Molekylærgenetisk test af skovplanter

Transkript

1 Molekylærgenetisk test af skovplanter - undersøgelse af to nåletræarter Rapport over et projekt udført under Produktudviklingsordningen for Skovbruget og Træindustrien Ole K. Hansen Skov & Landskab, Københavns Universitet 2008

2 Indholdsfortegnelse Resumé... 2 Indledning... 4 Kontekst... 4 Plantemateriale og forædlingen af de danske skovtræer... 4 Overgangen til naturnær skovdrift kræver ekstra genetiske overvejelser... 5 Molekylærgenetisk test af skovplanter først nu en realistisk mulighed... 6 Udførte studier... 7 Undersøgelse af FP.621 ædelgran... 7 Klonfrøplantagen FP.621, C.E. Flensborg plantage... 7 Indsamling og spiring af frø i FP Alternative frøkilder af ædelgran... 9 Laboratoriearbejde - genotyping af kimplanter Analyse af data Resultater Undersøgelse af FP.601 japansk lærk Kåret klonfrøplantage med japansk lærk - FP.601, C.E. Flensborg plantage Indsamling og spiring af frø i FP Vurdering af hunblomstring i FP Alternativ frøkilde til japansk lærk Laboratoriearbejde Dataanalyser Resultater Samlet diskussion og konklusion på de to del-studier og projektet Tak Litteratur

3 Resumé Projektet har fokuseret på første led i trækæden fra skovplante til træprodukt det vil sig skovplanternes genetiske sammensætning. Specifikt har formålet været at belyse konkrete problemstillinger i forhold til brugen af frø fra klonfrøplantager, herunder emner som selvbestøvning, relative bidrag fra frøplantagernes kloner, genetisk diversitet samt fremmedbestøvning. I studierne er der anvendt DNA-markører, og fokus har været på de to nåletræarter ædelgran (Abies alba Mill.) og japansk lærk (Larix kaemferi (Lamp.)). Projektet har også sammenlignet den genetiske diversitet og selvbestøvning i de to klonfrøplantager med potentielle alternative frøkilder. Første delstudie var i FP.621, der indeholder 12 ædelgrankloner udvalgt i afkom af Lapos-proveniensen. Formålet med undersøgelsen var helt specifikt at: 1) Undersøge bestøvningsforholdene i FP.621 med 12 kloner, 2) Estimere den genetiske diversitet og hvordan den påvirkes af bestøvningsforholdene og 3) Sammenligne FP.621 med et realistisk alternativt frøkildevalg i forhold til den genetiske diversitet. Alternative undersøgte frøkilder var klonfrøplantagen FP.242 med 25 kloner som er udvalgt i proveniensen Mt. Gariglione, Calabrien og et importeret frøparti ligeledes fra Mt. Gariglione, Calabrien. Andet delstudie fandt sted i FP.601, der består af 10 kloner af Japansk lærk. Formålet var det samme som i delstudie 1. Den alternative frøkilde, der blev sammenlignet med, var den kårede frøavlsbevoksning F.410 Frøslev. Faderskabsanalyse og selvbestøvning Begge klonfrøplantager havde meget lidt indkommende pollen fra omgivelserne (pollenkontaminering) (1,4 % og 2,8 %), og selvbestøvningen var beskeden (4,7 % og 3,1 %). Sidstnævnte skyldes bl.a. en selektion mod selvbestøvede individer, der synes at være stærkere i japansk lærk end i ædelgran. I lærk fandtes der ingen tegn på, at der er flere selvbestøvede individer i sent spirende frø end i tidligt spirende frø. FP.621 (ædelgran) havde en meget skæv fordeling af fædrebidragene, hvor fire kloner (25 %) var fædre til 80 % af frøet. Ubalancen i faderbidraget i FP.621 med 12 kloner skabte dermed en beslægtedhed i frøhøsten, som man ville forvente at finde i en population med 4 til 5 individer, hvor alle bidrager ligeligt med pollen. 2

4 FP.601 (lærk) udviste en meget mere ligelig fordeling af fædrebidrag, og faderbidraget var faktisk mere ligefordelt end antallet af rameter. Klonvise forskelle i spiringsprocenter havde for begge arter kun lille indflydelse på den effektive populationsstørrelse. Inde i FP.601 (lærk) var der en betydelig og statistisk signifikant forskel mellem fædrebidragene i den vestlige og østlige del af frøplantagen. I FP.621 (ædelgran) var der også en signifikant forskel i fædrebidrag mellem de to indsamlingssteder (nord og syd), men generelt var billedet i de to grupper mere lig hinanden. For frøplantageforvalteren har nærværende studie derfor vist, at pollenskyen kan variere ganske betydeligt indenfor korte afstande. Genetisk diversitet Den observerede heterozygotigrad (H O ) var lige så stor i klonfrøplantagernes kloner og deres frøafkom, som i frø fra de alternative frøkilder. Negative værdier for Wrights fikseringsindeks F is i frøhøsten fra begge klonfrøplantager indikerede faktisk et lille overskud af heterozygoter, mens der var et lille underskud af heterozygoter i frøet fra de alternative frøkilder. Det afgørende spørgsmål for de to undersøgte klonfrøplantager synes derfor at være, om den genetiske bredde i sig selv er stor nok. Undersøgelserne gav indikationer om, hvor meget genetisk bredde der mistes ved at bruge klonfrøplantager med få kloner. Der var således ca. 25 % flere alleler i frøet fra F.410 end i frøhøsten fra FP.601, og at forskellen ikke blev større, skyldes i høj grad at den lille pollenkontaminering i FP.601 faktisk indførte mange nye alleler. I frøpartiet fra Mt. Gariglione var der 52 % flere alleler end i frøhøsten fra FP.621. Metodemæssige overvejelser Der er blevet skabt en betydelig knowhow om, hvordan sådanne tests laves bedst muligt. Der er i dag ingen tekniske forhindringer i at kunne foretage disse detaljerede faderskabsanalyser for stort set hvilken som helst nåletræart; at kunne udføre dem vil udelukkende bero på hvor mange ressourcer, der er til rådighed. Rutinemæssige undersøgelser af frøplantageafkom er stadig for ressourcekrævende at udføre, men der synes at være mange muligheder for at udnytte DNA-markører til forvaltning af genressourcer og ikke mindst frøplantager. 3

5 Indledning Projektet har fokuseret på første led i trækæden fra skovplante til træprodukt det vil sige skovplanternes genetiske sammensætning. Denne genetiske sammensætning er det udgangspunkt hele den øvrige skovdrift samt afledte produkter hviler på. Mere specifikt har projektet haft til formål, at belyse konkrete og relevante problemstillinger i forhold til brugen af plantematerialer fra klonfrøplantager, herunder emner som selvbestøvning, relative bidrag fra frøplantagernes kloner, genetisk diversitet samt fremmedbestøvning. Udover de håndgribelige problemstillinger har projektet også været et metodestudie, hvor det er forsøgt at implementere de nye DNA-teknikker i et slags kvalitetsberedskab, således at afkom fra danske klonfrøplantager til enhver tid kan kvalitetssikres. I projektet er der arbejdet med de to nåletræarter ædelgran (Abies alba Mill.) og japansk lærk (Larix kaemferi (Lamp.)). De to træarter er valgt fordi de er potentielt vigtige træarter i naturnær skovdyrkning, som forventes indført i store dele af dansk skovbrug i de kommende år. Desuden knytter der sig en specifik aktuel problemstilling til ædelgran, hvor der pt. ikke er nogen kårede klonfrøplantager der producerer frø i Danmark. Kontekst Plantemateriale og forædlingen af de danske skovtræer Gennem årtier er der arbejdet systematisk med at tilvejebringe selekteret plantemateriale med forbedrede egenskaber til dansk skovbrug. Målrettet forskning i forbindelse med forædling og fremavl har således frembragt et genetisk set forbedret materiale. Fokus har for de fleste arter været på sundhed og tømmerkvalitet. Kommerciel opformering (fremavl) af dette forædlede materiale er hovedsagligt baseret på anlæg af klonfrøplantager, dvs. podning af udvalgte træer (genotyper/kloner), som plantes på velegnede arealer og benyttes til frøavl. Sådanne frøplantager har globalt og nationalt vist sig som den mest omkostningseffektive måde at producere forædlet skovtræfrø på, og er grundpillen i hele den danske indsats for at forbedre skovenes produktion gennem forædling. 4

6 Erfaringer fra både Danmark og udlandet har imidlertid vist, at det er værdifuldt at foretage en genetisk kvalitetskontrol af frø fra frøplantager (eks. Hansen et al. 2003), da en række forhold ikke umiddelbart kan kontrolleres af frøavleren. I forhold til at undgå mislykkede kulturanlæg pga. indavlet plantemateriale, samt generelt sikre den genetiske bredde i bevoksningerne, spiller to forhold en central rolle: 1) evnen til at selvbestøve og 2) de enkelte kloners relative bidrag til afkommet. 1) Selvbestøvning har i en lang række nåletræarter vist sig at have skadelig effekt i form af indavlsdepression med mindre vækst og højere dødelighed (Sorensen 1999). Risikoen for selvbestøvning stiger jo færre kloner der findes i frøplantagerne, og det antal af kloner man som minimum skal kræve i en kåret frøkilde har været debatteret i årtier. 2) Klonerne relative bidrag er vigtig fordi det påvirker forædlingsgevinsten, men også fordi det influerer på frøpartiets genetiske diversitet. Diversitet er i stigende grad en vigtig parameter, når der skal vælges mellem frøkilder (Ditlevsen & Kjær 2005) Mere viden om diversiteten i frøkilder i forhold til antal kloner kan derfor være afgørende for brug af de forædlede få-klons frøkilder som diversitetsmæssigt ligger på grænsen af det tilrådelige, hvilket gælder for flere af de eksisterende danske kårede klonfrøplantager. I projektet er det også søgt at sammenligne den genetiske diversitet og selvbestøvningen i de to undersøgte klonfrøplantager med de alternativer der ellers måtte være. Typisk vil disse bestå af en importeret frøkilde fra udenlandske naturbevoksninger eller en dansk frøavlsbevoksning. Overgangen til naturnær skovdrift kræver ekstra genetiske overvejelser Når en kultur etableres rækker plantevalget år frem nogle gange længere, og det er derfor vigtigt at det benyttede materiale lever op til de genetiske forventninger. Ved at forhindre indavlede/genetisk snævre skovplanter i at blive plantet ud i skoven kan nogle typer af mislykkede kulturer potentielt undgås (eks. 5

7 pga. dødelighed og utrivelighed), og billigere kulturanlæg på ejendomsniveau dermed opnås. I de senere år er naturnær skovdrift blevet stadig mere aktuelt i dansk skovbrug (eks. Larsen 2005), og Danmarks nationale skovprogram fra 2002 foreskriver at alle Skov og Naturstyrelsens skovarealer skal overgå til naturnær skovdrift (Skov- og Naturstyrelsen 2002). Den senere handlingsplan for dette skift i driftsform fastslår at de naturnære driftsprincipper vil være implementeret på hovedparten af arealet allerede i 2012 (Skov- og Naturstyrelsen 2005). I forbindelse med overgangen til naturnær skovdrift, hvor vedvarende skovdække og naturlig foryngelse er kerneelementer, bør spørgsmålet om genetisk diversitet i det anvendte plantemateriale have ekstra fokus. Ved kontinuert naturlig foryngelse vil der ikke, modsat traditionelt ren-afdrift skovbrug, være muligt at 'skifte' det genetiske plantemateriale ud gennem nyplantning. Det er med andre ord ekstra vigtigt at der benyttes optimalt, kvalitetssikret plantemateriale når der indbringes nye arter og frøkilder i bevoksningerne. Specielt er det vigtigt at have fokus på den genetiske bredde af plantematerialet, og om der er stor selvbestøvning i frøkilden. Hvis en træart/frøkilde har meget selvbestøvning vil der allerede i etableringsfasen være skabt grobund for fremadskridende indavl. Dels er nogle af individerne allerede fra start indavlet, dels kan frøkilden som har udvist selvbestøvning i klonfrøplantagen, fortsætte indavlen når den selvforynges - enten via selvbestøvning eller gennem krydsning mellem allerede beslægtede individer (eks. fuldsøskende fra frøplantagen). Både japansk lærk og ædelgran er gode til at selvforynge sig, er udpeget som robuste kulturtræarter, og er potentielt vigtige træarter i naturnær skovdyrkning. Samtidig er der specielle forhold der gør dem særligt relevante i forhold til ovenstående problemstilling disse er beskrevet under de specifikke studier. Molekylærgenetisk test af skovplanter først nu en realistisk mulighed Mange af vores forædlede frøkilder i både nål og løv har et lavt antal kloner, hvilket har givet grund til bekymring og kan i praksis stå i vejen for kåring og brug af disse. Først med fremkomsten af meget variable DNA-markører er det blevet muligt at 6

8 undersøge hvilken betydning antallet af kloner rent faktisk spiller for graden af selvbestøvning og den genetiske diversitet. I årevis har man i det forstgenetiske miljø, udenlands såvel som i Danmark, diskuteret hvor genetisk brede frøkilder skulle være, altså hvor få genetiske enheder (eks. kloner i en frøplantage) der kan accepteres i en frøkilde (Madsen et al. 1998). Nu kan man konkret få syn for sagen hvor stor er den genetiske indsnævring rent faktisk i en klonfrøplantage, og i hvor høj grad selvbestøver klonerne egentlig sig selv. Udførte studier Undersøgelse af FP.621 ædelgran For ædelgran (Abies alba Mill.) findes der p.t. ikke nogen kårede frøplantager i Danmark. HedeDanmark Skovfrø har ansøgt om at få kåret FP.621 der indeholder 12 kloner udvalgt i afkom af Lapos-proveniensen baseret på afprøvning i Danmark. Kåringsudvalget i Danmark har ønsket at få sikkerhed for at det relativt lille antal kloner ikke medfører høj grad af selvbestøvede individer og deraf følgende ringe vækst. HedeDanmark havde derfor anlagt afkomsforsøg, men disse er under uheldige omstændigheder blevet ødelagt. De nye DNA-teknikker var dermed den eneste mulighed for at få FP.621 undersøgt for selvbestøvning og/eller genetisk indsnævring, en undersøgelse der kan skabe vidensgrundlag for en eventuel kåring af frøplantagen. Formålet med undersøgelsen var helt specifikt at: 1) Undersøge bestøvningsforholdene i FP.621 med 12 kloner. 2) Estimere den genetiske diversitet og hvordan den påvirkes af bestøvningsforholdene. 3) Sammenligne FP.621 med et realistisk alternativt frøkildevalg i forhold til den genetiske diversitet. Klonfrøplantagen FP.621, C.E. Flensborg plantage FP.621 ejes af Hedeselskabet og er beliggende i C.E. Flensborg plantage ca. 20 km nord for Viborg. Frøplantagen blev etableret i 1968 og består af 12 kloner af den rumænske proveniens Lapus fra de vestlige Karpater (47 38N, 23 50E 700 m.o.h.). 7

9 De 12 orteter blev udvalgt i et proveniensforsøg som ikke eksisterer mere (Løfting 1978). Selektionsstyrken var svag, da der kun var et begrænset antal træer i forsøget. Ved etableringen i 1968 blev der plantet 389 rameter på ca. 5 x 4,5 meter. Ved frøhøst i efteråret 2005 var antallet af rameter faldet til 263 via tynding og naturlig afgang se figur 1, tabel 1 og figur 2 (panel A) for klonvis fordeling af rameter. Indsamling og spiring af frø i FP.621 Fra alle 12 kloner blev der høstet frø på hver to rameter (ramet = samme individ (klon) podet op) dvs. på 24 træer. Der blev udvalgt frøtræer i to grupper: en nordlig og en sydlig, i hver gruppe optrådte hver af de 12 kloner én gang (figur 1) N Nordlige gruppe meter Sydlige gruppe Figur 1. Skitse over klonfrøplantagen FP.621 ædelgran der indeholder 263 rameter fra 12 forskellige kloner. Klonnumre med en cirkel omkring viser placeringen af de 24 træer hvor på der blev høstet frø (modertræer). 8

10 Opdelingen i to grupper havde til hensigt at undersøge om der er forskel i faderbidraget alt efter hvor i frøplantagen der indsamles frø. Grupperingen nord-syd skete for at optimere afstanden mellem de to grupper, idet frøplantagen er ret smal i vest-øst-gående retning. Der blev taget 5-6 kogler fra hvert frøtræ og disse blev lagt i hver deres frøpose til videre forarbejdning, dvs. tørring, klængning og oprensning af frø. Denne del blev udført af HedeDanmarks frøsektion. Fra hvert frøtræ blev der taget en nåleprøve, ligesom der blev taget nåleprøver fra yderligere 2 rameter fra hver klon. Der var således 4 nåleprøver fra hver klon i alt, og disse skulle i sagens natur gerne have samme genotype. To hundrede frø fra hvert frøtræ blev nøjagtig optalt, opfugtet 24 timer i vand og efterfølgende stratificeret i spirekasser ved 5 ºC indtil spiring. De første 20 fremspirende kimplanter fra hvert frøparti blev skåret i stykker og frosset ned for senere ekstraktion af DNA. Alternative frøkilder af ædelgran Kåret ædelgran klonfrøplantage FP.242 endnu ikke i produktion Klonfrøplantagen FP.242 er beliggende ved Hald Hovedgård syd for Viborg og indeholder 25 kloner som er udvalgt i proveniensen Mt. Gariglione, Calabrien (1600 m.o.h.), der var en del af en proveniensforsøgsserie (Larsen 1983). Som udgangspunkt for udvælgelsen var der kun få træer til rådighed, så effekten af plustræudvalget forventes at være minimal. Frøplantagen skal derfor mere ses som en udnyttelse af en proveniens som har klaret sig godt i Danmark (Larsen 1983). Baseret på disse erfaringer blev frøplantagen kåret af kåringsudvalget i 2006, men det vil vare 4-5 år før den begynder at producere frø i kommercielle mængder. Importeret ædelgran frøparti Mt. Gariglione Det undersøgte frøparti stammer fra Mt. Gariglione, Calabrien (1600 m.o.h.) altså fra det samme område som klonerne FP.242. I dag er denne proveniens et oplagt valg for en dansk skovbruger der ønsker at plante ædelgran (Larsen & Møller 1997). 9

11 Laboratoriearbejde - genotyping af kimplanter Alle DNA-ekstraktioner i projektet blev udført med DNeasy Plant Mini Kit fra QIAGEN. Genotyping af alle individer skete via PCR med QIAGEN Multiplex kit. PCR protokollen fulgte de givne standard-betingelser for multiplex kittet og blev udført på en Perkin Elmer termocycler (model 2700). Selve bestemmelsen af genotypingen skete på Skov & Landskabs CEQ 2000XL Fragment analysis system. Ved genotyping af en kimplante forstås, at der for hver DNA-markør bestemmes, hvilke alleler kimplanten har. Alleler er de forskellige varianter, som en DNA-markør kan have, og mikrosatellitter, som er en type af DNA-markører, har oftest mange forskellige. En enkelt kimplante kan dog maksimalt have to alleler, idet de ligesom mennesker har to parallelle områder, kaldet loci, for hvert sted i den samlede mængde DNA. Således har nåletræer normalt 12 kromosompar og 12 x 2 = 24 kromosomer, mens mennesket har 46 kromosomer (22 x kønskromosomer). Et træ der har samme allel i begge loci siges at være homozygot. Har det to forskellige alleler, er det heterozygot. Andelen af heterozygote individer kaldes heterozygotigraden, og fortæller noget om den genetiske diversitet i en gruppe af individer. Jo højere heterozygotigrad, desto større genetisk diversitet. Som mål for den genetiske diversitet i en gruppe individer kan man også anvende det totale antal af forskellige alleler (=varianter) for en DNA-markør. Ved at kombinere genotypen for forskellige markører bliver det mere og mere usandsynligt, at to individer har den samme genotype for alle markører. Dette kaldes genetiske fingeraftryk og kan udnyttes til at lave faderskabssager; eksempelvis bestemme hvem som er faderen til et frø, som det er gjort i nærværende studier. Der blev ekstraheret DNA fra i alt 467 kimplanter fra frøet høstet i FP.621, fra nåleprøver af 48 rameter i FP.621 (inklusive de 24 hvorpå der blev høstet frø), fra nåleprøver af de 25 kloner i FP.242 (1 ramet per klon) samt fra 29 kimplanter spiret fra Mt. Gariglione frøpartiet. Disse i alt 569 individer blev efterfølgende genotypet med 5 DNA-markører (såkaldte mikrosatellitter) nemlig markørerne NFF3, NFF7, NFH3 og NFH15 som oprindeligt er udviklet i nordmannsgran (Hansen et al. 2005) og markøren SF78 som er udviklet for almindelig ædelgran (Cremer et al. 2006). 10

12 Analyse af data Forskelle i spiringsprocenter for frøpartierne fra de 12 kloner i FP.621 blev testet ved variansanalyse (SAS version 9.1). Fædre til kimplanterne blev fundet ved faderskabsanalyse i softwaret CERVUS 3.0 (Marshall et al. 1998; Kalinowski et al. 2007). Kimplanter hvor der ikke var et far-match med kloner i frøplantagen blev antaget at være resultatet af udefra kommende pollen (pollenkontaminering). Det relative bidrag fra hver klon til den samlede pulje af faderbidrag (p i ) blev beregnet ud fra faderskabsanalysen. Effekten af et lille antal kloner i frøplantagen og/eller ubalanceret fædrebidrag blev kvantificeret ved det såkaldte statusnummer (N S ) (Lindgren & Mullin 1998) som afspejler opbygningen af slægtskab i frøhøsten (ligning 1) 2 [1] N s = 1/Σ p i hvor Σ p 2 i er summen af de kvadrerede fædrebidrag (p i ). På lignende vis blev statusnummeret (N S ) brugt til at kvantificere effekten af forskelle i spiringsprocenter på den effektive populationstørrelse. Forskelle mellem de to indsamlingssteder i frøplantagen (nord og syd) med hensyn til fordelingen af fædrebidrag blev statistisk testet ved en 2 x 12 multinominalfordelingstest. Den genetiske diversitet af de 12 kloner i FP.621, frøet (kimplanterne) fra FP.621, de 25 kloner i FP242 og frøpartiet fra Mt. Gariglione blev evalueret ved antallet af alleler i hver markør (A), observeret heterozygotigrad (H O ) og forventet heterozygotigrad (H E ) (Nei 1987). Disse mål blev beregnet i softwaret GDA v. 1.1 (Lewis & Zaykin 2001), som også gav estimater for Wrights fikseringsindeks F is (Weir and Cockerham 1984). Sidstnævnte, (F is ), er et mål for den reduktion i den observerede heterozygotigrad der kan ske, hvis ikke alle individer i en population formerer sig tilfældigt med hinanden (Hartl & Clark 1997). For eksempel at der sker større selvbestøvning end forventet ud fra individets andel af pollenskyen, fordi individets pollen har en tendens til at være tættere på individet selv end pollen fra andre individer. Wrights fikseringsindeks ligger i intervallet 0 (ingen afvigelse fra tilfældig formering) til et teoretisk maksimum på 1, skønt i praksis er det observerede indeks meget mindre end 1, selv i populationer med stor afvigelse fra tilfældig formering. Den statistiske signifikans af F is estimaterne blev testet ved bootstrapping over loci, hvor bootstrapping er en statistisk test der 11

13 baserer sig på gentagne udtag af stikprøver fra de observerede data (eks. Manly 1997). Det kan være problematisk at sammenligne antallet af alleler (A) i stikprøver af forskellig størrelse, idet der alt andet lige vil være flere alleler i en stor stikprøve end i en lille. En statistisk metode kaldet rarefaction (eks. El Mousadik & Petit 1996) kan bruges til at beregne, hvor mange alleler der ville optræde, hvis stikprøven var mindre, end den rent faktisk er. På den måde kan man for en gruppe af frøkilder beregne antallet af alleler, hvis de alle havde samme stikprøvestørrelse nemlig antallet af individer i den frøkilde med færrest individer. Denne metode blev brugt i softwaret HP-RARE 1.0 (Kalinowski 2005) til at beregne antallet af alleler korrigeret for stikprøvestørrelse (A(rar)). Endelig blev Fishers eksakte test anvendt til at teste for forskelle i observeret heterozygotigrad (H O ) mellem de fire ædelgran populationer det skete i SAS (version 9.1). Resultater Faderskabsanalyse og selvbestøvning Ud af 467 kimplanter kunne der findes en far blandt de 12 kloner i FP.621 for 461 uden at der var noget mis-match mellem far og kimplante. Seks kimplanter (1.4 %) havde ét eller typisk flere mis-match mellem sin egen genotype og den mest sandsynlige far i frøplantagen, og de 6 individer havde flere alleler (varianter af DNAmarkører) som ikke blev fundet i andre kimplanter overhovedet. Disse 6 kimplanter antages derfor at være resultatet af pollen, der er kommet ind fra de omgivende skovarealer (pollenkontaminering). Resultatet af hele faderskabsanalysen er vist i detaljer sammen med den klonvise fordeling af rameter i tabel 1, og hovedresultater er yderligere illustreret i figur 2. Et slående resultat er den meget skæve fordeling af fædrebidrag, hvor nogle kloner er far til rigtig mange afkom, mens andre næsten ikke har leveret pollen til nogen kimplanter. Klon A6 og A7 har kun givet pollen til hver ét afkom mens klon A9 er far til mere end 37 % af kimplanterne (figur 2 panel A). Sammen med klon A1 er de to 12

14 fædre til 57 % af afkommet. De to kloner er blandt dem med flest rameter, men selv klon A9 med det største antal rameter, udgør kun 11.8 % af træerne i FP.621. Den skæve fordeling af fædrebidrag gav et statusnummer på (N S ) = 4,6 hvilket vil sige at FP.621 opfører sig som en frøplantage med 4,6 kloner hvor alle bidrager lige meget til afkommet. Antallet af fædre til hver klons frø (når der ses bort fra pollenkontaminering) kan opgøres direkte fra tabel 1 og var i gennemsnit 6,9 (interval 5-9). Tyve ud af de 467 frø var resultatet af bestøvning af en klon med sin egen genotype, hvilket giver en selvbestøvningsrate på 4,7 %. Andelen af selvbestøvede frø i forhold til det totale faderbidrag siger noget om den selektion der er imod selvbestøvning. Eksempelvis har klon A3 2,6 % selvbestøvede frø men er far til 6,8 % af det totale antal afkom (tabel 1). Selvbestøvning i A3 er dermed kun 38 % så succesfuld som udkrydsning. Dette forhold giver dog kun mening hvis den enkelte klon samlet set har et faderbidrag. I FP.621 var den gennemsnitlige andel af selvbestøvede frø i forhold til det totale faderbidrag for klonerne A1, A3, A4, A8, A9 og A10 59 % (interval %). De resterende 6 kloner blev ikke inkluderet i beregningerne da deres fædrebidrag var minimale. Faderskabsanalysen viste også at kloners faderbidrag kan variere en del afhængig af hvor frøtræet står placeret. Eksempelvis havde klon A9 28,3 % af afkommet i den nordlige del af FP.621 mod 46,1 % i den sydlige del (figur 2 panel B). Testen for forskelle mellem fædrebidrag i nord og syd skete ved hjælp af Monte Carlo simulering og gav et 99 % konfidensinterval for p-værdien på [0,000 0, ], hvilket indebærer at der er højst signifikant forskel mellem fædrebidragene i de to ender af frøplantagen. 13

15 Faderskab i procent (%) B Procentdel af afkom - Nord Procentdel af afkom - Syd Faderskab i procent (%) A1 A A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 Procentdel af rameter i frøplantagen Procentdel af afkom - hele frøplantagen A10 A11 A12 Kontam. A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 Faderbidrag FP621 A. alba A10 A11 A12 Kontam. Figur 2. Klonvise faderbidrag (= pollenbidrag) til afkommet i FP.621 ædelgran angivet i procent. A) Fordeling af rameter og faderbidrag i hele frøplantagen (467 frø). B) Faderbidrag til afkommet i den nordlige og sydlige del af frøplantagen (nord: 235 frø; syd: 232 frø). Kontam.= pollen der er kommet ind i frøplantagen fra omgivelserne. 14

16 Tabel 1. Fordelingen af fædre (rækker) i FP621 Abies alba klonfrøplantagen. Frø blev indsamlet på alle 12 kloner (kolonner= modertræer). Den sidste række angiver spireprocenten for frøene fra de forskellige kloner. Resultaterne er givet i procent. De tal der står med fed angiver procentdelen af selvbestøvede individer i frø høstet på den pågældende klon. Kloner % rameter* A1- A2- A3- A4- A5- A6- A7- A8- A9- A10- A11- A12- Gns. A1-9,4 15,8 26,3 7,7 5,0 15,8 15,8 32,5 18,9 35,0 12,5 30,8 12,5 19,6 A2-8,7 2,6 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 5,0 0,0 0,0 0,0 0,0 2,5 0,7 A3-7,2 10,5 5,3 2,6 2,5 18,4 5,3 0,0 2,7 7,5 12,5 7,7 15,0 6,8 A4-10,6 7,9 13,2 7,7 10,0 7,9 7,9 25,0 5,4 30,0 12,5 7,7 0,0 12,3 A5-6,8 5,3 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,5 A6-6,8 0,0 2,6 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,2 A7-7,5 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 2,5 0,0 0,0 0,0 0,2 A8-7,2 10,5 0,0 12,8 27,5 10,5 10,5 12,5 16,2 12,5 15,0 10,3 0,0 12,6 A9-11,7 42,1 31,6 64,1 45,0 34,2 52,6 10,0 51,4 10,0 45,0 23,1 55,0 37,2 A10-10,6 2,6 15,8 2,6 5,0 5,3 2,6 5,0 2,7 2,5 0,0 15,4 12,5 5,4 A11-6,4 0,0 5,3 0,0 2,5 0,0 0,0 7,5 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 1,4 A12-7,2 2,6 0,0 0,0 2,5 5,3 2,6 2,5 0,0 0,0 0,0 2,6 2,5 1,6 Kontam. - 0,0 0,0 2,6 0,0 2,6 2,6 0,0 2,7 0,0 2,5 2,6 0,0 1,4 Sum 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 Spire % for frø * Den procentvise andel som klonernes rameter udgør af det samlede antal rameter (=træer) i klonfrøplantagen. Kontam. = pollenforurening, dvs. pollen som er kommet ind i klonfrøplantagen udefra. Spireprocenten er et gennemsnit af det nordlige og sydlige frøparti.

17 Genetisk diversitet Mål for den genetiske diversitet og Wrights fikseringsindeks F is er givet i tabel 2. Niveauerne for forventet heterozygotigrad (H E ) og observeret heterozygotigrad (H O ) er generelt i god overensstemmelse. Det tyder på at de anvendte markører er pålidelige uden såkaldte nul-alleler, hvor tilstedeværelsen af sidstnævnte normalt ville betyde at man (fejlagtigt) ville observere et overskud af homozygoter. Wrights fikseringsindeks F is siger noget om overskud eller underskud af heterozygoter i populationen i forhold til en population hvor der hersker såkaldte Hardy-Weinberg proportioner. Disse indebærer blandt andet at bestøvning er fuldstændig tilfældig. En positiv værdi for F is indikerer et overskud af homozygoter som eks. kunne være fremkommet ved selvbestøvning. Det ses af tabel 2, at der er et signifikant overskud af homozygoter i Mt. Gariglione (F is = 0,061) mens der er et signifikant underskud i kimplanterne fra FP.621 (F is = -0,022). I begge tilfælde er værdierne dog meget tæt på 0. Generelt var der ikke signifikant forskel mellem frøkilderne med hensyn til den observerede heterozygotigrad (H O ); p-værdierne lå i intervallet 0,10 0,72. For dette diversitetsmål var der altså ingen forskel mellem eks. klonfrøplantagerne og det importerede frøparti. Antallet af alleler (A) er klart stigende med stikprøvestørrelsen (antallet af genotypede individer i frøkilden), hvilket som tidligere nævnt er forventeligt. Den gennemsnitlige værdi for (A) er 11,4 i FP621 (n=12), mens de tilsvarende værdier er 16,8 og 20,0 i henholdsvis FP.242 (n=25) og Mt. Gariglione (n=29) (tabel 2). Dette svarer til en stigning på 47 % (FP.242) og 75 % (Mt. Gariglione) i antallet af alleler for de to alternative frøkilder. Forskellen i (A) mellem klonerne i FP.621 og afkommet fra selv samme var i gennemsnit 13,2-11,4 = 1,8 alleler, hvilket er en stigning på 16 %. Denne stigning skyldes den indkommende pollen (pollenkontaminering), og det er måske mere korrekt at sammenligne tallene for (A) i frøhøsten med dem i de alternative frøkilder. I så fald bliver forskellen i antallet af alleler 52 % mellem frø frøet fra FP.621 og Mt. Gariglione. 16

18 Hvis antallet af alleler korrigeret for stikprøvestørrelse (A(rar)) anvendes i stedet for (A), så er differencen imellem frøhøsten i FP.621 og frøet fra Mt. Gariglione på 57 % flere alleler i sidstnævnte (gns kontra 8.3). Som indikeret ovenfor, så kan det være svært at sammenligne genetisk diversitet i kloner fra klonfrøplantager med frø fra frøavlsbevoksninger eller naturbestande, på grund af indkommende pollen fra et yderligere (ukendt) antal individer. Metoden rarefaction gør det dog simpelt at sammenligne den iboende genetiske diversitet i de 12 kloner i FP.621 med den i de 25 kloner i F.242. Denne sammenligning viste at den genetiske diversitet i FP.242 klonerne fra Calabrien har ca. det samme niveau, gennemsnitlig (A(rar))= 12,2, som klonerne i FP.621 af rumænsk oprindelse med gennemsnitlig (A(rar))= 11,4. Tabel 2. Diversitetsmål for de forskellige ædelgran frøkilder baseret på 5 DNA-markører. n = stikprøvestørrelse, A = antal alleler per polymorfe locus, H E = forventet heterozygotigrad, H O = observeret heterozygotigrad, F is = Wrights indavslkoefficient, A(rar) = antal alleler korrigeret for forskelle i stikprøvestørrelse via rarefaction, P-værdi H O = p-værdi fra Fishers eksakte test. DNA-markør Frøkilde n A H E H O F is A(rar) P-værdi H O NFH15 FP621 kloner ,873 0,750 0, ,10 FP621 frøhøst ,840 0,880-0,048 7,8 FP242 kloner ,912 1,000-0,099 10,2 Mt. Gariglione - frøhøst ,923 0,897 0,029 12,2 NFF3 FP621 kloner ,801 0,750 0, ,72 FP621 frøhøst ,784 0,782 0,003 5,0 FP242 kloner ,822 0,720 0,126 6,7 Mt. Gariglione - frøhøst ,803 0,724 0,100 7,3 NFF7 FP621 kloner ,946 1,000-0, ,44 FP621 frøhøst ,882 0,893-0,013 9,7 FP242 kloner ,940 0,880 0,065 13,4 Mt. Gariglione - frøhøst ,940 0,828 0,121 13,1 NFH3 FP621 kloner ,924 0,917 0, ,44 FP621 frøhøst ,827 0,835-0,010 9,2 FP242 kloner ,938 0,920 0,020 14,9 Mt. Gariglione - frøhøst ,953 0,931 0,023 15,1 SF78 FP621 kloner ,884 0,917-0, ,60 FP621 frøhøst ,884 0,921-0,042 9,7 FP242 kloner ,951 1,000-0,053 15,6 Mt. Gariglione - frøhøst ,967 0,931 0,038 17,5 Generelt FP621 kloner 12 11,4 0,886 0,867 0,022 11,4 gennemsnit FP621 frøhøst ,2 0,843 0,862-0,022* 8,3 FP242 kloner 25 16,8 0,912 0,904 0,009 12,2 Mt. Gariglione - frøhøst ,917 0,862 0,061* 13,0 * Værdien for F is var signifikant forskellig fra 0. 17

19 Spiring Den gennemsnitlige spiringsprocent for alle frøpartier var 50 %. De individuelle frøpartiers spiringsprocenter lå i intervallet 12.5 % (klon A1 i den nordlige gruppe) til 72,5 % (klon A11 i den sydlige gruppe) se tabel 1 for klongennemsnit. Variansanalyse viste en signifikant forskel mellem kloner i spiringsprocent (p = 0,0036). Klon A9 og især klon A1 havde lavere spiringsprocenter end de andre kloner (tabel 1). Det beregnede statusnummer (N S ) baseret på spiringsprocenter gav (N S ) = 11,4. Sammenlignet med antallet af forældrekloner er det kun en reduktion i den effektive populationsstørrelse på 5 %, og viser at de observerede forskelle i spiringsevne kun skaber en lille ubalance i frøhøsten. 18

20 Undersøgelse af FP.601 japansk lærk Japansk lærk (Larix kaempferi (Lamb.)) har en relativt begrænset anvendelse i dansk skovbrug i dag. Det skyldes ikke mindst den udbredte brug af hybridlærk (Larix x eurolepis), som har vist overlegen vækstkraft sammenlignet med de to rene arter: Europæisk lærk (Larix decidua) og japansk lærk (Keiding 1980; Roulund 2007). Hybridlærkefrø produceres normalt i klonfrøplantager med ganske få kloner af hver af de rene arter. Ved naturlig foryngelse af plantemateriale fra dette frø kan afkommet således have meget lav genetisk diversitet og stor risiko for indavl. Ydermere kan udviklingen af den naturlige foryngelse fra hybridlærk være uforudsigelig på grund af udspaltning til de rene arter. På grund af disse potentielle problemer relateret til hybridlærk forventes japansk lærk at spille en stigende rolle i det naturnære skovbrug, og mange steder at erstatte hybridlærken. Der findes i dag 3 kårede frøplantager af japansk lærk i Danmark. De indeholder dog alle få kloner, og i nærværende projekt er det valgt at undersøge FP601, der indeholder 10 kloner, og som længe har været en af de væsentligste frøkilder for arten i Danmark. Ligesom i tilfældet med FP.621 ædelgran var det specifikke formål med undersøgelsen derfor: 1) Undersøge bestøvningsforholdene i FP.601 med 10 kloner. 2) Estimere den genetiske diversitet og hvordan den påvirkes af bestøvningsforholdene. 3) Sammenligne FP601 med en realistisk alternativ frøkilde i forhold til den genetiske diversitet. Kåret klonfrøplantage med japansk lærk - FP.601, C.E. Flensborg plantage FP.601 befinder sig også i C.E. Flensborg plantage og har længe været én af de væsentligste frøkilder for Japansk lærk i Danmark. Oprindeligt indeholdt den 13 kloner udvalgt i en vindeksponeret bevoksning ved Kongenshus hede, vest for Viborg. Bevoksningen mentes at være afkom fra frø direkte importeret fra Hokkaido, Japan, og formålet med anlæggelsen af frøplantagen var at producere plantemateriale af Japansk lærk som var specielt velegnet til den vestlige del af Danmark med megen vind (Brandt 1968). Frøplantagen er etableret i årene på et 2,2 ha stort areal, og klonerne blev plantet på ca. 4,5 x 3 meter med kun én klon per række se 19

21 figur 3 for en skitse af frøplantagen. I 1968 blev tre af klonerne tyndet væk efter en opgørelse af stammeform på såvel klonerne som afkom af disse (Brandt 1968). I dag er de 10 resterende kloner repræsenteret ved i alt 381 rameter se tabel 3 og figur 4 (panel A) for fordelingen af rameter mellem kloner. Klonnumre. Alle træer i en række er rameter fra den samme klon. N L13 L9 L1 L12 L10 L8 L11 L9 L4 L6 L3 L4 L8 L10 L11 L3 L13 L6 L1 L12 L4 L X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X Sampling af frø i den Sampling af frø i den X X X X X vestlige X X del af X X østlige del af X X X X X X X klonfrøplantagen X X X X klonfrøplantagen X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X Figur 3. Skitse over klonfrøplantagen FP.601 japansk lærk der indeholder 385 rameter fra 10 forskellige kloner. Klonnumre med en cirkel omkring viser placeringen af de 20 træer hvor på der blev høstet frø (modertræer). Skraverede rækker uden træer er den tidligere placering af de 3 kloner som er blevet hugget væk. Indsamling og spiring af frø i FP.601 På de 10 kloner blev der høstet frø på hver to rameter (20 træer i alt). Frøtræerne blev valgt i to grupper, en vestlig og en østlig gruppe, hver klon var repræsenteret én gang i hver gruppe (figur 3). Igen var formålet med de to grupper at undersøge forskelle i faderbidraget alt efter hvor i frøplantagen frøet høstes. Indsamlingen af 20

22 vest versus øst blev valgt da den mest fremherskende vindretning i Danmark er vest. Således kunne der f.eks. tænkes at være større pollenkontaminering i den vestlige side af frøplantagen. Koglerne blev holdt separat i frøposer til tørring og klængning. Fra hvert frøtræ plus yderligere én ramet fra hver klon blev der taget en nåleprøve. To hundrede frø fra hvert frøtræ blev nøjagtig optalt og opfugtet 24 timer i rindende koldt vand. For de to frøtræer af klon L9 var det dog kun muligt at få henholdsvis 57 og 100 frø. De opfugtede frø blev lagt i spirekasser og placeret ved stuetemperatur. Spiring startede efter 4-5 dage og de første 20 fremspirende kimplanter fra hvert frøparti blev skåret i stykker og frosset ned for senere ekstraktion af DNA (dog kom der kun 14 kimplanter fra den ene ramet af klon L9). Fra to kloner (L8 og L12) blev der taget yderligere 20 kimplanter fra hver af deres to rameter, dette var fra frø der spirede senere (kimplanter nr. 101 til 120 i hvert frøparti). Dette blev gjort for at teste, om der eventuelt var flere selvbestøvede individer blandt de sent spirende. Vurdering af hunblomstring i FP.601 Med henblik på at sammenligne faderbidraget med det potentielle moderbidrag til frøhøsten blev der foretaget en visuel vurdering af antallet af hunblomster (strobili) i juni På de første 10 rameter i hver række blev antallet af hunlige strobili vurderet til klasser der bruger en logaritmisk skala fra 1 til 9 (score 1= 0 strobili, 2=1-3, 3=4-15, 4=16-60, 5=61-250, 6= , 7= , 8= , 9= ) (Hubert Wellendorf, upubliceret). Vurderingen blev foretaget fra jorden. Alternativ frøkilde til japansk lærk Kåret frøavlsbevoksning F.410 Frøslev Den kårede frøavlsbevoksning F.410 Frøslev befinder sig i Frøslev plantage vest for Padborg og hører under Skov og Naturstyrelsen, Sønderjylland. Den er 2,1 ha stor og består hovedsagligt af materiale fra en anden kåret frøavlsbevoksning F.40d Sostrup Overskov. F.410 er et typisk alternativ for skovbrugeren, hvis hun ønsker at bruge en frøkilde af japansk lærk som ikke kommer fra en klonfrøplantage med få kloner. Et 21

23 andet alternativ kunne være F.783, ligeledes af Sostrup oprindelse, men kun F.410 er undersøgt her. Laboratoriearbejde DNA-ekstraktioner og genotyping blev udført med de samme metoder som beskrevet under ædelgran. Der blev ekstraheret DNA fra 388 kimplanter spiret fra FP.601, fra nåleprøver af 30 rameter i FP.601 (inklusive de 20 hvorpå der blev høstet frø) samt fra 40 kimplanter spiret fra F.410 Frøslev frøpartiet. De i alt 458 individer blev efterfølgende genotypet med 5 DNA-markører (mikrosatellitter): bclk189, bclk224, bclk253, bclk260 og bclk263 som er udviklet specifikt til japansk lærk (Isoda & Watanabe 2006). Dataanalyser Følgende analyser skete på samme måde som beskrevet under ædelgran: 1) analyse af forskelle i spiringsprocenter for frøpartierne fra de 10 kloner i FP.601, 2) faderskabsanalyse for kimplanterne, 3) beregning af statusnummer (N S ) for frøplantagen ud fra både faderskabsanalyse og frøspiring, 4) test af forskelle mellem de to indsamlingssteder i frøplantagen (vest og øst) med hensyn til fordelingen af fædrebidrag, 5) Beregning af genetisk diversitet af de 10 kloner i FP.601, frøet fra FP.601 og frøpartiet fra F.410 Frøslev ved hjælp af følgende estimatorer: antal alleler i hver markør (A), observeret heterozygotigrad (H O ), forventet heterozygotigrad (H E ), Wrights fikseringsindeks F is samt antal alleler korrigeret for stikprøvestørrelse (A(rar)). Derudover blev der udført en test (Fishers eksakte test) for forskelle i fædrebidrag mellem tidligt og sent spirende kimplanter (fra klon L8 and L12). Klonforskelle i antallet af hunblomster (strobili) i FP601 blev undersøgt ved variansanalyse med PROC GLM (SAS version 9.1). Resultater Faderskabsanalyse og selvbestøvning Af 388 genotypede kimplanter kunne der tildeles en far blandt de 10 kloner i 377 tilfælde. Elleve kimplanter havde én eller flere mis-matches mellem sin egen genotype 22

24 og den mest sandsynlige far, hvilket blev tolket som at de var resultatet af pollenkontaminering. Udefra kommende pollen havde dermed bestøvet 2,8 % af frøet i FP.601. En detaljeret oversigt over resultater af faderskabsanalysen er vist sammen med den klonvise fordeling af rameter i tabel 3, og hovedresultater er yderligere illustreret i figur 4. Den overordnede klonvise fordeling af fædrebidrag er bemærkelsesværdig lige, hvor de største bidragsydere (klon L9 og L12) er far til ca. 12 % af afkommet, og den mindste bidragsyder (L4) er far til 5,5 % (figur 4 panel A). Klon L4 har flest rameter i FP.601 (16 %) klon L6 færrest (5,8 %). Den lige fordeling af fædrebidrag afspejles af et statusnummer på (N S ) = 10,2, hvilket betyder at frøplantagen fungerer optimalt med hensyn til ligelige bestøvningsbidrag. Det understreges også af at det gennemsnitlige antal bidragende fædre til hver klon (optalt fra tabel 3 pollenkontaminering ej inkluderet) var 9,1 (interval 8-10). Stort set alle kloner bestøvede altså hinanden. Kun 12 af de 388 kimplanter (3,1 %) var resultatet fra selvbestøvning, og i FP.601 var andelen af selvbestøvede individer i forhold til det totale faderbidrag i gennemsnit 33 % (interval %). Ligesom i tilfældet med ædelgran varierer de enkelte kloners faderbidrag alt efter hvor i frøplantagen der høstes frø (figur 4 panel B), og χ 2 testet viste en højst signifikant forskel mellem pollenskyen i den vestlige og østlige del af FP.601 (χ 2 = 47,06; df=9, p 0,0001). I figur 5 ses en sammenligning af faderskabsanalysen gennemført i de tidligt spirende kontra de sent spirende kimplanter i klon L8 og L12. Tre af de 78 genotypede sent spirende kimplanter var et resultat af selvbestøvning (3,9 %). Fishers eksakte test for forskelle i fædrebidrag i tidlige kontra sene kimplanter gav en svagt signifikant p- værdi på 0,03 i klon L8 mens der ikke var nogen signifikant forskel i klon L12 (pværdi=0,34) 23

25 Tabel 3. Fordelingen af fædre (rækker) i FP601 japansk lærk klonfrøplantagen. Frø blev indsamlet på alle 10 kloner (kolonner= modertræer). De to sidste rækker angiver spireprocenten for frøene fra de forskellige kloner samt vurderingen af hunblomstringen. Alle resultater på nær vurdering af humblomstring er givet i procent. De tal der står med fed angiver procentdelen af selv-bestøvede individer i frø høstet på den pågældende klon. Kloner % rameter* L1- L3- L4- L6- L8- L9- L10- L11- L12- L13- Gns. L1-6,8 15,8 10,0 5,0 25,0 20,0 3,3 10,0 7,5 12,5 2, L3-8,1 0,0 2,5 12,5 12,5 17,5 20,0 5,0 20,0 2,5 2,5 9.5 L4-16,0 5,3 12,5 2,5 10,0 0,0 10,0 0,0 2,5 7,5 5,0 5.5 L6-5,8 13,2 12,5 17,5 0,0 10,0 3,3 25,0 15,0 15,0 2, L8-7,1 13,2 15,0 10,0 5,0 2,5 6,7 7,5 7,5 2,5 15,0 8.5 L9-11,8 10,5 7,5 7,5 12,5 10,0 0,0 17,5 10,0 25,0 20, L10-11,0 10,5 5,0 15,0 12,5 17,5 23,3 0,0 7,5 10,0 2, L11-11,0 7,9 20,0 7,5 2,5 5,0 16,7 2,5 2,5 2,5 20,0 8.7 L12-13,9 10,5 5,0 17,5 17,5 7,5 6,7 17,5 15,0 0,0 22, L13-8,4 10,5 10,0 0,0 0,0 5,0 6,7 10,0 12,5 20,0 5,0 8.0 Kontam. - 2,6 0,0 5,0 2,5 5,0 3,3 5,0 0,0 2,5 2,5 2.8 Sum 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100, Spire % for frø Vurdering af hunblomstring # 4,97 4,10 5,90 4,50 5,01 5,35 5,15 4,75 4,61 5,20 5,04 * Den procentvise andel som klonernes rameter udgør af det samlede antal rameter (=træer) i klonfrøplantagen. Kontam. = pollenforurening, dvs. pollen som er kommet ind i klonfrøplantagen udefra. Spireprocenten er et gennemsnit af det vestlige og østlige frøparti. # Vurdering af hunblomstring skete på en logaritmisk skala fra 1 til 9 se tekst.

26 Faderskab i procent (%) B Procentdel af afkom - Vest Procentdel af afkom - Øst Faderskab i procent (%) L1 L3 L4 L6 L8 L9 L10 L11 L12 L13 Kontam. Procentdel af rameter i frøplantagen Procentdel af afkom - hele frøplantagen A L1 L3 L4 L6 L8 L9 L10 L11 L12 L13 Kontam. Faderbidrag FP601 L. kaempferi Figur 4. Klonvise faderbidrag (= pollenbidrag) til afkommet i FP601 japansk lærk angivet i procent. A) Fordeling af rameter og faderbidrag i hele frøplantagen (388 frø). B) Faderbidrag til afkommet i den vestlige og østlige del af frøplantagen (vest: 190 frø; øst: 198 frø). Kontam.= pollen der er kommet ind i frøplantagen fra omgivelserne. Genetisk diversitet En sammenstilling af genetiske diversitetsmål for FP.601 (kloner såvel som frøhøst) og frø fra F.410 Frøslev kan ses i tabel 4. Som i tilfældet med ædelgran er værdierne for forventet heterozygotigrad (H E ) og observeret heterozygotigrad (H O ) cirka de samme, kun for markøren bclk260 i F.410 Frøslev var der en betydelig lavere H O end H E. Dette skyldes sandsynligvis et såkaldt nul-allel, hvor forekomsten af sidstnævnte normalt indebærer at man (fejlagtigt) vil observere et overskud af homozygoter. Det er ikke sandsynligt at den observerede lavere H O er reelt forekommende, da ingen af de andre fire markører viser samme forskel mellem H O og H E. 25

27 Faderskab i procent (%) Faderskab i procent (%) L1 L1 Klon L12 L3 Klon L8 L3 L4 L4 L6 L6 L8 L8 L9 L9 L10 L10 Procentdel af afkom - tidlige kimplanter Procentdel af afkom - sene kimplanter L11 L11 L12 L12 L13 Kontam. L13 Kontam. Faderbidrag til klon L8 og L12. Tidlige vs. sene kimplanter. Figur 5. Klonvise faderbidrag (= pollenbidrag) til tidlige versus sene kimplanter i de to kloner L8 og L12 i FP601 japansk lærk. Tal er procenter. Klon L12 i øverste panel klon L8 i det nederste panel. Kontam.= pollen der er kommet ind i frøplantagen fra omgivelserne. Der kunne ikke påvises nogen signifikant forskel mellem den observerede heterozygotigrad (H O ) i FP.601 (kloner), FP.601 (frøhøst) og F.410 Frøslev (frøhøst). Kun p-værdien for bclk260 var signifikant (p= 0.04), de øvrige 4 p-værdier lå i intervallet 0,13 0,75 (tabel 4). Signifikansen i tilfældet med bclk260 hænger sandsynligvis sammen med det ovenfor nævnte nul-allel. Wrights fikseringsindeks F is var generelt positivt for F.410 Frøslev, hvilket indikerer overskud af homozygoter og ikke-tilfældig bestøvning, og den positive gennemsnitværdi for F is var også statistisk signifikant. Fjernes bclk260 med det formodede nul-allel fra analysen falder den gennemsnitlige F is værdi dog til 0,058, hvilket ikke er signifikant forskelligt fra 0. Værdien af F is for klonerne i FP.601 var ikke statistisk forskellig fra 0, mens der var en let negativ men signifikant F is -værdi for 26

28 frøhøsten i FP.601. Der er altså et mindre overskud af heterozygoter i frøhøsten fra FP.601 i forhold til hvad man ville forvente, selv med fuldstændig tilfældig bestøvning. Antallet af alleler (A) var større i de 40 frø fra F.410 end i de 10 kloner fra FP. 601 (gns. 10,6 mod 6,4), hvilket er forventeligt på grund af det større antal genotypede individer i F.410 (tabel 4). Frøhøsten fra FP.601 lægger sig midt imellem (gns. (A)=8,4); det højere antal alleler end i FP.601 skyldes indkommende pollen (pollenkontaminering). Ligegyldigt om man korrigerer for stikprøvestørrelse eller ej, dvs. bruger (A(rar)) eller (A), får man at der er ca. 25 % flere alleler i frøet fra F.410 end i frøhøsten fra FP.601. Tabel 4. Diversitetsmål for de forskellige frøkilder af japansk lærk baseret på 5 DNA-markører. n = stikprøvestørrelse, A = antal alleler per polymorfe locus, H E = forventet heterozygotigrad, H O = observeret heterozygotigrad, F is = Wrights indavslkoefficient, A(rar) = antal alleler korrigeret for forskelle i stikprøvestørrelse via rarefaction, P-værdi H O = p-værdi fra Fishers eksakte test. DNA-markør Frøkilde n A H E H O F is A(rar) P-værdi H O bclk260 FP601 kloner ,568 0,600-0, ,04 FP601 frøhøst ,545 0,557-0,021 2,9 F410 Frøslev frøhøst ,529 0,350 0,341 2,6 bclk224 FP601 kloner ,789 0,700 0, ,24 FP601 frøhøst ,757 0,784-0,034 4,8 F410 Frøslev frøhøst ,759 0,675 0,112 6,9 bclk189 FP601 kloner ,895 0,800 0, ,42 FP601 frøhøst ,854 0,902-0,057 7,0 F410 Frøslev frøhøst ,874 0,900-0,030 8,4 bclk263 FP601 kloner ,926 1,000-0, ,13 FP601 frøhøst ,881 0,918-0,041 8,2 F410 Frøslev frøhøst ,891 0,825 0,075 9,4 bclk253 FP601 kloner ,795 0,700 0, ,75 FP601 frøhøst ,757 0,786-0,038 5,4 F410 Frøslev frøhøst ,872 0,800 0,083 8,2 Generelt FP601 kloner 10 6,4 0,795 0,760 0,046 6,4 gennemsnit FP601 frøhøst 388 8,4 0,759 0,789-0,040* 5,7 F410 Frøslev frøhøst 40 10,6 0,785 0,710 0,097* 7,1 * Værdien for F is var signifikant forskellig fra 0. 27