens phentype Stillemutatin er næsten altid i den tredje base af cdn, mens ændringer i første eller anden base af cdn giver typisk ændringer i plypeptidet Missense mutatin: ændret aminsyrecdn, der giver et ændret prtein Nnsense mutatin: et cdn ændres til stpcdn g leder til et ufuldstændigt g ufunktinelt prtein Transitiner er mutatiner, sm leder til at en purinbase (A eller G) substitueres med en anden purin, eller en pyrimidin (C eller T) substitueres med en anden pyrimidin Transversin er punktmutatiner, sm leder til at en purin substitueres med en pyrimidin eller mvendt Tilbagemutatiner g reversin (tilbagevenden) Punktmutatiner er typisk reversible, en prces kaldet reversin, g revertanterne kan være af t typer: Same-site revertants: mutatinen, der restaurerer aktiviteten er på samme side sm den riginale mutatin. Mutatiner, der restaurerer riginalsekvensen kaldes true revertant Secnd-site revertants: mutatinen er et andet sted i DNA et g kan resultere i 1) mutatin i samme eller andet gen, der genetablerer enzymfunktinen 2) mutatin i et andet gen, der resultere i et nyt enzym, der erstatter det første manan.dk Side 24 af 28

25 11.9) Genetisk rekmbinatin (s. 295) Rekmbinatin er den fysiske udveksling af DNA mellem genetiske elementer Hmlg rekmbinatin resulterer i genetisk udveksling mellem hmlge DNA-sekvenser (næsten samme sekvenser) fra t frskellige kilder g fregår ver følgende trin: En endnuklease skærer hak i en streng af det ene af DNA-mlekylerne Strengen med hakket fjernes fra den anden streng vha. prteiner, der har helikaseaktivitet (i E. cli er det RecBCD enzym, der har både helikase g endnuklease aktivtet) Single-strenget bindingsprteiner binder derefter til enkeltstrengssegmentet RecA prteinet danner et kmpleks med strengsegmentet g parrer sig med den kmplementære strengsekvens på det andet DNA ved streng invasin g danner strukturer kaldet Hlliday junctins De sammenkædede mlekyler separeres af reslvaser g igen bringes sammen med de riginale strenge (i E. cli fungerer RecG g RuvC prteiner sm reslvaser) 11.10) Transfrmatin (s. 297) Transfrmatin er genetisk verførselsprces hvrmed fri DNA er indføjet i en mdtager celle g bringer genetisk ændring Hvis en prkaryt lyseres mildt, vil det lange DNA mlekyle sive ud g deles i flere fragmenter (fx i Bacillus subtilis er det fragmenter á 10 kbp hver svarende til 10 typiske gener á størrelsen 1000 nukletider) Dygtighed til tranfrmatin Kun ngle stammer er kvalificerede til at mdtage DNA g blive transfrmeret Dygtigheden i de fleste naturlige transfrmerede bakterier kan reguleres af specifikke prteiner 20% af Bacillus celler i en kultur efter regulering blive transfrmatinsdygtige 100% i streptkkker E. cli er dårlig til at blive transfrmeret, men ved behandling med kalsiuminer bliver E. cli bedre egnet til transfrmatin Electrpratin er en fysisk teknik, der bruges til at lade DNA kmme i rganismer, der er svære at transfrmere, fx E. cli g fleste andre bakterier Celler blandes med DNA g udsættes fr krtvarig høj spændings elektriske pulser, der tillader DNA-indtrængen Integrering af transfrmeret DNA Tranfrmeret DNA bindes til celleverfladen af DNA-bindingsprteiner Enten hele duble-strengen trænger ind eller kun en enkelt streng efter, at nuklease nedbryder den anden streng Efter at DNA et er kmmet i cellen, bindes det til en cmpetence-specifik prtein, der beskytter DNA et fra nuklease angreb indtil det når krmsmet, hvr reca tager ver manan.dk Side 25 af 28

26 Transfektin Transfektin er prcessen hvri bakterier tranfrmeres med DNA ekstraheret fra bakterievirus Kapitel 12 Genmdulering 12.4) Plasmider sm klningsvektrer (s. 318) puc19 er et vidt brugt klningsvektr Et segment af kunstigt DNA med snitsteder fr flere restriktinsenzymer, kaldes en plylinker eller multiple clning site, indsættes i lacz genet, der indkder laktsenedbrydende enzym, beta-galaktsidase Et passende restriktinsenzym med et snitsted inden fr plylinkeren vælges Både vektren g det fremmede DNA klippes med enzym Segmenter af det fremmede DNA indsættes i det åbne snit i vektren g ligeres med DNA ligase. Dette påvirker lacz genet, kaldet insertinal inactivatin En farveløs reagent, Xgal er tilføjet g kløves af beta-galaktsidase, hvrved celler med vektr men uden klnet DNA bliver blå, mens celler med vektr g klnet DNA er hvide (ingen beta-galaktsidase) 12.8) Plymerasekædereaktin (s. 324) Plymerasekædereaktin (PCR) er metden, hvrmed kpier af specifikke DNA-sekvenser laves in vitr (uden fr levende rganisme) Reaktinen kan kpiere p til milliarder af DNAsegmenter, kaldet amplifikatin PCR s frløb: T DNA lignukletid primers er tilføjet til en varmedenatureret DNA Efter afkøling vedhæfter de t primers til hhv. target-strengen g kmplementærstrengen DNA plymeraser (typisk Taq plymeraser eller Pfu plymeraser, der er varmestabile) frlænger den nye kæde startende fra primers Blandingen pvarmes g afkøles, g hele prcessen gentages Efter hver runde frdbles prdukterne g man får en eksptentiel vækst I reverse transcriptase PCR bruges reverse transcriptase til at lave kmplementære DNA (cdna) kpier fra RNA manan.dk Side 26 af 28

27 12.12) At finde den rette kln (s. 332) Flere metder kan bruges til at finde g islere den ønskede kln, hvis man sm i et gen biblitek har mange tusinde klner, bl.a.: Prteinet, der indkdet af det klnede gen, kan betragtes sm antigen g derfr bruges til at danne et tilhørende antistf hs et dyr. Lkatinen af de ønskede klnier kan derefter bestemmes ved at bservere bindingen af antistffet ) Shuttle vektrer g ekspressinsvektrer (s. 334) Shuttle vektrer: vektrer, der kan replikere g er stabile i t eller flere ubeslægtede værtsrganismer Shuttle vektrer kan derfr verføres fra rganisme til rganisme Shuttle vektrer er udviklet i E. cli, Bacillus subtilis m.m. Organismer har kmplekse regulatriske systemer, g klnede gener er fte dårligt udtrykt (expressed) eller slet ikke i fremmede værtsceller. Prblemet løses dg ved brug af ekspressinsvektrer, der gør det muligt at kntrllere ekspressinen af klnede gener Ekspressinsvektrer indehlder stærke prmters, der fungerer effektivt i værten I E. cli bruges prmters sm lac, trp, tac, trc pern prmters m.m Regulering af ekspressin med bakterifag T7 Når bakterifagen T7 inficerer E. cli, indkder den dens eget RNA plymerase, der kun genkender T7 prmters g derfr lukker fr alt andet transkriptin i værten I T7 ekspressinsvektrer er klnede gener under kntrl af T7 prmteren. Fr at pnå dette er T7 RNA plymerasen tilstede i cellen g kntrlleres af fx lac ved at integrere genet fr T7 RNA plymerase med lac prmter i krmsmet af værtscellen De klnede gener er udtrykt (expressed) krt efter at T7 RNA plymerasen er transcriperet af en lac inducer, fx IPTG. Idet T7 RNA plymerasen kun genkender T7 prmteren, er det kun de klnede gener, der transcriberes. manan.dk Side 27 af 28

28 Kapitel 26 Biteknlgi 26.2) Ekspressin af pattedyrsgener i bakterier (s. 762) Ekspressinsvektrer er nødvendige fr at udtrykke eukarytiske gener i bakterier Først skal intrner fjernes, g dette gøres i klningsprcessen, før generne er indsat i værten g bruges til prduktin Genklning via mrna Standardmetden til at få intrnfrie eukaryte gener er ved at klne det via dets mrna mrna et bruges til at lave kmplementær DNA (cdna) ved brug af reverse transkriptase Eukarytisk mrna er unik med dets ply(a)-ende En primer bruges, der er kmplementær til ply(a)-enden Det syntetiserede DNA har et hårnållignende ende, der fungerer sm primer til syntesen af det kmplementære streng vha. DNA plymerase I g sm bagefter fjernes, så man ender med et duble-strenget DNA mlekyle. manan.dk Side 28 af 28