mrna-status Verifikation Ved Promoter Varianter

Transkript

1 En bachelorafhandling ved Molekylærgenetisk Diagnostisk Afsnit, Rigshospitalet, København. mrna-status Verifikation Ved Promoter Varianter Afprøvning af en ny metode indenfor functional promotor assays til påvisning af promotor variation signifikans ved transkription Sebina Kahrimanovic, 08. November 1986 BIO00232, Professionshøjskole Metropol Sektion for Molekylærgenetisk Diagnostik, Rigsholspitalet Vejleder: Jesper Bahrenscheer (Adjunkt, cand.scient.) Vejleder: Peter Böhm Nielsen (Udvikling- og uddannelsesbioanalytiker, MSc)

2 2 Abstract ABSTRACT Background: Promoter mutation analysis are known to be complex and laborious.they are not a part of the standardprocedure when performing genetic counseling even though it is known that mutations in the promoter regions can cause consequences for the gene transcription. Present promoter mutation analysis are made of several individual analysis, such as the in-silico analysis and cloning that shows the functionality of the promoter. Purpose of the study At the Section for Molecular Genetics, Copenhagen University Hospital they want to see if it is possible to take advance of conventional PCR and Sanger-Sequencing to analyze the functionality of the promoter. Experimental studies cdna created from mrna by a reverse transcriptase reaction is acquired from nine individuals, of which two are probands with a mutation in the promoter region of the ABCG1 gene and seven are controls, without the promotervariation in the same gene. The DNA of these patients has been checked for presence of the heterozygous SNP G327 in exon 9. The G327 will function as a marker that will, after PCR and Sanger-Sequencing, on an Electrospherogram show if the promoter in one or both alleles of the gene is switched on or off. Results Analysis results have shown that the promoter region on both alleles of the probands is functional. But in one of the control samples the results show that the one promoter allele is switched off, which according to the information about the patient and G327 genotyping assay should not be a possibility. The experiment was repeated three times and all three times the promoter was non-functional. Two of the times we included the DNA from the same patient the mrna descends from to exclude the possibility of sample mix-up, but due to disorder in the Electrospherogram we were not able to confirm. Discussion The coincidence with the control sample, whose one promoter allele is presumably not functional, reduces the quality of the experiment. Besides that, the attempt has shown us that the method is applicable to show weather the promoter is functional or not. For an optimal proof of the methods practicability it is principal to test it on a sample where it is know that the promoter variation affects the transcription. Conclusion Quality of the results has made the methods credibility less trustworthy, but it cannot be concluded that the method is not viable. The situation with the control tells us that the method is possibly feasible, but needs to be tested on samples that have been handled by oneself from the beginning of the process. 2

3 3 Resume RESUME Baggrund: Promoter mutationsanalyser er kendte som besværlige og tidskrævende at udføre. De er ikke en del af standardproceduren ved genetisk udredning, selvom det er kendt at promotermutationer kan forårsage konsekvenser for gen transkriptionen. Nuværende promoter mutationsanalyser er baserede på flere trin af individuelle analyser som insilicoanalysen og gensplejsning der viser om en promoter er funktionel. Formål: På sektion for Molekylærgenetisk Diagnostik, Rihshospitalet vil man undersøge om det ikke er muligt at anvende PCR og Sanger-sekventering til at analysere promoterens funktionalitet. Eksperimentelle undersøgelser: cdna fremstillet fra mrna via revers transkriptase reaktion fra 9 individer, hvoraf to er probanter med promotermutation i ABCG1 genet og syv kontroller uden promotervariation i ABCG1 genet, er undersøgt for en heterozygot SNP G327 i exon 9. G327 skal fungere som en markør, der efter Touchdown PCR og Sangersekventering skal vise på et Elekstrospherogram om promoteren i et eller begge af allelerne er tændt eller slukket. Resultater: Analyseresultaterne har vist at, hos probanterne er promotorerne på begge alleler funktionelle. Men hos en af kontrollerne viser resultaterne at den ene promoter allel er slukket, hvilket ifølge oplysningerne omkring patienterne og G327 genotype analysen ikke burde lade sig gøre. Forsøget blev udført tre gange og alle tre gange er promoteren slukket. To af gangene har vi medtaget DNA et fra den tilsvarende patient som cdna et for kontrollen stammer fra, for at udelukke at prøverne var forbyttede, men forstyrrelser i Elektrospherogrammet har forhindret aflæsning. Diskussion: Tilfældet med kontrollen hvis ene promoter allel formodentligt er slukket, forringer kvaliteten af forsøget. Udover det, fortæller forsøget os at metoden er anvendelig. Resultaterne for probanterne viser at begge promoterer i ABCG1 generne er tændt. For optimalt at bevise metodens værdighed og anvendelighed ville det være oplagt at anvende en prøve, hvor det er kendt at promotervariationen har betydning for transkriptionen. Konklusion: Kvaliteten af resultaterne har gjort at metodens troværdighed ikke kan stoles på, men det kan ikke siges at metoden ikke er anvendelig. Idet der er opstået den situation med kontrollen, fortæller det os at metoden nok er funktionel, men skal afprøves igen med prøver som man selv har varetaget fra starten af. 3

4 4 Forord FORORD 10. juni 2010, Rigshospitalet, København Den praktiske del af projektet er udført på Sektion for Molekylærgenetisk Diagnostik, Rigshospitalet af Sebina Kahrimanovic og Burhan Berzingi. Jeg vil gerne give en stor tak til personalet på Sektionen for Molekylærgenetisk Diagnostik, for at give os plads til at være der og samtidig komme med råd og vejledning, der har hjulpet en del i flere situationer. Til sidst vil jeg gerne takke mine to vejledere Peter Böhm Nielsen og Jesper Bahrenscheer for at komme med god vejledning og være optimistiske omkring projektet, når andre ikke var det. God læselyst. Sebina Kahrimanovic Professionshøjskolen Metropol Bioanalytikeruddannelsen Sigurdsgade København N Tlf E-post: phoe@phoe.dk 4

5 5 Forord INDHOLDSFORTEGNELSE ABSTRACT 2 RESUME 3 FORORD 4 FORKORTELSESINDEKS Introduktion Problemformulering: Promoter region TATA-box Initiator CpG Islands Transskriptionskontrol Cis-regulerende elementer Trans-regulerende elementer Transskription Initiering af RNA Polymerase II QAS-TD Målsætning Fremgangsmåde: Materialer og Metoder Materialer Biologisk Materiale Kemikalier Primere Udstyr og Software Metoder Primer Design Allelic Discrimination RNA oprensning cdna Syntese PCR Gel Dokumentation Sekventering Resultater

6 6 Forord 3.1 Primer Design Allelic Discrimination Gel Dokumentation Sekventering Diskussion Primere Allelic Discrimination PCR og Gel Dokumentation Sekventering Vurdering af QAS-TD Konklusion Perspektivering Referencer Bilag

7 7 ForkortelsesIndeks FORKORTELSESINDEKS PCR QAS-TD TFs RNA mrna pre-mrna DNA cdna bp AMV RT SNP TFBS TESS TSS EMSA Polymerase Chain Reaction Qualitative Allel Specific Transcript Detection Transskriptions Faktorer Ribonucleic Acid Messenger-Ribonucleic Acid Precursor messenger-ribonucleic Acid Deoxyribonucleic Acid Complementary Deoxyribonucleic Acid Base par Avian Myeloblastosis Virus revers transkriptase Single Nuclear Polymorphism Transcript Factor Binding Site Transcription Element Search Software Transcription Start Site Electrophoretic Mobility Shift Assay 7

8 8 1 Introduktion 8

9 9 Introduktion I det centrale dogme (DNA mrna protein) er transskriptionen det første skridt i ekspression af et gen. Upstream af den kodende DNA sekvens som transskriberes ligger transskriptionsindledningsstedet, også kendt som promoteren, der specificer bindingsstedet for RNA polymerasen. På denne position bestemmes det hvorvidt et gen skal udtrykkes samt hvor meget mrna og dermed protein der dannes.(lodish, 2004) (Maston et al., 2006) Regulering af transkription medieres primært af DNA bindende proteiner kaldet transkriptionsfaktorer (TF) der specifikt binder diverse trasnkriptions-kontrollerende DNA sites som dermed indleder transkriptionen med RNA polymerasen. Svigt i timing eller rækkefølge i rekruttering af disse til promoter regionen kan påvirke transskriptionsregulering af et gen. (de Vooght et al., 2009; Kouzarides, 2003) Omvendt kan mangelfuld transskriptionsregulering skyldes en mutation i promoter sekvensen der medfører at transskription ikke kan aktiveres. I begge tilfælde kan udfaldet i en multicellulær organisme være sygdom pga. det manglende protein. (de Vooght et al., 2009) Det er dog ikke alle mutationer i promotor sekvensen der medfører ændring i gen-transskription og ofte er effekten af dem meget vag. Afhængigt af mutationens natur og position kan den forstyrre den normale transskriptionsproces ved at op- eller nedregulere mængden af mrna og dermed også protein, evt. slukke helt for transskriptionen.(de Vooght et al., 2009) Promoter mutationsanalyser forstås som komplekse, tidskrævende og besværlige at udføre. På trods af at der ved promoter mutationer er en kendt risiko for betydningsfulde konsekvenser for genekspressionen er de ikke en del af standardprotokollen ved genetisk udredning.(de Vooght et al., 2009) Standard procedure ved undersøgelser af promotor mutationer består først af en in silico analyse af promotor variationen via online databaser eller promoter forudsigelse programmer hvor der undersøges om variationen er kendt, associeret med sygdom og tidligere beskrevet. Dernæst undersøges der om den bringer forstyrrelse eller skaber en ny bindings site for TFs(TFBS). Programmet TESS(transcriptional element search software) laver en sammenligning af genomiske sekvenser og indberetter en liste af mulige TFBS på baggrund af en statistisk analyse. Undersøgelsen er dog forbundet med stor usikkerhed idet databaserne er ikke optimalt opdaterede, dvs. ikke alle DNA-bindende TFs er blevet identificeret og nogle identificerede TFs har ikke fået deres bindingssite karakteriseret. Promoter sekvensen sammenlignes også med den homologe region i andre arter idet man mener at der er stor sandsynlighed for at nukleotider i TFBS er blevet bevaret under processen af naturlig selektion(de Vooght et al., 2009) Derefter laves et funktionel promoter assay der skal vise om mutationen har en udtalt effekt på promoter aktiviteten. Et funktionel promoter assay som forfatterne af Management of Gene Promoter Mutations in Molecular Diagnostics (de Vooght et al., 2009) mener er det mest præcise i øjeblikket, er reporter gene 9

10 10 Introduktion assay. Bestemmelsen er baseret på at gensplejse promoter sekvensen ind i et plasmid upstream 1 af et reporter gen der er nemt at påvise, såsom gener for chloramphenicol, acetyltransferase, β-galactosidase, grønt fluorescerende protein eller luciferase. Den færdige plasmidkonstruktion transficeres til kultiverede celler, hvor promteren kan være aktiv, dvs. hvis det er en leverspcifik promoter skal det også være en levercelle den trasficeres til. Derpå måles aktiviteten af reporter genet for at afgøre om promoter mutationen ændrer reporter genets ekspression. Udover denne metode, udføres også transgene forsøg hvor der konstrueres transgene organismer/celler, hvor reporter gene ekspressionen monitoreres gennem hele udviklingen. Selvom begge metoder er forbundet med en del begrænsninger og usikkerhed er det de mest brugte til vurdering af funktionelle bivirkninger af promoter mutationer. Yderligere udføres der en suppleringsanalyse, der er baseret på EMSA som skal påvise at promoter mutationen påvirker bindingssitet mellem TFs og DNA. Idet EMSA er en in-vitro metode er det ikke sikkert at en binding mellem protein og promoter, nødvendigvis aktiverer promoteren. (de Vooght et al., 2009) Projektets baggrund På sektion for Molekylærgenetisk Diagnostik, Rigshospitalet undersøges muligheden for at benytte sig af klassisk PCR og Sanger-sekvensering til bestemmelse af promoter funktionaliteten. Metoden omfatter isolering af totalt mrna efterfulgt af reverstranskriptase Polymerase Chain Reaction (PCR) til cdna som endeligt sekventeres og analyseres på et Elektropherogram. Metoden er en semi-kvantitativ tilgang til analyse af promotor variationens indflydelse på trasnkriptionsraten af ABCG1 genet. Denne fremgang er hurtigere og billigere end de konventionelle metoder og der er ikke brug for avanceret laboratorieudstyr, hvilket egner metoden til anvendelse i rutinediagnostiske laboratorier. Modellen for test af metode bygger på et gen med promoter variation. Variationen skal være heterozygot og have betydning for transskriptionen, for at metoden kan verificeres. Samtidig skal det samme gen have en heterozygot SNP i en af exons, der skal bruges som markør og vise om genet bliver transskriberet, op- eller nedreguleret. Tidligere studie af ABCG1 genet har været baseret på 144 prøver med ca. 1/3 bestående af probanter med heterozygot promotervariant og 2/3 kontroller uden promotervariant. Et SNP(G327) i exon 9 forekommer forholdsvis hyppig både blandt probander og kontroller. Ved at genotypebestemme hvilke af disse 144 prøver besidder en heterozygot SNP i exon 9, vil de prøver udfylde kriterierne for modellen som metoden kan testes på. 1 Mod 5 -enden af sense-strengen. Se evt. figur 1 10

11 11 Introduktion 1.1 Problemformulering: Ved at undersøge et gens allel-specifikke mrna transkripter ved hjælp af QAS-TD*, kan man på et Electropherogram vise at en promoter mutation i det ene allel hos genet, ændrer gentranskriptionsraten? *= Qualitative Allel Specific Transcript Detection 1.2 Promoter region Promoter regioner i eukaryote celler er komplekse og forskellige fra gen til gen, hvilket gør dem svære at karakterisere. Promoteren er kendt som regionen, der ved hjælp af andre regulerende elementer, igangsætter eller hæmmer transskriptionen. Den befinder sig på samme streng som det gen den regulerer, upstream fra transskriptionsstart sitet(se figur 1). Forskellige DNA sekvenser er identificeret som promotorer i eukaryoter celler og vil blive beskrevet i de følgende underafsnit Figur 1: Promoter region. Elementerne i de grå nuancer forestiller, promoter proximal elements 200 bp upstream fra TSS. Disse elementer består af bp hver og hjælper til regulering af genet. Lyserødt element er en TATA-box,( bp fra TSS) som er den mest almindelige promoter sekvens fundet ved hyppigt transkriberende gener, ca bp downstream fra TATA-box findes en TSS(Lodish, 2004) TATA-box I gener med høj transskription har man identificeret en T/A rig sekvens bp upstream fra Transkrptions Start Site (TSS)kendt som TATA-box (T-A-T-A-A/T-A-A/-T-A/G). Se figur 1. Studier har vist at en single-base mutation i denne sekvens drastisk nedbringer transskriptionsraten af genet der er styret af TATAboxen. Hvis en mutation finder sted mellem TATA-boxen og TSS har det i flest forsøg ikke vist at have indflydelse på transkriptionsraten i samme niveau. Endnu flere forsøg har vist at hvis sekvensen mellem TATA-boxen og TSS slettes, starter transskriptionen bp downstream fra TATA-boxen og et nyt TSS dannes. Disse informationer hentyder til at TATA-boxen må være promoteren som TFs og derpå RNA polymerasen bindes til for at starte transskriptionen. (Lodish, 2004) 11

12 12 Introduktion Initiator For andre eukaryote gener er der i stedet for en TATA-box identificeret en alternativ promoter kaldt Initiator. De mest forekomne initator karakteristika er set omkring TSS. Sekvensen er ikke bestemt på samme detaljerede niveau som de første fire baser i TATA boxen og flere forskellige sekvenser kan fungere som en initiator (engelsk: degenerate sequence). Sekvensen er vist nedenunder: (5 ) Y-Y-A +1 -N-T/A-Y-Y-Y (3 ) A +1 er adenin på plads +1 efter TSS, dvs. A er basen hvor transskriptionen starter. Y er enten en cytosin eller thymin (C/T) og N er hvilken som helst af de fire baser A,T,C eller G. T/A står for at på denne plads forekommer basen T eller A. (Lodish, 2004) CpG Islands I modsætning til TATA-box og initiator som positionsmæssigt er klart defineret i forhold til TSS, har transskription af flere protein-kodende gener vist sig at have et startsite, ved hvilken som helst ud af mange sites i en vidstrakt region, bestående af bp i længden. Konsekvensen er at startkodon ændrer sig. Disse gener transskriberes typisk ved lave rater og kaldes for housekeeping genes. Denne type gener besidder en bp lang sekvens 100 bp upstream fra TSS, som består af gentagne CG nukleotider. Da CG gentagelser er statistisk under-repræsenterede i vores DNA menes der at disse CpG Islands ikke er tilfældige og må indeholde en transskriptionsinitierende site.(lodish, 2004) 1.3 Transskriptionskontrol Udover de forskellige ugaver af en promoter beskrevet ovenfor findes yderligere DNA sekvenser der har betydning for regulering af genekspression. Disse DNA sekvenser kategoriseres normalt kollektivt som cis regulerende i kontrast til trans regulerende elementer som normalt dækker over transkriptionsfaktorerne. De cisregulerende sekvenser er derfor oftest binding sites for trans regulerende proteiner Cis-regulerende elementer Cis transskriptionsregulerende elementer befinder sig på samme DNA molekyle, som genet de regulerer, og kan være lokaliseret i variende afstande upstream, downstream eller enda i genets intron og exons. I de følgende underafsnit bekreves to typer af cis regulerende elementer.(maston et al., 2006) Promoter-proximal elementer Termen promoter-proximal elements anvendes til at beskrive kontrol elementerne der ligger bp upstream fra TSS (Figur 1). I visse tilfælde er disse elementer celle-type specifikke og fungerer i specifikt differentierede celletyper. Studier har vist at hvis bp indsættes imellem et promoter-proximal element og en TATA-box nedreguleres transskriptionen bemærkelsesværdigt.(lodish, 2004) 12

13 13 Introduktion Enhancers Visse regulerende elementer fungerer som forstærkere til transskriptionen. De kan lokaliseres flere 1000 bp fra promoteren som de regulerer. Man har identificeret elementer som menes at være Enhancers upstream fra promoteren, downstream fra promoteren, i introns, sågar også downstream fra det sidste exon i genet. Som promoter-proximal elements er Enhancers også celle-type specifikke. Eksempelvis har man påvist at gener de koder for antistoffer har en enhancer der virker på alle promoterer testet, men kun i B-lymfocytter, de celler der producerer antistoffer. Analyser for betydning af enhancer har vist ved deletion, at enhanceren er styret af andre elementer der tilsammen bidrager til enhancerens aktivitet.(lodish, 2004) Trans-regulerende elementer Trans regulerende elementer, kendt som transkrpptionsfaktore,kan selv være lokaliseret på f.eks. kromosom 6 og eksempelvis virke som regulerende proteiner på et regulerende element i et gen på f.eks. kromosom 5. De trans-regulerende elementer spiller en afgørende rolle i regulering af genekspression ved at modificere kromatin strukturen i og omkring genet. Denne modifikation blotter de cis regulerende elementer hvorved RNA polymerasen som det endelige trin rekrutteres og kan initiere transkription. Ekspression af et gen afhænger af koncentrationen af de involverede transkriptionsfaktorer samt deres aktivitet. Disse parametre reguleres via komplicerede signal overførsler i multicellulære organimser hvor f.eks. hormoner kan være budbringere. (Lodish, 2004; Maston et al., 2006) Activators En aktiverende transksriptionsfaktor der fremmer transskriptionen, kaldes en Activator. En activator er et protein med en DNA bindende domain og et eller flere aktiverende domains til andre proteiner(coactivators), der tilsammen stimulerer transskription fra en nærliggende promoter.(lodish, 2004) Repressors Eukaryote transskriptionshæmmende proteiner kaldes repressors. De er også transskriptionsfaktorer og besidder ligeledes en DNA bindende domain og et repressor domain, hvortil andre transskriptionsfaktorer binder og hæmmer transskriptionen. (Lodish, 2004) 1.4 Transskription Initiering af RNA Polymerase II Ved påbegyndt transskription aflæses DNA (genet) af RNA Polymerase II, der producerer en komplementær antiparallel RNA streng indeholdende hele genets information. DNAets fire basers sprog (A, T, C og G) transskriberes til RNAets fire baser hvor den eneste forskel er at, i stedet for thymin (T) indsættes uracil (U). 13

14 14 Introduktion Under transskription smelter RNA polymerasen hydrogenbindinger mellem ca. 14 bp, for at kunne bygge ribonukleosid triphosphat(rntp) ind overfor DNA strengen. Anti-sense strengen der er opbygget 3-5 fungerer som template der bestemmer i hvilken rækkefølge de indkommende rntp monomerer polymeriseres til at forme den komplementær RNA streng. Se figur 2. Denne tilgang gør at RNAet kan opbygges 5-3 ud i et og uden brug af Okizaki-fragmenter. Figur 3: Transkription 3. Når RNA Polymerasen aflæser en terminerende sekvens i genet (Transcription Stop Site), afslutter den transskriptionen og det primær transkript af mrna(pre-mrna) er færdigt. Se figur 3. RNA polymerasen løsner sig fra template strengen og kan på ny medvirke i en transskription. Alt transskriberet pre-mrna bliver i første omgang modificeret ved 5 og 3 enden. Lige så snart 5 enden fremkommer under overfladen af RNA polymerasen, overfaldes den af enzymer som syntetiserer en 5 cap, der beskytter mrnaet mod degradering og assisterer dennes vej ud af kernen og ind til cytoplasma. Cappen er også bundet af en protein faktor der er nødvendig til initiering af translation. 3 enden får påsat en poly(a)-hale med bp adenylsyre. Figur 2: Transskriptions elongering 2. I højre side har transskriptionsfaktorerne stimuleret RNA Polymerasen (RNAP) til at transskribere template strengen af genet. Template strengen er opbygget 3'->5' hvilket forudsætter at RNA strengen opbygges i 5'->3' retningen. Det endelige trin til funktionelt mrna er en splejsning, som fjerner introns og samler exons sammen.(alberts, 2004; Lodish, 2004) 1.5 QAS-TD En funktionel promoter assay skal kunne vise resultater der først og fremmest afspejler en promoters funktionalitet. Yderligere er det et plus hvis metoden besidder egenskaben der viser om transskriptionen er Juni

15 15 Introduktion op eller nedreguleret. Frem til nu har analyser i denne kategori været dyre og ikke udførlige i almindelige medicinsk rutinediagnostiske laboratorier. Qualitative Allel Specific Transcript Detection(QAS-TD) er en nyudviklet metode der på baggrund af simpel RNA oprensning, PCR-baserede analyser og sekventering kan vise om en promoter er funktionel. Samtidig kan den ved heterozygote promotervariationer vise hvis transskripter fra det ene allel er op eller nedregulerede. Analyseprincippet er baseret på amplificering af reverstransskriberet mrna. Derefter markeres de amplificerede produkter af terminerende dntper i en sekvensreaktion. Resultaterne erhverves på en kapillær elektroforese, hvor produkterne separeres og mængden afbildes i form af peaks på et Figur 4: Primer Design, forward primeren sidder i exon 8 og revers primeren i slutningen af exon 9 med G327 markøren midt i mellem. Det er gjort således, da primer annealingsites i introns ville splejses væk under transkriptionen. elektrospherogram. Vigtige elementer der gør det muligt at aflæse resultaterne på elektrospherogrammet, er først og fremmest primere der er designet så de passer indenfor exons rundt om markøren. Se figur 4. Den heterozygote markør fungerer som detaljen der gør analysen allelspecifik. Se figur 5. På elektrospherogrammet afslører markøren hvis transskripter fra det ene allel ikke er der, for så ses der kun et peak. Det ville betyde at promoteren til det ikke-transskriptionsdygtige allel formodentligt er dysfunktionel. Omvendt hvis transskripter fra begge alleler er der, vil det kunne ses ved to peaks på det samme sted, i overført betydning er promoteren funktionel. Figur 5: To aller af ABCG1 genet, med en heterozygot promotervariant. Varianten i allel 2 kan have betydning for transskriptionen(tf-). I exon 9 er der en polymorfi G327. Hvis genet fra begge alleller transskripteres til mrna der revers transskripteres til cdna, ses polymorfien i sekvensen på elektrospherogrammet som blå og rød kurve (T/C). Promoteren er derfor funktionel i begge alleller(a1 TF+/A2 TF+). Er promoteren i allel 2 dysfunktionel(a2 TF-) mens den i allel 1(A1 TF+) er funktionel, vil udslaget på elektrospherogrammet kun vise signal fra allel 1(T). Hvis begge promoter alleller er dysfunktionelle(a1 TF-/ A2 TF-) vil mrna ikke dannes og der ville ikke være nogen resultater. Hvis begge promoter alleler er funktionelle, men variationen ned eller opregulerer den allel-specifikke mrna mængde, ville udslaget for det pågældende allel være forskellig fra det fuldt funktionelle promoter allel. Prøvemateriale med heterozygot promoter variant har størst nytte af QAS-TD. Udover alene at vise om promoteren er tændt eller slukket, er det muligt at aflæse om variationen blot op eller nedregulerer 15

16 16 Introduktion transskriptionen. Sekventering er en semi-kvantitativ analyse, idet dntperne markerer hver enkel af PCR produkterne og ved separering afspejler toppenes højde sekvens produkt mængden. I tilfælde af homozygote promoter varianter, er metoden anvendelig til at indikere hvis promoteren slukker helt for transskriptionen og måske kan den også påvise en op eller nedregulering. Dog, er der nogle biologiske og analysetekniske overvejelser man skal gøre sig hvis man tør stole på at promoteren helt slukker for transskriptionen, da nogle gener simpelthen ikke bliver udtrykt i visse celler og det er ikke ensbetydende med at promotermekanismen er dysfunktionel. Kontroller til metoden er normalprøver uden promotervariationen, der også besidder markørpolymorfien. Ved at sammenligne markørtoppe fra flere normalprøver, kan man få en reference top som probander kan sammenlignes med. 1.6 Målsætning De 144 prøver blev ved modtagelse af blodprøverne til ØBUS H samlingen, fordelt i tre forskellige kryorør: Oprenset DNA, Fuldblod og Buffycoat. Til det foregående studium blev RNA oprenset enten fra fuldblod eller buffycoat, af hvilket der derefter blev lavet cdna. cdnaet skal anvendes til test af QAS- TD- metoden Fremgangsmåde: 1. Der skal laves en Allelic Discrimination test af DNAet tilhørende de 144 prøver, på HT 7900 med TaqMan SNP Genotyping Assays primere og prober til SNP G327. Analysen skal bestemme genotypen for de 144 prøver og vise hvilke af dem er heterozygote i markør regionen. De prøver hvis resultater angiver at de er heterozygote vil anvendes til afprøvning af QAS-TD. 2. Yderligere skal der designes primere til G327 der skal anvendes under PCR. Der designes to sæt for at sikre at et af dem fungerer. Primerne testes på cdna syntetiseret ud fra RNA der stammer fra et af gruppemedlemmerne. 3. Forsøget går i gang med at der laves Touchdown PCR efter standardprotokollen. 4. Derefter afsaltes PCR produkterne og man går videre med opsætning af sekvenserings PCR, også efter standardprotokollen. 5. Sekventeringsprodukterne vaskes og overføres til 3730 DNA Analyzer hvor der udføres kapillær elektroforese. Kontrollernes resultater skal vise normalresultater i forhold til afbildning af G327 signalet på elektrospherogrammet, da disse ikke har nogen variation i promoteren. Probanterne skal sammenlignes med kontrollerne. 16

17 17 Introduktion Allelic Discrimination Primer Design RNA oprensning cdna syntese Touchdown PCR Sekventerings PCR Kapillær Elektroforese Figur 6: Flowdiagram over proceduren 17

18 18 2 Materialer og Metoder 18

19 19 Materialer og Metoder 2.1 Materialer Materialer som er anvendt både præanalytisk og analytisk er opremsede i de følgende tabeller Biologisk Materiale Både kontrol- og probantmateriale brugt i forbindelse med analysering stammer fra Rigshospitalets samling af blodprøver fra Østerbro-Herlev undersøgelsen. Individer involveret i ØBUS H har givet deres samtykke til Rigshospitalet om at deres blod kan anvendes til forskning Probanter og kontroller 144 probanter og kontroller blev udleveret på en liste over undersøgte registreringsnumre i forbindelse med ABCG1 genet. Kun nogle få blev udvalgt til testning af vores metode vha. programfunktionen Allelic Discrimination på ABI Prism 7900HT. Tabel 1: Probanter med heterozygot promoter variant og heterozygot G327 markør Probanter Promoter Variant G327 Markør Registrerings nummer Afstamning Probant 1 Ja Ja Hemmelig ØBUS H Probant 2 Ja Ja Hemmelig ØBUS H Tabel 2: Kontroller med heterozygot G327 markør Kontroller Promoter Variant G327 Markør Registrerings nummer Afstamning Kontrol 1 Nej Ja Hemmelig ØBUS H Kontrol 2 Nej Ja Hemmelig ØBUS H Kontrol 3 Nej Ja Hemmelig ØBUS H Kontrol 4 Nej Ja Hemmelig ØBUS H Kontrol 5 Nej Ja Hemmelig ØBUS H Kontrol 6 Nej Ja Hemmelig ØBUS H Kontrol 7 Nej Ja Hemmelig ØBUS H 19

20 20 Materialer og Metoder Kemikalier Tabel 3: Oversigt over kemikalier brugt under forsøget Opløsning Komponenter Producent TRIzol Reagent 50% Phenol 30% Guanidine Thiocyanate 20% Ikke skadelige ingredienser 2-Propanol - Chromasolv Isopropanol, (CH 3 ) 2 CHOH Sigma-Aldrich Chloroform Trichloromethane, CHCl 3 Sigma-Aldrich Invitrogen, Molecular Research Center, Inc. Ethanol 75 %, 85 % Millipore H2O Agencourt AMPure Reagent Agencourt CleanSEQ Reagent The BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit - Sekventeringsbuffer The BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit - BigDye Steril H2O 10x PCR Rxn Buffer Sodium azide <0.1% (w/w) Metals and metallic compounds Sodium azide <0.1% (w/w) Metals and metallic compounds dntp, ddntp, etc. Enzymer etc. 200 mm Tris HCl (ph 8.4), 500 mm KCl RH Apoteket MilliQ Beckman Coulter, Inc., USA Beckman Coulter, Inc., USA Applied Biosystems Applied biosystem Fernesius Kabi AB Invitrogen 50 mm Magnesium Chloride MgCl 2 Invitrogen 10 mm dntp 2,5 mm datp, dctp, dgtp, og dttp KJ Ross-Petersen ApS 20 mm Tris-HCl (ph 8.0), 40 mm Platinum - Taq DNA Polymerase NaCl, 2 mm Sodium Phosphate, 0.1 mm EDTA, 1 mm DTT, stabilizers, 50% (v/v) glycerol E-Gel Low Range Quantitative DNA Ladder Lot Invitrogen Invitrogen 20

21 21 Materialer og Metoder Primere Tabel 4: Primere til Taqman SNP Genotyping Assay og til PCR Primere Sekvens 5-3 Producent Sæt 1 Sæt 2 SB PromF1 5 -GGG GAA AAG TCT GCA ATC TTG TGC-3 TAG Copenhagen A/S SB PromR1 5 -AGG TCT CTC TTG TGG TCT GAG TCA C-3 TAG Copenhagen A/S SB PromF2 5 -GCC CAA CCT ACC ACA ACC CAG CAG-3 TAG Copenhagen A/S SB PromR2 5 -GAA AAG GGT TCA CCT CGG CAT CAC-3 TAG Copenhagen A/S TaqMan ABCG1 G327 Forward Revers 5 -GTG TCT CCT GCA GTC ATG GA-3 5 -ACC AGC CGA CTG TTC TGA TC Udstyr og Software Tabel 5: Oversigt over udstyr og utensiler anvendt under forsøget Udstyr og Utensiler Model Producent ABI Prism - Sequence Detections System and SDS Enterprose Database 7900HT Applied Biosystems, Inc. Mastercycler Gradient Eppendorf AG Plade Sealer 4titude, 4s 2TM Saveen & Werner AB Biomek NX P Multichannel, CAT no. A Beckman & Coulter, Inc Alu Seal 4titude, Lot Saveen & Werner AB Peel Seal 4titude, Lot. WT Saveen & Werner AB Sekvenator HITACHI, 3730 DNA Analyzer Applied Biosystems, Inc Stinkskab UV-Skab Kamera OD - måler GeneFlash Syngene Nanodrop 21

22 22 Materialer og Metoder E-Base VAC Imput current: 500 ma Frekvens: 50/60 Hz Invitrogen ibase VAC Imput current: 1.0 A Invitrogen Frekvens: 50/60 Hz E-Gel 2% Lot. V16129 Invitrogen Kølestativ Eppendorf AG Pipetter og pipettespidser Eppendorf Research 10 µl Biohit 0,3 1000µl TipOne Biohit Tips Eppendorf AG Biohit StarLab Biohit 384- og 96-Plader 4titude Saveen & Werner AB TissueLyzer Eppendorf AG Tabel 6: Computer programmer anvendt til forsøget Program Software Version Producent Biomek Software Beckman Coulter, Inc. SDS Software v. 2.3 Applied Biosystems, Inc. 2.2 Metoder Primer Design PCR primere blev designet manuelt ud fra et udprint af ABCG1 exon 8-10 gensekvensen. Længden af primerne er bp. De er designet så den amplificerede sekvens er omkring 150 basepar lang og at G327 markøren ligge cirka midt i. Der er taget hensyn til et balanceret C-G og A-T basepar indehold, uden sammenklumpning af C-G der kan gøre primerne uspecifikke. Der blev også taget hensyn til at primerne ikke var selv-komplementære. For en sikkerhedsskyld blev der designet 2 sæt, lidt forskudt for hinanden. Se følgende figurer. 22

23 23 Materialer og Metoder Figur 7: To udklip af ABCG1 indeholdende exon 8 og 9. I exon 8 er forward primerne lagt. F1 er forward primer for sæt 1 og F2 er forward primer for sæt 2. Nederste billede viser exon 9 med markør G327. Revers primer for sæt 1 (R1) og sæt 2 (R2) er lagt her. Information om de ønskede primere blev sendt til TAG Copenhagen A/S. De leverede primere blev opløst i x µl sterilt H2O oplyst på følgesedlen. Primer til PCR brug blev derefter opløst i et 1:9 forhold i et separat rør; 10 µl primer til 90 µl sterilt H2O. For yderligere oplysninger vedrørende primer koncentration og temperatur, se Bilag Allelic Discrimination Allelic Discrimination analysen på HT ABI Prism - Sequence Detections System udføres for at bestemme genotypen af de 144 probanter og kontroller fra det forrige studium. Til dette formål anvendes Taqman SNP Genotyping Assay primer og prober til ABCG1 SNP G327. Proben til allel 1 (AL-1) der er mærket med VIC fluorescensstof og proben til allel 2 (AL-2) der er mærket med FAM TM fluorescensstof, er også hæftet med en quencher. Når proben matcher til sekvensen frigives quencheren og fluorescensstoffet begynder at lyse. Omvendt hvis proben ikke matcher kommer der intet lyssignal frem. (Biosystems, 2007) Før programmet køres, skal prøverne forberedes og dernæst amplificeres på HT 7900 eller på en almindelig MasterCycler. Se Figur 7. DNAet findes frem og 1 µl af hver af de 144 prøver pipetteres over til en 384-plade. Ved siden af laves en PCR-mix med prober, primere, H2O og 2xTaqmanPCRMasterMix. Der overføres 4,1 µl PCR-mix til hver brønd med prøve i. Pladen seales og sætter på MasterCycleren til et Taqman Program. Figur 8: Allelic Discrimination Arbejdsflow(Biosystems, 2007) 23

24 24 Materialer og Metoder Derefter analyseres PCR produkterne ved hjælp af SDS software(tabel 6) som fremsætter et diagram hvor resultaterne vises. Rød og blå farve fortæller at signalet kommer enten fra AL-1 eller AL-2, dvs. prøverne er homozygote. Grøn farve fortæller at signalet kommer fra begge alleler hvilket betyder at prøverne er heterozygote RNA oprensning Protokollen som bliver anvendt er beregnet til oprensning af RNA fra tumorvæv, men i stedet for væv anvendes blod. Det er ukendt hvor mange µl blod der er anvendt til at oprense RNA til dette forsøg, men under oprensning af RNA til primer test var µl rigeligt. Blodet homogeniseres godt i 1 ml Trizol reagens i et 2 ml rør. Blandingen inkuberes i 5 minutter ved stuetemperatur. Derefter kommes der en lille metal kugle i rørene og de sættes i to bokse der tilhører Tissuelyzeren, som kraftigt ryster boksene i 5-10 minutter. Prøverne tages derefter ud og der tilsættes 200µl chloroform i. Rørene lukkes og rystes i 15 min. i hånden. De inkuberes i 2-3 min. ved stuetemperatur før de centrifugeres i 15 min ved 12000xg, hvor prøven adskilles i en rød phenol-chloroform fase og en vandfase der indeholder RNA et. Vandfasen overføres til nyt Eppendorfrør og tilsættes 500µl isopropanol. Prøven indkuberes i 10 minutter før den centrifugeres i 10 min ved 12000xg ved 2-8 C. Dette vil nedcentrifugere RNA et som et gele-agtig-pellet til bunden eller på siden af røret. Supernatanten fjernes forsigtigt. Pellet vaskes med 1 ml 75% Ethanol og mikses med vortex. Den centrifugeres ved 7500xg i 5 minutter. Supernatanten fjernes og pellet lufttørres i 5-10 minutter. Derefter opløses det i RNAse frit H2O, efter hvor koncentreret det ønskes og indkuberes i 10 min. ved C. Hvis prøven ikke skal bruges med det samme, stilles den ved -80 C. Hele oprensningsproceduren foretages i stinkskab cdna Syntese Da RNA er skrøbeligt er det ikke hensigtsmæssigt at bruge det direkte i en PCR reaktion. Derfor laves en revers transkriptase reaktion, der skaber et mere robust format i form af cdna, der er helt komplementært til det oprensede RNA. Det oprensede RNA fortyndes i henholdsvis 1,0µg, 0,5µg og 0,25µg total RNA pr. µl og sættes op i tre forskellige Eppendorfrør på 0,5 ml. Samtidig sættes en reaktion op med H2O og en uden AMV revers transkriptase. 5X RT Buffer, dntp-mix, RNAsin og random hexamer primers tages frem, tøs op ved 24

25 25 Materialer og Metoder stuetemperatur og centrifugeres ned. AMV transkriptase tages frem, centrifugeres ned og holdes på kølebakke. Følgende mix laves på en kølebakke: Standard RT-Mix til en revers transcriptase reaktion 5X RT Buffer dntp-mix (4 X 2,5mM) RNAsin (40U/µl) Random hexamer primers (0,5µg/µl) AMV reverse transcriptase(10u/µl) 10,0µl 20,0µl 1,25µl 0,5µl 1,25µl Total RNA (0,2µg, og 0,5 µg og 1,0 µg) 1 µl RNAse-frit H 2 O til 50µl I alt 50µl MasterCycleren tændes 30 minutter før brug. RT-Programmet kører 42 C i 30 min. og 95 C i 5min. Derefter holdes produktet på køl ved 4 C indtil det fjernes fra udstyret. Forberedelserne varetages i præpcr rummet PCR Forberedelserne til PCR udføres i præpcr rummet hvor det genomiske DNA/cDNA ikke er i kontakt med PCR Tabel 7: Komponenter pr PCR reaktion produkter, da dette kan forurene reaktionen. PCR-MIX µl/prøve Ved igangsættelse af nye prøver udfyldes et PCR arbejdsark med relevant H2O/µl 28,8 information. PCR udstyret tændes og låget varmes. Alle reagenser tages 10XBUffer/µl 5 ud, tøs op, mikses og centrifugeres kort. En 96-plade påskrives dato, initaler og gen. Reaktionsblandingen laves af komponenterne i Tabel 7 og holdes ved dntp/µl 4 stuetemperatur. Den vortexes godt og centrifugeres kort. MgCl2/µl 2 Primer F 2,5 5µl cdna og reaktionsmix blandes ved at tilsætte 45µl PCR mix i de brønde som man har angivet på PCR arbejdsark. Derefter tilsættes cdna oven i Primer R 2,5 reaktionsmixen og pipettespids skiftes hver gang. Udover cdna laves to Platimun Taq 0,2 kontroller hvor der tilsættes H2O til reaktionsmixen i stedet for cdna. Total 45 25

26 26 Materialer og Metoder Pladen seales og centrifugeres kort. Pladen sættes i Mastercycleren og programmet TouchDown-40 vælges(se tabel 8) Tabel 8: TouchDown PCR Program Aktion Temp. / C Tid Antal runder Initial denaturering 95 5 min. 1 TouchDown cycle Denaturering sek Annealing 70->55 30 sek. 30 Extension min. Denaturering sek. Annealing sek. Extension min 40 Extension min 1 Hetero/Homo- duplex Denaturering Fra 94 og så -0,5 C/cycle 5 sek. 99 Køling Hold Gel Dokumentation Til dokumentation af PCR produkter anvendtes færdigstøbte geler fra Invitrogen. Gelen tages ud af indpakningen med handsker på, kondensvæsken tørres af og gelen sættes til den relevante strømforsyning. Med færdigstøbte geler er der ikke brug for loadingbuffer til at holde materialet nede i brønden. Handskerne tages af og 10µl PCR produkt afpipetteres til de relevante brønde. Rækkefølgen noteres så der efterfølgende kan verificeres hvilke prøver der viser hvilket billede. En DNA markør medtages i hver række, så resultaterne kan sammenlignes med denne. ibase(til mindre geler) indstilles til at køre i 7 minutter mens E-BASE indstilles til 14 minutter(større geler. )Der skal passes på at gelen ikke kører for langt og produkterne ikke kører ud. Før resultaterne visualiseres skal gelen pakkes ind i plastik: 26

27 27 Materialer og Metoder - Uden handsker afklippes et passende stykke plast, der åbnes, så det er klar til at modtage gelen. - Med handsker tages gelen op af karret, der tørres underneden og gelen lægges på plastikken. - Uden handsker lukkes plasten der forsegles og gelen er klar til visualisering Visualisering foretages på Gene Flash geldokumentationsudstyr som indstilles ordentligt for eksponeringstid. Et billede printes eller gemmes på memory kort Sekventering Før sekventeringsopsætning påbegyndes, skal TouchDown PCR produkterne gennem en afsaltningsprocedure. Til det formål anvendes Agencourt AMPure der ved hjælp af magnetiske partikler i opløsningen fjerner rester af dntper, primere og salte fra PCR produktet og gør det klart til sekventering. Afsaltning udføres automatisk på en Biomek NX p robot. Derpå tændes en PCR maskine og låget opvarmes. Et arbejdsark for halv 96-plade udfyldes og relevante oplysninger indskrives, inklusive pladebarkode og dato. Tabel 9: Sekventering reagensprotokol for TouchDown PCR produkter Reagens Mængde/reaktion i µl Sterilt H 2 O Op til 10µl Sequencing Buffer (5X) 3,8µl BigDye v1.1 0,3µl Primer F el. R 1,0µl Template(TouchDown PCR produkt) 2,0µl Ialt 10µl Reagenser opremset i Tabel 9 findes frem og tøs op. Derefter placeres de på kølebakke. Forbrug af reaktionsmix beregnes ifølge Tabel 9, så der i hver brønd er 10 µl i alt. Reaktionsmixen sættes også på kølebakke. En 96-plade findes frem og TouchDown PCR produkt overføres til brøndene der ligeledes er markeret på arbejdsarket. Derefter kommes reaktionsmix i og pladen seales og centrifugeres. Der skal sørges for at alle brønde er lukkede, da materialet kan fordampe og derved ville sekvensen ikke være brugbar. Mastercycleren indstilles til programmet Sekv5035(se Tabel 10) og sekventeringen begynder. 27

28 28 Materialer og Metoder Tabel 10: Sekventerings temperaturprofil Aktion Temp. / C Tid Antal runder Initial denaturering 94 4 min. 1 Denaturering sek. Annealing sek. 35 Extension 60 4 min. Køling Hold 4 1 Efter endt sekventerings PCR skal produkterne oprenses for en mere ensartet og højere signal ved kapillær elektroforese aflæsning. Hertil anvendes Agentcourt CleanSeq der fjerner Big-Dye overskud, primere, salte og enzymer fra sekventerings produkterne. Oprensningen foregår automatisk på en Biomek NX p robot. Derefter sættes pladen til kapillær elektroforese på 3730 DNA Analyzer udstyret, der fremstiller et elektrospherogram ud fra de terminerede sekvenser fra Sanger-sekventerings PCR. 28

29 29 Resultater 3 Resultater 29

30 Primer Design De færdige primere blev leveret og testet på en rask gruppemedlems blod. RNAet blev oprenset og reverstrnskripteret til cdna. Materialet blev amplificeret vha. TouchDown PCR og vurderet på gel elektroforese, se fig. 10. Figur 10: Gel dokumentation for at primerne er designet korrekt. Øverste række er amplificeret med primer sæt 1 og nederste række er amplificeret med primer sæt 2. Begge rækker viser en negativ kontrol i brønd 1 og en DNA markør mellem brønd 4 og 5. Brønd 2-7 i begge rækker viser dobbeltbestemmelser af de tre koncentrationer af cdna (1 µg/0,5µg/0,25µg) Figur 9: DNA Markør. De færdige PCR produkter skal være mellem 100 og 200 bp når de sammenlignes med DNA markøren. De amplificerede PCR produkter skulle måle ca. 150 bp, og på ovenstående billede ses at PCR produkterne der står øverst, alle har vandret lige så langt som det 150 bp tunge materiale i E-Gel Low Range Quantitative DNA Ladder. 3.2 Allelic Discrimination DNA tilhørende 144 prøver der består af probander og kontroller, skulle undersøges for heterozygot markør G327 i ABCG1 genet. Taqman Genotyping Assay mix som består af primere til denne region og prober til vildtype og G327 blev blandet med 1µl DNA i hver brønd på en 384-plade. Pladen gennemgik en PCR reaktion der amplificerede regionen. Derefter kunne proberne bindes til den matchende sekvens indeholdende G327 eller vildtypesekvensen. Resultaterne blev aflæst af HT Se figur 30

31 31 Figur 11:Resultater fra Allelic Discrimination analysen. De grønne prikker midt i diagrammet står for prøverne med heterozygot G327. I brøndene hvor disse prøver lå, havde både vildtype og G327 proben bundet til PCR produkterne. Der er 7 kontroller og 2 probander blandt prikkerne. Den indringede prik er kontrol 6.(se senere i resultaterne) De røde prikker i bunden er de prøver som kun den ene af proberne havde bundet til. Disse skal ikke bruges videre i forsøget. De sorte prikker er de prøver hvor lyssignalet ikke var der og proberne havde formodentligt ikke bundet. Til analysering vha. QAS-TD blev registreringsnumrene til de grønne prøver noteret så det rigtige cdna materiale blev fundet. cdnaet lå i tre 384 plader i -20 C fryseren. På tre A4-ark var systemet over prøverne indtegnet, men det var lidt i uorden og pile var tegnet med henvisninger imellem brøndene. 3.3 Gel Dokumentation For at dokumentere at primerne havde virket under hver PCR, blev der lavet en gel dokumentation alle tre gange forsøget blev udført. Før PCR sættes i gang er PCR produkternes længde allerede kendt på baggrund af afstanden mellem primernes placering. Med den viden, forventes det at PCR produkterne, hvis de er korrekt amplificeret, alle vandrer lige langt gennem gelfeltet da de er af samme længde. Resultaterne sammenlignes med DNA markøren som køres med hver gang. Figur 12: Gel Dokumentation 1x. Øverste række viser en DNA markør i 1. brønd. Brønd 2 og 3 er en negativ dobbeltbestemmelse og viser >100 bp lange produkter, hvilket bare er primere. Brønd 4-17 viser kontrol 1-7. Nr. 7 er det samme som nr. 6, men er ved en fejl hoppet over. Nederste række viser igen en DNA markør i brønd 1. Brønd 2-11 er gamle prøver som RNA blev forsøgt renset op fra for at teste primerne på dem. Resultaterne viser at der ingen RNA er, men derimod 2000 bp lange amplificerede DNA fragmenter. Brønd viser de to probander, men proband nr. 2 er ved en fejl afpipetteret to gange. 31

32 32 Figur 13: Gel dokementation for 2. forsøg. Brønd 1 er DNA markøren. 2 og 3 er negative prøver. Brønd 4 17 er dobbeltbestemmelser af kontroller 1-7. Brønd er dobbeltbestemmelser af de to probander. Brønd 22 og 23 er DNA prøver for kontrol 6, der i det først forsøg ikke viste sig at være som de andre kontroller. Figur 14: Gel Dokumentation for 3. forsøg. Brønd 1 er DNA markøren. Brønd 2 og 3 er dobbeltbestemmelse af negative kontroller. Brønd 4-17 er kontroller nr Nederste række viser først en DNA markør i brønd 1. Derefter i brønd 2-5 kommer dobbeltbestemmelser af probander. De sidste 4 brønde er DNA for kontrol 6 og Sekventering Da forsøget er udført tre gange, er der tre sæt resultater. For hver prøve er der et elektrospherogram for forward primeren og for revers primeren, gange tre. Alle tre sæt har påvist heterozygote resultater(t/c) i alle prøver undtagen kontrol 6. Se figur 16. Følgende billeder er taget fra elektrospherogrammer med de reneste resultater som samtidigt er påbegyndt af forward primeren. 32

33 33 Figur 15: Sekventeringsresultater for probander. I venstre side indikeres, hvilken proband resultaterne foran gælder for. Markøren er indrammet imellem de to sorte lodrette linjer og viser at transskripter fra begge alleler er der. Over udslagene er der bogstaver der fortæller hvilken base er identificeret det sted i sekvensen. Figur 16: Sekventeringsresultater for kontroller 6 af 7 kontroller. Kontrol 5 er fejlagtigt ikke kommet med på billedet. I venstre side står navnet for kontrollen hvis sekvens vises i højre side. Markøren ses mellem de to sorte lodrette streger. Kontrol 6 skiller sig tydeligt ud med transkripter kun fra det ene allel. Ud over resultaterne som vises her, er der prøvet at sekventere DNA for kontrol 6 for at se om det samme resultat ville gå igen. Der er forsøgt to gange, men begge gange har der været forstyrrelser i elektrospherogrammet som har gjort at resultaterne var ulæselige. 33

34 34 For at sikre at mrna er det som sekventeres, finder vi overgangen mellem exon 8 og exon 9. Slut sekvensen på exon 8 er GCAGATTTTG og startsekvensen på exon 9 er TCATGGAGG(se figur7). Billedet herunder viser et sekventeringsresultat for proband 2 med forward primer fra sæt 1. En sort streg omkring base 51 deler de to exons op. Lige før base 71 ses markør G

35 35 Diskussion 4 Diskussion Projektet er blevet igangsat med forventninger om at promoter varianten hos probanderne ville have en betydning for transskriptionen af genet på dette allel. En detekteret forskel mellem transskripterne fra de to alleller på elektropherogrammet, ville have verificeret QAS-TD som en troværdig promoter funktionsanalyse. Resultaterne har vist at promoter variationen ikke er signifikant for transskriptionen og samtidig har kontrol 6 ikke været en del af forventningerne. Disse afvigelser giver grund til nogle overvejelser og kontrol 6 påpeger at den tidligere varetagelse af cdna materialet ikke har været hensigtsmæssig. 4.1 Primere Da primerne er designet manuelt og af uerfarne, har der været en mulighed for at de ikke ville virke. Af denne grund blev der designet to sæt. Efter modtagelsen blev de testet på mrna fra blodet af et gruppemedlem. Resultaterne viste at sæt 1 gav et pænere billede efter gel elektroforesen, se afsnit 3.1 og for resultater og billede af hvordan sæt 1 er lagt. Den negative kontrol ser meget bedre ud på rækken der er amplificeret med sæt 1. Også PCR produkterne er alle vandret lige langt gennem gelen og står pænt på række i forhold til rækken af resultaterne der dokumenterer primer sæt 2 s funktion. På baggrund af dette var det sæt 1 der blev brugt videre i forsøget under PCR og sekventering. Senere i forsøget anvendtes sæt 1 også til TouchDown PCR og sekventering. Under begge analyser har sættet fungeret og der har ikke været tilfælde hvor der ingen PCR produkt var eller at der ingen signaltoppe var på elektropherogrammet efter en sekventering. Havde der været lignende problemer ville primerne have undergået en optimering, hvor MgCl 2 og annealingstemperaturen ville varieres indtil PCR reaktionen virkede. I sidste ende hvis det ikke lykkedes skulle nye primere designes. 4.2 Allelic Discrimination Før der kunne vides hvilke kontroller og probander skulle bruges, var det nødvendigt at kende hvilke af disse havde en heterozygot markør. I forvejen var der oplyst at promoter varianten hos probanderne er heterozygot, hvilket er en vigtig egenskab ved verificering af metode(se senere). Resultaterne har vist at 9 prøver har en heterozygot markør, syv af disse var kontroller og to var probander, se afsnit 3.2. Alle de ni prøver er meget pænt placeret på diagrammet og kontrol 6 ligger også godt, så der er ingen tvivl om at resultaterne er troværdige. DNAet der blev anvendt lå ordentligt i kasser i kølerum. De var sorteret i numerisk rækkefølge under hele forløbet og blev ligeledes afpipetteret til 384-plade i denne rækkefølge. cdna materialet derimod lå i tre 384-plader til hvilke der fulgte tre A4 ark med pile og henvisninger mellem brøndene, hvilket straks forringer troværdigheden af den enkelte prøves afstamning. 35