Ekstrktion f spektre og chromtogrmmer vh kemometriske teknikker Nogle kemometriske teknikker til seprtion f spektre og chromtogrmmer er undersøgt mhp utomtisering f dtehndlingen f NMR-chromtogrmmer Teknikkerne kn også ruges til ndre NMR-tidsserier som feks studiet f kinetik og stilitetsundersøgelser Af Clus Cornett, lektor, phd, Institut for Anlytisk og Frmceutisk Kemi, DFH, cc@dfhdk Ved HPLC-NMR-nlyser f ekstrkter og nlyser f tidsserier, feks i forindelse med nedrydnings- og stilitetsstudier, titreringer mv, producerer NMR-instrumenter ofte store dtmtricer estående f serier f spektre Disse chromtogrmmer eller tidsserier er ikke egentlige illeder Mn er derfor ikke interesseret i t uddrge illedelementer, men derimod enkelte spektre og deres tidsprofiler Den disciplin inden for kemometrien, der eskæftiger sig med dette prolem, kunne kldes multivrit kurveopløsning (multivrite curve resolution) Det interessnte er, t når mn hr fundet de enkelte spektre og deres tidsprofiler, hr mn en væsentlig del f de dt, der skl til for t estemme stoffernes struktur, smt hvor meget der er f de enkelte stoffer I denne smmenhæng er NMR jo en unik teknik, idet mn ikke er plget f forskellige molære sortionskoefficienter I det følgende vil jeg klde disciplinen for Multivrit Kurve Opløsning (MKO), mens de specifikke teknikker vil live omtlt ved deres engelske nvne og forkortelser Oprindeligt kldtes teknikken for Self Modeling Curve Resolution [], selvmodellerende kurveopløsning, d mn ikke nvender nogle ntgelser om linieform på toppene i de spektre, mn nlyserer Til dtehndlingen nvendes Mtl, et numerisk mtemtisk værktøj, der er populært i kemometrikredse Der findes grtis værktøjspkker (tooloxe) til Mtl på Internettet, og mn kn køe nogle kemometriske pkker Jeg hr selv udviklet en teknik, l for t få prolemstillingen»under huden«, og nskffet tre kommercielle kemometriværktøjsksser til Mtl D jeg strtede projektet, syntes jeg, t ideen om t nvende kemometri til t uddrge spektre fr NMR-tidsseriedt vr indlysende rigtig, og jeg undrede mig over, t der ikke vr ndre, der hvde fundet på det llerede Siden hr jeg fået kendsk til enkelte MKO-lignende nvendelser Den ene drejer sig om utomtisk seprtion f spektre og tidsprofiler for diffusionsdt og kldes DECRA [] Den nden nvender teknikken til t estemme ntllet f komponenter i fst octclciumphospht [3] Multivrit kurveopløsning nvendt på NMR-chromtogrmmer Først gennemgås de teknikker, jeg selv hr udviklet Dernæst smmenlignes resultterne med de resultter, jeg hr fået ved t nvende de kommercielle pkker som»plsthyldevrer«jeg hr ikke pillet i de enkelte værktøjskssers indre, selv om det i visse tilfælde er muligt, l fordi de fleste prgmtiske spektroskopikere egentlig helst er fri for t skulle pille for meget ved ndres softwre (det er ofte lettere t skrive noget nyt selv) Det grundlæggende prolem kn mtemtisk eskrives ved, t mn hr et dtsæt i en mtrix estående f spektre optget til en sædvnligvis konstnt stigende tid Er tiden ikke konstnt voksende, er mtemtikken»ligegld«, det komplicerer kun efterehndlingen en smule Jeg hr vlgt t orgnisere dtmtrixen, så hvert spektrum sættes i en række i mtrixen, med det første (tidligste) spektrum i række Det giver følgende mtrixligning: Øverst: NMR-chromtogrmmet opløses i spektre og chromtogrmmer for de enkelte komponenter 6 9 8 7 6 = 3 * 3 3 3 NMR Chromtogrm Koncentrtionsprofil f de enkelte komponenter Spektre f de enkelte komponenter Figur Illustrtion f seprtion f chromtogrmmer og spektre To stoffer med lidt forskellige retentionstider, men meget forskellige spektre NMR-chromtogrmmet til venstre (et ntl spektre optget efterhånden som stofferne eluerer) seperreres i to chromtogrmmer og to spektre Tillæg til dnsk kemi, 8, nr 9, 6
6 Tid 3 3 3 Chemicl shift (dtpunkt nr) Figur Konturplot f NMR-chromtogrmmet i figur Ligesom et lndkort med højdekurver er det set ovenfr Det kn illustreres ved figur I figur er vist et konturplot f NMR-chromtogrmmet (set ovenfr) Umiddelrt ser det ud som en forholdsvis enkel prolemstilling, men d åde de»rene«spektre og chromtogrmmerne kn overlppe, er det lngt fr en triviel øvelse Nogle spektre, feks for sustituerede phenoler, vil ligne hinnden meget Hr mn kun dgng til den romtiske del f spektret, vil spektrene for niosol og ethylphenol ligne hinnden meget I nogle kun lt for relistiske NMR-chromtogrmmer, vil toppene åde fronte (ssymetrisk fortil) og tile (ssymetrisk gtil), d mn vil være tiløjelig til t sætte en stor prøvemængde på kolonnen for t opnå stof nok til ordentlige spektre Derfor hr jeg vlgt et testsystem, der estår f en lnding f phenolderivter, som vi sædvnligvis nvender ved test f»hjemmepkkede«chromtogrfiske kolonner Kolonnetesten er modificeret, så den psser til NMR (oks, side ) Det er min erfring, t dette system udgør en god systemtest for HPLC-NMR-pprtet Dvs, hvis chromtogrmmet ser rigtigt ud, fungerer lle dele f opstillingen tilfredsstillende En sådn systemtest hr stor etydning i forskningsmiljøer som DFH, idet der nvendes flere forskellige HPLC-pprter i forindelse med vores NMR-spektrometer De nvendelser, der er eskrevet i litterturen, omhndler i t N er ntllet f dtpunkter, spektret, xi er værdien (mplituden/»tophøjden«) for det enkelte dtpunkt Den solutte værdi eregnes f hensyn til logritmefunktionen og for t undgå, t feks to lige store, modstrettede dtpunkter ophæver hinnden Minusset i formel sikrer, t E liver positiv, division med n t E ligger mellem og Desuden er spektret levet normeret (lle værdier ligger mellem og, længden f dt etrgtet som vektor = ) Mtlfunktion skrevet til eregning f den konfigurtionelle entropi for et NMR spektrum: Figur 3 Beregning f den konfigurtionelle entropi 7 Tillæg til dnsk kemi, 8, nr 9,
6 EFA -> 3 6 8 EFA -> 3 6 3 6 EFA -> 3 6 8 EFA -> 3 6 3 6 8 EFA <- 3 6 3 3 EFA <- 6 EFA <- 3 6 8 EFA <- 3? 3 6 8 EFA -> 3? 3 6 8 EFA -> 6 3 6 8 EFA <- 3 3 6 8 EFA <- 6 3 3 3 6 8 3 6 8 6 8 6 8 Forlæns Evolving Fctor Anlysis Bglæns Evolving Fctor Anlysis Figur Evolving Fctor Anlysis nvendt på mit testdtsæt Pilene viser, hvor de enkelte fktorer opstår og forsvinder overvejende grd UV-spektrometri (ortset fr DECRA, octclciumphospht) Signlerne i UV-spektre er meget redere end signler i NMR-spektre, smtidig med t de som regel hr en lvere detljeringsgrd Det etyder, t det kn være vnskeligt t registrere, om en seprtion f spektre og chromtogrmmer er forløet tilstrækkeligt fuldstændigt Det første prolem er t estemme ntllet f komponenter i den lnding, mn nlyserer I de fleste interessnte tilfælde ved mn det ikke i forvejen og kn ikke ltid se det på dtene I kemometrien ruges flere mål for ntllet f komponenter, såkldte indiktorfunktioner (se feks [7], [8] eller [9]) Jeg hr vlgt t teste de mest lmindelige (egenværdier + reducerede egenværdier og de første fledede derf, smt F-værdier for de reducerede egenværdier) smt konfigurtionel entropi (formel i figur 3, side 7), der erfringsmæssigt hr vist sig nyttig inden for NMR Af de vlgte indiktorfunktioner fungerede den konfigurtionelle entropi (7 komponenter fundet) smt F-værdier (7 komponenter fundet) edst på testdtsættet ( komponenter), mens egenværdier smt reducerede egenværdier overvurderede ntllet f komponenter lidt mere (8 komponenter) Det er i virkeligheden slet ikke dårligt, d feks effekter min 38 3 97 7 7 8 7 6 ppm Figur NMR-chromtogrm f testdt fr injektionen f prøven vil ses i spektret og på den måde ses som ekstr informtion/vrins og dermed ekstr komponenter I nlysen er de residuelle solventsignler udeldt, idet de selvom der er nvendt deuteret vnd og signlet fr cetonitrilen er undertrykt totlt dominerer informtionen i NMRchromtogrmmet De principle»komponenter«f dt (ofte kldet fktorer for ikke t forveksle dem med komponenter i lndingen) hr jeg fundet ved t lve en Singulr Vlue Decomposition, hvilket er ekstremt simpelt i Mtl Mn skriver lot [U,S,V] = svd(dt) Dt er en mtrix indeholdende NMR-chromtogrmmet, V er egenvektorerne, svrende til de principle komponenter, og S er en (digonl) mtrix indeholdende egenværdierne svrende til de principle komponenter Egenværdierne (med tilhørende egenfunktioner) er sorteret efter fldende størrelse, så den største er S, den mindste S nn Se feks en eskrivelse f SVD i Numericl Recipes [] Et meget nvendt trick i denne smmenhæng er t følge udviklingen f komponenter/fktorer efterhånden, som de»opstår«det kn feks gøres ved følgende procedure, hvor mn successivt inddrger flere spektre fr NMR-chromtogrmmet (svrende til t tidsksen i chromtogrmmet er): [U(),S(),V()] = svd(dt(mxkomponenter,strtfrekvensstopfrekvens)) [U(),S(),V()] = svd(dt(mxkomponenter+,strtfrekvensstopfrekvens)) [U(),S(),V()] = svd(dt(ntl spektre i NMRchromtogrmmet,strtfrekvensstopfrekvens)) Udfører mn denne nlyse, kn mn på en fildning f egenværdi() mod»tid«se, hvornår den første komponent kn registreres i chromtogrmmet Tilsvrende vil mn f de resterende egenværdier mod»tiden«se, hvornår de næste komponenter kn registreres Desværre kn mn ikke se, hvornår de forsvinder igen, men heldigvis kn mn få denne informtion ved t lve nlysen gfr, så mn strter med de sidste spektre i chromtogrmmet og tålmodigt rejder sig frem til det første Ved t filde egenværdierne på smme måde som ved den forlæns nlyse, kn mn se, hvornår de enkelte komponenter forsvinder Dvs, t den sidste komponent, der opstår i den forlæns nlyse, er den første, der opstår i Tillæg til dnsk kemi, 8, nr 9, 8
den glæns nlyse Sådn udføres en Evolving Fctor Anlysis (EFA) I figur er vist en forlæns og en glæns nlyse for testdtsættet I figur er et konturplot f testdtsættet vist Den»utomtiske«detektion f komponenter vh EFA fungerer ikke optimlt på dette dtsæt Derfor er Mtl-progrmmerne st op til, t detektionsintervllerne defineres mnuelt Desuden fungerer de, så hver komponent trækkes fr NMR-chromtogrmmet, så snrt den er detekteret Dermed interfererer den ikke med detektionen f de resterende komponenter Derudover defineres de intervller, hvor komponenterne skl trækkes fr NMRchromtogrmmet Det er illustreret i figur 6 Figur 6 viser de specificerede detektionsintervller, figur 6 de intervller, hvor de fundne fktorer skl frtrækkes D toppene i chromtogrmmet fronter en del, hr jeg vlgt t lde nlysen køre fr genden f chromtogrmmet I figur 7, side er resulttet f den første cyklus vist Figur 7 viser de første 6 principle fktorer i detektionsintervl Fktor ligner spektret f en monosustitueret phenol (phenetol) Figur 7 viser det chromtogrm, der opstår, når mn eregner chromtogrmmet for fktor Det gøres ved t normere fktor (etrgte den som en vektor og dividere lle koordinterne med længden) og dernæst udregne det sklære produkt (prikke den smmen med) hvert enkelt spektrum i chromtogrmmet Som det ses, kunne der også se ud til t være fktor tilstede i det, der liver til detektionsintervl Det skyldes, t den romtiske del f spektrene for phenetol (ethylphenolt) og nisol (methylphenolt) ligner hinnden utroligt meget (se også figur 8, side ) Kemiske strukturformler ses i oksen I figur 7c er fktor trukket fr NMR-chromtogrmmet i det specifi- t min min 38 3 97 7 7 8 38 97 7 8 7 6 ppm 3 7 7 ppm 3 3++ Figur 6 Øverst () de detektionsintervller jeg hr defineret Anlysen foretges gfr Hver fktor trækkes fr dtsættet, før den næste defineres Nederst () de intervller, hvor de fktorer frtrækkes 9 Tillæg til dnsk kemi, 8, nr 9,
Figur 7 Detektion f den første fktor (), svrende til detektionsintervl i figur 6 () viser det chromtogrm, mn opnår for den første fktor Den røde jælke viser sutrktionsintervllet, svrende til sutrktionsintervl i figur 6 (c) viser NMR-chromtogrmmet efter sutrktion f den første fktor Det kn være lidt vnskeligt t se konturerne i den nederste hlvdel, d de er vlgt, så mn kn se støjen i spektret (d) viser kontroldt for detektionsintervl, hvor detektion f fktorer er forsøgt igen, efter frtrækning f den første fktor Figur 8 Det færdige resultt, de fktorer/spektre er ekstrheret og deres tilhørende chromtogrmmer er vist Ved smmenligning med spektrene i oks ses, t spektrene er f fin kvlitet, og signl-støj-forholdet er edre cerede sutrktionsintervl (figur 6) Derfor hr jeg vlgt t gøre det muligt kun t trække en fktor fr i et egrænset intervl Processen gentges for intervl - Resulttet ses i figur 8 Bemærk igen, hvor meget de to første spektre ligner hinnden Ved smmenligning f chromtogrmmer og strukturer i oksen ør mn huske på, t spektrene med tilhørende chromtogrmmer er vist i omvendt rækkefølge, d nlysen er kørt»glæns«det videre rejde går ud på t utomtisere detektions- og sutrktionsintervller for fktorer Smmenligning med ndre metoder Multivrite Curve Resolution (MCR, [,]) er en umiddelrt lovende metode til utomtisk seprtion f spektre og chromtogrmmer En f de værktøjsksser PLS_toolox fr Eigenvector reserch, jeg hr nskffet til Mtl, indeholder MCR, som en færdig dtnlysemetode Anvendelsen f MCR er testet i denne form på mit testdtsæt, og resulttet er ikke helt håløst, men heller ikke godt nok, se figur 9 De tre første fktorer er tydeligvis ikke ordentligt sepreret fr hinnden, men er dog seprret fr de to sidste Hvorvidt disse to er tilstrækkeligt sepreret fr hinnden er svært t vurdere, d spektrene ligner hinnden så meget Implementeringen i PLS_toolox kræver et strtgæt på chromtogrmmerne for de enkelte komponenter, så heller ikke denne procedure kn siges t være fuldutomtisk Jeg hr eksperimenteret med nogle forskellige måder t»gætte«strtværdien f chromtogrmmerne på Den procedure, der fungerer edst, er t udregne et»informtionschromtogrm«ved t nvende entropiformlen formel (figur 3) på hvert enkelt spektrum og filde resulttet som funktion f tiden Resulttet ses i figur 9 Retentionstiderne svrende til de højeste toppe ruges så til t konstruere»chromtogrmmer«estående f nuller ortset fr det punkt, der svrer til mximum Desuden hr jeg specificeret, t spektre og koncentrtioner ikke kn være negtive Min konklusion er, t det jeg mngler ved denne»dåseruti- x 6 67 638 8 x 6 6 8 3 3 x 6 6 8 7 39 x 6 t 6 8 98 3 333 37 Figur 9 Entropichromtogrm () og MCR nvendt på testdtsættet () 3 x 6 8 6 8 Tillæg til dnsk kemi, 8, nr 9,
Figur Spexf nvendt på testdtsættet med lle spektre inddrget () og de første spektre udeldt for t undgå injektionsrtefkter () x - x - 6 8 x - x - 6 - x - 6 8 - x - 6 - x - 6 8 - x - 6 - x - 6 8 - x - 6 - - 6 8 - - 6 Figur Autowf nvendt på testdt Hhv 6 komponenter og 7 fktorer og 7 komponenter og 8 fktorer Chromtogrm No - Chromtogrm 3 No 6 7 - Chromtogrm 3 No 3 6 7 - Chromtogrm 3 No 6 7 - Chromtogrm No 3 6 7 - Chromtogrm 3 No 6 6 7-3 6 7 ne«er en mulighed for t specificere, i hvilke intervller de enkelte fktorer skl detekteres, og i hvilke de skl»trækkes fr«jævnfør ovenstående Mn kn sndsynligvis opnå noget f dette ved t specificere områder, hvor intensitet i spektre og chromtogrmmer er, men det kræver indgre fr opertøren Jeg hr som udgngspunkt prøvet t nvende de f MCRrutinen fundne chromtogrmmer for de enkelte fktorer til t estemme, hvilke områder fktoren kn forekomme i Det er gjort ved t sætte Mtl til t lægge den egrænsning ind, t er værdien til et givet tidspunkt f chromtogrmmet for en enkelt fktor mindre end % f den største værdi i chromtogrmmet, må fktoren ikke forekomme Dette gv ikke mærkrt edre seprtion f de enkelte fktorer En nden værktøjspkke, Fctor Anlysis Toolox, fr Applied Chemometrics, indeholder to mtlprogrmmer, der kn nvendes til mit formål Den ene kldes Spectrl Isoltion Fctor Anlysis (spexf, [6]) og kræver, t spektret hørende til en komponent i den nlyserede lnding hr mindst ét unikt punkt, dvs komponenten sorerer mindst ét sted, hvor ingen f lndingens ndre komponenter sorerer Denne erkendelse går helt tilge til grundlæggelsen f disciplinen [] Den nden er en implementering f Evolving Fctor Anlysis, der utomtisk selv finder komponentvinduer og koncentrtionsprofiler, kldet Auto Window Fctor Anlysis (utowf) Spexf giver følgende resultt (figur ) De første 3 komponenter og den dskilles fint Der er vrøvl med den komponent, der ser ud til t være ilndet lidt f den komponent Prolemet ser ud til være relteret til et injektionsrtefkt (figur ) I figur er de første spektre, indeholdende injektionen f prøven, udeldt Det giver et etydeligt edre resultt, dog indeholder komponent lidt f komponent 3 og komponent lidt f hvert, men ellers er komponenterne edre sepret Tillæg til dnsk kemi, 8, nr 9,
Systemtest til HPLC-NMR Systemtesten ygger på det testsystem, vi ruger på DFH, når der skl testes hjemmepkkede eller indkøte omvendtfsekolonner Grundlæggende er systemet: - Moil fse: Methnol:Vnd : - Flow: ml/min - UV-detektion ved nm (injicerer mn store stofmængder kn det være nødvendigt t detektere ved en højere ølgelængde, feks 9 nm) - μl f testlnding injiceres Testlndingen estår f cetone, phenol (top ), p-cresol (top ), OH 3,-xylenol (top 3), nisol (top ) og phenetol (top ) Stmopløsningen er c mg/ml f hver, normlt injiceres en fortyndet opløsning på c mg/ml f hver - Antllet f teoretiske O unde for den sidste top ør være over 3- for en god kolonne Ved HPLC-NMR udskiftes den moile fse med O en lnding estående f: DO:CH3CN 6:3 Desuden injiceres μl OH OH ufortyndet testopløsning Figuren viser et UV-chromtogrm for en sådn injektion f μl mg/ml testopløsning smmen med spektre for de enkelte stoffer UV-detektion ved 6 nm Kolonnen er en Wters Novpk C8, 39 x mm, μm Spektrene er trukket ud f et NMR-chromtogrm svrende til en injektion f μl mg/ml testopløsning, uden yderligere dtehndling Strukturerne f stofferne i testlndingen er ligeledes vist i figuren ret, og chromtogrmmerne ser relistiske ud Spexf fungerer lidt edre end MCR, er en del hurtigere og mere utomtisk Autowf giver, med omhyggeligt udvlgte inputprmetre, et ud på komponentprofilerne, der så kn nvendes ved videre eregninger Anvendt med 6 komponenter og 7 fktorer fås koncentrtionsprofilerne i figur Med 7 komponenter og 8 fktorer fås figur Figur (side ) illustrerer tydeligt fren ved t overmodellere (figur ), mens en kørsel med kun komponenter ikke får den top med i chromtogrmmet (ikke vist) En modellering med én ekstr komponent er åenrt nok til t modellere injektionsrtefkten Så heller ikke i dette tilfælde kn mn opnå fuldstændig utomtik Afrunding Ud over selve eregningerne hr jeg skrevet nogle mtlrutiner, der gør det muligt t importere NMR-spektre fr Brukerinstrumenter Konklusionen er, t med lidt omtnke kn mn ekstrhere rene spektre f god kvlitet fr NMR-chromtogrmmer, om end de færdigpkkede progrmmer til Mtl kræver lidt mere udvikling, før de liver rigtigt nyttige Under lle omstændigheder kræver de ekstrherede spektre en kritisk vurdering før videre nvendelse Et ndet spekt, der er værd t ide mærke i, er, t mn skl tge sig i gt for injektionsrtefkter Der findes visse muligheder for t kompensere for dem i NMR, men det vil føre for vidt t komme ind på dem her Under lle omstændigheder ør mn udvikle sine chromtogrfiske metoder, så ingen stoffer f interesse eluerer med solventfronten Et positivt resultt er dog, t mn opnår spektre f en edre kvlitet (signl-støj, renhed) end ved lot t kominere enkeltspektre fr NMR-chromtogrmmet, idet mn inddrger flere spektre og enytter principl komponent nlysen til t seprere noget f støjen fr spektrene Desuden en dyfølt tk til Bruker for t låne os en flowproe til vores NMR Referencer Artikler Lwton, W H og Sylvestre, E A»Self Modeling Curve Resolution«Technometrics, 3, 97, 67-633 Antlek, B, og Windig, W»Generlized Rnk Annihiltion Method Applied to Single Multicomponent Pulsed Grdient Spin Echo NMR Dt Set«J Am Chem Soc,8, 996, 33-33 3 Kormos, D W Og Wugh, J S Anl Chem,, 983, 633-638 Tuler, R og B Kowlski Anl Chem, 6,993, -7 Tuler, R, Izquierdo-Ridors, A og Cssss, E»Simultneous Anlysis of Severl Spectroscopic Titrtions with Self-Modeling Curve Resolution«Chemo And Intell L Sys, 8, 993, 93-3 6 Mlinowski, E R»Otining the Key Set of Typicl Vectors y Fctor Anlysis nd Susequent Isoltion of Component Spectr«Anl Chim Act, 3, 98, 9-37 Kemometriøger 7 Mlinowski, E R»Fctor Anlysis in Chemistry«Second edition Wiley 99 ISBN -7-39-3 8 Adms, M J»Chemometrics in nlyticl Spectroscopy«RSC Anlyticl Monogrphs 99 ISBN -8-- 9 Krmer, R Chemometric Techniques for Quntittive Anlysis Mrcel- Dekker (998) ISBN -87-98- Press, W H, Flnnery, B P, Teukolsky, S A og Vetterling, W T»Numericl Recipes in C«Cmridge 988 (3rd reprint 99) ISBN - -36-X Wedresser Applied chemometrics: http://wwwchemometricscom Eigenvector Reserch, Inc: http://wwweigenvectorcom Mtl: http://wwwmthworkscom, //wwwcomsoldk Tillæg til dnsk kemi, 8, nr 9,