Åben dialog og ny membranteknologi

Transkript

1 PROFILEN Åben dialog og ny membranteknologi Da Arvid Garde og Jens-Ulrik Rype udviklede den patenterede membranteknologi REED, ændredes deres liv. I dag har de egen virksomhed Jurag Separation og lever af at udvikle membranteknologi til biotekindustrien Af Katrine Meyn, km@techmedia.dk Da Arvid Garde og Jens-Ulrik Rype studerede til kemiingeniører på DTU, jokede de om, at de burde starte deres egen virksomhed inden for membranfiltrering. Ingen af dem havde regnet med, at de rent faktisk sad med deres egen virksomhed 5 år senere. - På DTU arbejdede vi begge med at udvikle og tilpasse membranfiltreringsmetoder til forskellige problemer i biotekog fødevareindustrien. Ved fermentering er det f.eks. et problem, at de mikroorganismer der arbejder, producerer en uønsket inhibitor. Man kan bruge mange forskellige membranfiltreringsmetoder til at fjerne de forskellige inhibitorer. En af de bedste er elektrodialyse, der dog har det store problem, at membranerne tilsmudses, der opstår fouling. - Det problem løste vi i løbet af vores ph.d. er med en helt ny opsætning - REED (Reverse Electro-Enhanced Dialysis). En ny start På dette tidspunkt blev Arvid Garde og Jens-Ulrik Rype bremset. De havde udviklet en ny teknologi og blev rådet til straks at tage patent, og det gik år 2000 med. Da patentet var taget skrev de på fjorten dage en fornuftig forretningsplan, og den 1. januar 2001 startede Arvid Garde Jurag Separation. - Efter et par år begyndte vi et samarbejde med den første store kunde med interesse for teknologien, og jeg blev ansat. Vi knoklede et halvt år for at overbevise kunden om, at vi havde udviklet en teknologi, de ikke kunne undvære. Da vi var ved at løbe tør for penge, besluttede kunden desværre, at det kunne de godt, siger Jens-Ulrik Rype. Redningsplanken kom i form af Jurags første investor, DTU Innovation. De bad om en mere professionel forretningsplan, og efter ½ år lykkedes det at finde tre nye investorer. I marts 2004 var refinansieringen på plads. Samtidig flyttede virksomheden til lokaler i Gladsaxe. Figur 1. Opbygningen af en REED-stak. - Det var på tide, at vi blev fysisk adskilt fra DTU. Vi trængte til at få vores»selvstændighed«, siger Jens-Ulrik Rype og fortsætter: - Fra at have en lille prototype, en bordmodel, har vi bygget et pilotanlæg, så vi nu kan køre pilotforsøg på egne faciliteter. REED-teknologien I REED holdes fermenteringsvæske og base adskilt vha. ionbyttermembraner, dvs. de kommer aldrig i kontakt. Opbygningen af en REED-stak ses på figur 1. Over ionbyttermembranerne udskiftes syren med hydroxid. Idet der sendes strøm tværs gennem dette felt, vandrer alle negative ioner mod anoden og positive ioner mod katoden. Membranerne tillader kun negative ioner at passere, så de organiske syrer passerer og samles op i basen. I basen overtages strømtransporten af hydroxid, og sådan fortsætter transporten hele vejen gennem filtret. Syre skiftes ud med hydroxid, syre skiftes ud med hydroxid, osv. (figur 2). Figur 2. Ved at påtrykke et elektrisk felt over REED-modulet udbyttes anioner i procesvæsken med hydroxidioner fra basen. Den elektriske ladningstranport gennem basekammeret overtages primært af hydroxid, fordi hydroxid har en forholdsmæssig højere mobilitet/er omtrent 4-5 gange mere mobil end typiske organiske syreioner. Herved forlader syren kun i ringe grad basekredsløbet hvilket medfører høj strømeffektivitet (den del af ladningstransporten der fører til den ønskede syreseparation) og god udnyttelse af basens kapacitet. REED-teknologien benyttes typisk i forbindelse med separation af ioner fra særligt besværlige væsker, der pga. fouling ikke kan behandles med gængse elektromembranprocesser. Fordelen ved REED-processen er, at den ene af de to anionbyttermembraner, der er i kontakt med procesvæsken, kontinuert renses af de indstrømmende hydroxidioner (på figur 2 er det højre side). Dvs. foulinglaget opløses, og proteinerne destabiliseres. Der sker altså kun opbygning af et foulinglag på den ene af membranerne. Da REED-modulets opbygning er fuldstændig symmetrisk, løses foulingproblemet ved med jævne mel- dansk kemi, 86, nr. 9,

2 11 dansk kemi, 86, nr. 9, 2005

3 PROFILEN lemrum at ændre strømretningen produktion og rensning (CIP) foregår i én og samme cyklus. Fermenteringsapplikationer Fermentering inhiberes ofte af organiske syrer eller baser produceret af mikroorganismer. Det undgås som nævnt ved at fjerne den producerede syre eller base og samtidig kontrollere fermentor-ph uden at tilsætte neutralisator. Dermed øges mikroorganismernes eksponentielle vækstfase signifikant, uden at væksten inhiberes (figur 3). forlænge standardfermenteringer og kontinuert ekstrahere og separere produceret organisk syre. Afsaltning I mere komplicerede processtrømme med høje foulingtendenser kan anion- og kationudveksling kombineres. Det giver mulighed for at udveksle negativt og positivt ladede komponenter fra processtrømmen med f.eks. hydroxid og hydrogenioner. Da disse ioner kombineret danner vandmolekyler, er det overordnede resultat en udveksling af uorganiske eller organiske salte med vand. Føde- og drikkevareproduktion er besværlige processtrømme med et højt indhold af organisk materiale. Med teknologien kan man fjerne salte som calcium, natrium, nitrat, sulfat, chlorider etc. fra fødevarestrømme eller fjerne aminosyrer uden at fjerne mere komplekse komponenter som proteiner, sukkere, flavors, enzymer etc. Det er også muligt at udveksle kationer eller anioner med mere ønskelige produkter, f.eks. bytte calcium med natrium etc. Vi satser på få hovedområder - Det er vores mål, at vi rent arbejdsmæssigt går fra at leve af konsulentarbejde til at leve af vores anlæg. Der er masser af potentielle anvendelsesområder at arbejde videre med. Men vi er kun to personer, og vi er nødt til at fokusere på nogle hovedområder. Vi har besluttet os til i første omgang at fokusere på fermenteringen, siger Jens-Ulrik Rype og fortsætter: - Vi er teknikere og har ikke den nødvendige kommercielle baggrund. Vi må nok erkende, at vi leder efter nogle, der kan overtage den kommercielle side, supplerer Arvid Garde og Jens-Ulrik Rype uddyber: Figur 3. Mikroorganismers eksponentielle vækstfase. Den stiplede linje er ved brug af REED-teknologien. Kulturer Da fermentering omfatter hundredvis af mulige procesvariable og levende organismer, giver to identiske fermenteringer sjældent identiske resultater. Procesudbyttet begrænses af fermentorstørrelsen, hvor inhibitorer som f.eks. ethanol eller organiske syrer akkumulerer, indtil væksten stopper. Hver enkelt fermentering kræver forrensning, tilberedning og kvalitetskontrol. For at begrænse omkostningerne bruges der derfor store fermenteringsvolumener til at producere store batcher af mikroorganismer. Ved kontinuert ekstraktion af de producerede organiske syrer kan væksten af organiske syrekulturer forlænges signifikant. I fed-batch-fermentering, hvor koncentreret substrat tilsættes, og de producerede inhibitorer fjernes kontinuert, kan udbyttet mangedobles, hvilket øger fermentorens kapacitet mange gange. Metabolitter Mælkesyrebakterier benyttes ofte til metabolitproduktion, og fermenteringsudbyttet begrænses ofte af lactatproduktionen, der inhiberer den mikrobielle vækst og udtrykkelsen af metabolitter. Med REED-teknologien kan væksten og udtrykkelsen af metabolitter forlænges ved at vedligeholde et stabilt lactatniveau i fermentoren. Niveauet holdes selvom der kontinuert tilsættes frisk substrat, og celle- og metabolitkoncentrationen stiger. Derved stiger metabolitudbyttet signifikant for hver fermentering, og metabolitkoncentrationen mangedobles, dvs. man kan Figur 4. Arvid Garde ved REED-pilotanlægget. - Vi er ikke et øjeblik i tvivl om, at teknologien holder. Vi har arbejdet med området i 7-8 år, og vi brænder efter at se det i stor skala. Det er vores lille barn, vores ide. En af de svære ting som iværksætter er at give slip og overlade en del af styringen til andre. Det er vigtigt for os at have en åben dialog med kunderne. Vi kan ikke komme med den optimale løsning uden at kende de aktuelle processer til bunds. Både fødevare- og den farmaceutisk industri er interessante for Jurag Separation. Et af de større projekter, der arbejdes på, er at få teknologien GMP-certificeret, hvilket er vigtigt, når det drejer sig om fermenteringsapplikationerne. dansk kemi, 86, nr. 9,

4 BIOTEKNOLOGI Proteinkarakterisering ved massespektrometri - fra fødevarer til kræftforskning Af Mette Rindom Nørrelykke, Hans Peter Sørensen og Hans Christian Beck, Teknologisk Institut Viden om proteiner er vigtig i mange forskellige sammenhænge. Er det rekombinante protein korrekt udtrykt? Er proteinkilden i råvaren som forventet? Hvad er det for et protein, mælkesyrebakterien udskiller - og hvilken rolle spiller det? Hvilke proteiner interagerer med hinanden? Teknologisk Institut har gennem de sidste år har opbygget en ekspertise, der kan give svar på mange af de spørgsmål, der opstår i en forsknings- og udviklingsproces. For mange bioteknologiske virksomheder er viden om proteiner essentiel - lige fra opdagelsen af et potentielt medicinsk produkt til introduktionen af produktet på markedet. Og dele af fødevareindustrien har et stort behov for at kunne karakterisere proteiner, både i forhold til kvalitetskontrol, men også mhp. at give proteiner nye egenskaber og dermed skabe højværdiprodukter. Opbygning af proteiner Proteiner og deres funktioner i levende organismer er stærkt varierede. Nogle proteiner er samlet i strukturer som muskelfibre eller bundet i cellemembraner og fungerer som receptorer. Andre har friere bevægelighed og deltager i signalkaskader inde i cellerne eller som enzymer i biokemiske omsætningsveje, og endnu andre, f.eks. antistoffer, transporteres rundt i hele kroppen. Alle proteiner har dog byggestenene til fælles, nemlig de 20 forskellige aminosyrer, som kan sammensættes på så mange måder, at de tusindvis af proteiner, der er defineret af en organismes DNA, er unikke. Beslægtede arter kan have homologe proteiner, der er nogenlunde ens i opbygning og virkemåde. De indeholder ofte meget konserverede områder, hvilket betyder, at aminosyresekvensen stort set er uforandret. Mellem homologe proteiner er der typisk forskelle i bestemte områder. Nogle gange ikke ret meget - det kan være en udskiftning eller udeladelse af en aminosyre, eller det kan være en tilføjelse af en hel række af aminosyrer. Det er interessant rent evolutionsmæssigt, men kan også bruges direkte til at identificere proteiner ved sekvenssammenligning. Så ud over at kunne identificere et givet protein er det derfor også ofte muligt at afgøre, hvilken art det stammer fra, hvis man kender dele af proteinets aminosyresekvens. Karakterisering af proteiner Tidligere har det været et stort arbejde at identificere et protein. Der kunne foregå et stort karakteriseringsarbejde bestående af aktivitetsmålinger, størrelsesseparation og affinitetsoprensning. Det gik forud for sekventering af en mindre del af proteinet med Edman-degradering, hvor aminosyrer spaltes fra proteinet én efter én og bestemmes. Den opnåede aminosyresekvens kunne derefter sammenholdes med de relativt få kendte sekvenser, for at opnå identifikation af proteinet. I dag er mange organismers genom sekventeret og oversat til proteinsekvenser, som er tilgængelige i databaser. Dette, sammenholdt med udviklingen inden for massespektrometri, har betydet, at proteiner kan identificeres hurtigere end nogensinde [1]. Ud over at være hurtigere end tidligere anvendte metoder udmærker massespektrometri sig ved stor specificitet og brug af en meget lille prøvemængde og er derfor blevet»the method of choise«til identifikation af proteiner. Selvom man kan undgå en stor del af det tidligere karakteriseringsarbejde, er de klassiske proteinkemiske metoder imidlertid ofte relevante, når proteiner af særlig interesse skal isole- Figur 1. Eksempel på separation af proteiner ved todimensionel gelelektroforese. AAS ICP/MS UV-VIS LC/MS GC/MS FT-IR/NIR Ny LC-MS/MS? - Så er det også os! Gydevang Allerød dansk kemi, 86, nr. 9,

5 BIOTEKNOLOGI res og karakteriseres. Kromatografi, isoelektrisk fokusering og gelelektroforese bruges ofte til at separere proteiner før en massespektrometrisk identifikation. Isoelektrisk fokusering og gelelektroforese anvendes ofte i kombination, og kaldes todimensional-gelelektroforese (2DE). Ved 2DE separeres proteinerne først i forhold til deres isoelektriske punkt, hvorefter de separeres efter størrelse (figur 1). Forskning, der tager udgangspunkt i at sammenligne en celles eller en organismes totale proteinindhold (proteomet) under forskellige påvirkninger, anvender ofte 2DE til at sammenligne mængden af de enkelte proteiner udtrykt ved forskellige betingelser. Interessante protein-pletter på gelen kan dernæst skæres ud til massespektrometrisk analyse. Proteinidentifikation ved massespektrometri Identifikation af proteiner med massespektrometri indledes med en enzymatisk spaltning af proteinet til peptider (figur 2, side 16). Det gøres for at opnå mindre fragmenter i nogenlunde ensartet størrelse, som derefter ioniseres og analyseres i massespektrometret. Det hyppigst anvendte enzym er trypsin, der kløver efter aminosyrerne arginin og lysin. Den ønskelige størrelse på peptiderne er 7-15 aminosyrer, men større og mindre peptider kan også analyseres. De resulterende peptider introduceres i massespektrometret på to forskellig måder, enten ved»matrix assisted laser desorption«(maldi) eller ved»elektrospray-ionisering«(esi). Ved MALDI fordampes og ioniseres peptiderne ved beskydning med en laserstråle, hvorefter de detekteres i massespektrometret. Teknikken er hurtig, men giver kun information om, hvor store de analyserede peptider er - såkaldt»peptide mapping«. ESI adskiller sig ved, at peptiderne tilføres i en væskefase og ioniseres i spændingsfeltet ved indgangen til massespektrometret. ESI er en langsommere teknik, men giver også mulighed for at få information om aminosyrerækkefølgen af de enkelte peptider. På Teknologisk Institut karakteriseres proteiner med et massespektrometer med ESI, hvor der før instrumentet er tilkoblet en nanoflow HPLC. Herved separeres den komplekse peptidblanding på en nano-lc-kolonne med en indre diameter på 75 µm og ved flow på 250 nl/min før MS-analyse. Først bestemmes peptidernes masser (masse/ladningsforhold), og derefter fragmenteres de ved tandem-massespektrometri (MS/MS). Det resulterer i forskellig størrelse af peptidfragmenter, som detekteres og samles til præcis information om peptidets aminosyresekvens. Med disse informationer kan proteinet identificeres ved søgning i sekvens-databaser med forskellige søgealgoritmer. Post-translatoriske modifikationer Ud over identifikation af de udvalgte proteiner er det relevant 15 dansk kemi, 86, nr. 9, 2005

6 BIOTEKNOLOGI Figur 2. Proteinidentifikation ved massespektrometri. (A) Den oprensede proteinblanding separeres ved gelelektroforese, 1D eller 2D. (B) Relevante gelbånd eller pletter udskæres og enzymbehandles (in-gel digestion). (C) Peptiderne ekstraheres og analyseres ved nano- LC og full-scan-ms og derefter ved tandemmassespektrometrisk analyse, hvor peptider udvælges til MS/MSanalyse. (D) Sekvensinformation fra MS/MS-spektre bruges til at søge i proteinsekvensdatabaser. (E) for identitet af proteinet. Figur 3. Proteomanalyse af torskemuskel der har været frosset ved -30 C i 3, 6 eller 12 måneder. Proteinet i cirklen er identificeret som tropomyosin, mens proteinerne i firkanterne er identificeret som aktinfragmenter. at se på de kemiske modifikationer. De tilføres ofte reversibelt til proteinet efter endt proteinsyntese, de såkaldte posttranslatoriske modifikationer (PTM). Typer af modifikationer omfatter bl.a. fosforylering, acetylering, methylering og glykosylering. Modifikationerne bidrager til yderligere at differentiere proteinerne efter proteinsyntesen og har bl.a. til formål at regulere deres funktion og aktivitet. PTM er essentielle, når det drejer sig Vakuumpumper Lavtrykskompressorer Sidekanalblæsere rtpumpsdk@rtpumps.com om f.eks. signaloverførsel i cellen, enzymaktivitet, hormonstimulering og regulering af cellevækst. Undersøgelser af PTM er derfor vigtige for forståelsen af en række cellulære processer. Massespektrometri er et naturligt værktøj til at analysere PTM [2]. En modifikation afsløres i MS/MS-spektret ved at den aminosyre, hvorpå modifikationen er placeret, opnår en masseforøgelse, svarende til den pågældende kemiske gruppe. Det kan være vanskeligt at måle, at et protein er modificeret, idet det ofte kun er en mindre del af den samlede mængde, der er modificeret. Derfor kan den modificerede fraktion opkoncentreres på forskellig måde inden massespektrometrisk analyse. Affinitetsoprensning er ofte benyttet. F.eks. kan fosfopeptider oprenses effektivt med Immobilized Metal Affinity Chromatography (IMAC) inden MS-analyse. Patenterbare resultater Ovennævnte teknikker anvendes i vores laboratorium til løsning af mange dansk kemi, 86, nr. 9,

7 BIOTEKNOLOGI forskelligartede problemstillinger, både i langvarige forskningsprojekter med virksomheder, sektorforskningen og universiteter, men også i korterevarende, rekvirerede ad hocopgaver. Der er mange forskellige eksempler på samarbejdsprojekter, der har ført til spændende, patenterbare resultater. Et samarbejde med en bioteknologisk virksomhed havde til formål at karakterisere overfladeproteiner fra mælkesyrebakterier. Disse bakterier indtages sammen med syrnede mælkeprodukter og har en helbredsfremmende, en såkaldt probiotisk effekt. Vha. bakteriernes specielle overfladeassocierede proteiner kan de hæfte sig til slimlaget i tarmen og giver dermed en ønskelig bakterieflora. Viden om disse proteiner muliggør en målrettet forskning i at øge den probiotiske effekt. En anden bioteknologisk virksomhed, der arbejder inden for kræftforskning, er interesseret i at kende en bestemt post-translationel modifikation på et protein. Denne modifikation har effekt på cancercellers levedygtighed, og resultaterne skal bruges til at udvikle ny medicin. Inden for fødevareforskningen har vi isoleret og karakteriseret skimmelhæmmende proteiner fra plantefrø. Disse proteiner er en naturlig del af spirende frøs forsvarsmekanisme mod netop skimmelsvamp, og det forretningsmæssige ønske er at kunne bruge disse proteiner som erstatning for nuværende konserveringsmidler. Proteinændringer i fisk Fryselagringsforsøg med fisk har vist tab af strukturelle og smagsmæssige egenskaber [3]. Danmarks Fiskeriundersøgelser har gennem flere år arbejdet med proteinkvalitet af fisk med en proteomics-orienteret vinkel for at forstå og imødegå kvalitetsændringer på proteinniveau. Ændringerne kan omfatte oxidation, krydsbinding eller nedbrydning af proteinerne. Viden, om hvilke proteiner, der ændrer sig, er vigtig for at kunne forstå mekanismen i kvalitetsændringen under lagring. I samarbejde med Teknologisk Institut er der identificeret flere proteiner, der ændrer mængde ved langtidsopbevaring, bl.a. aktin og tropomyosin, der stammer fra fiskens muskelvæv. I figur 3 ses udsnit af 2D-geler, hvor intensiteten af de markerede pletter angiver en ændring. Proteom-gelerne er lavet på Danmarks Fiskeriundersøgelser og analyseret af Inger V. H. Kjærsgård. En nærmere beskrivelse af proteomanalysen og MS/MS af torskeproteinerne er beskrevet i [4]. Fra forskning til kvalitetskontrol Karakterisering og identifikation af proteiner ved massespektrometri er relevant i mange forskellige discipliner, både på det klassiske proteinkemiske område, i den bioteknologiske forskning, men også i den fødevareteknologiske udviklingsproces. Anvendelsesområdet strækker sig fra forskning til kvalitetskontrol. adresser: Mette Rindom Nørrelykke: mette.rindom.norrelykke@teknologisk.dk Hans Peter Sørensen: hans.peter.sorensen@teknologisk.dk Hans Christian Beck: hans.christian.beck@teknologisk.dk Referencer 1. Lane, C.S. Mass spectrometry-based proteomics in the life sciences. Cell. Mol. Life Sci. 2005; 62: Mann, M., Jensen, O.N. Proteomic analysis of post-translational modifications. Nat. Biotech. 2003; 21: Mackie, I. M. The effects of freezing on flesh proteins. Food Rev. Int. 1993; 9: Kjærsgård, I.V.H., Nørrelykke, M.R., Jessen, F. Changes in cod muscle proteins during frozen storage revealed by proteome analysis and multivariate data analysis. Proteomics. Indsendt. 17 dansk kemi, 86, nr. 9, 2005

8