Undersøgelse af konsekvenserne for koagulationsanalyser ved underfyldt Natrium Citrat Rør.

Transkript

1 Undersøgelse af konsekvenserne for koagulationsanalyser ved underfyldt Natrium Citrat Rør. Studerende: Sigurd Kolstrup, Via nr Hold 18 Uddannelse: Bioanalytiker uddannelsen Uddannelses sted: VIA university college Aarhus Klinisk vejleder: Anne Jaritz-Nielsen Bioanalytikerunderviser Institutions vejleder: Lone Garsdal Krause-Jensen Lektor. Cand.scient. MHH Antal Tegn:

2 Side 1 af 46 Indholdsfortegnelse: Indholdsfortegnelse Side 1 Forord Side 2 Resumé Side 2 Baggrund Side 3 Problemformulering Side 4 Målformulering Side 4 Teori Side 5 Materiale og metoder Side 11 Resultater Side 18 Diskussion Side 26 Konklusion Side 34 Perspektivering Side 35 Referencer Side 36 Bilag Side 38

3 Side 2 af 46 Forord: Mit navn er Sigurd Esben Kolstrup, bioanalytikerstuderende på VIA UC University College Aarhus. Dette projekt er udført som mit modul 14 bachelorprojekt. Projektets praktiske del er blevet udført i samarbejde med tre medstuderende: Helena Brønd, Ida Møller Jørgensen og Lea Nørgaard. I forordet beskrives, hvordan rapporten er udformet. Projekters introduktion er opdelt i punkterne: Baggrund, problemformulering, målformulering og teori. Bilag til rapporten forefindes på den vedlagte USB nøgle, og bilagsafsnittet i rapporten er lavet som en vejledning til at finde de relevante dokumenter på USB nøglen. De anvendte peer review artikler findes ligeledes på USB nøglen. Markeringer af referencer står med rød farve. Jeg har valgt denne markering på grund af dens tydelighed. Er der mere end en referencehenvisning, vil dette blive markeret som fx: X(2; 3) betydende at der henvises til både reference 2 og 3. Jeg vil desuden takke personalet på KBA Holstebro for deres venlighed, samarbejdsvilje og deres hjælp til projektet. Studerendes underskrift Resumé: Dette Projekt blev udført på vegne af Klinisk Biokemisk Afdeling Holstebro, der ønskede at få foretaget en undersøgelse af fyldningsgraden af Natrium Citrat Rørs betydning for koagulationsanalyser. Grunden er at afdelingen ofte modtager Natrium Citrat Rør fra lægepraksis, som kun delvist er fyldt. Da de nuværende retningslinjer dikterer, at sådanne rør skal kasseres, opleves det ofte på afdelingen, at analyserne må genrekvireres. Afdelingen ønskede alle fem koagulationsanalyser, der foretages på Sysmex CS-2100i, undersøgt. Til at undersøge dette er der anvendt en forsøgspopulation på 20 forsøgspersoner, som alle fik taget en prøveserie bestående af 6 rør med Fyldningsgraderne: To 100% rør, et 105% rør, et 90%, et 80% og et 70%. Alle forsøgspersonerne er frivillige, fundet blandt KBA s personale og ambulante patienter. Prøveserierne blev analyseret for INR, APTT, Fibrin d-dimer, Fibrinogen og Antithrombin. Resultaterne blev grafisk afbilledet, og til at vurdere dem anvendtes der Analytiskusikkerhed(1) og Tilladte Totalfejl(1).

4 Side 3 af 46 Resultaterne viste at: INR ratioen forøges ved en lav fyldningsgrad, APTT forandres tilsyneladende ikke, Fibrin d-dimer forandres tilsyneladende heller ikke, Fibrinogen koncentrationen bliver mindre ved en lav fyldningsgrad, og Antithrombin koncentrationen bliver mindre ved en lav fyldningsgrad. Resultaterne viste en stor statistisk usikkerhed, og der kunne ikke påvises nogen klinisk relevant afvigelse fra 100% fyldningsgraden på nogen af fyldningsgraderne: 105%, 90%, 80% og 70% Baggrund: Til koagulationsanalyser, anvendes prøvetagningsglas indeholdende 0,3 ml flydende natriumcitrat, som virker antikoagulerende når det kommer i kontakt med blodet(2). Natriumcitratet fortynder blodet og det er derfor vigtigt at koagulationsglassene fyldes korrekt, så man kan stole på fortyndingsfaktoren. På koagulationsglas findes en afmærkningsstreg, der angiver korrekt fyldning(3). Hvis patienten er svær at stikke og/eller hvis blodet løber meget langsomt, er det ikke altid muligt at fylde glasset korrekt og som arbejdsgangen er i dag, kasseres disse koagulationsglas til koagulationsanalyser. Koagulationsglassene skal tages som det første glas i prøvetagningsrækkefølgen, både for at være sikker på korrekt fyldning (ved svær blodprøvetagning) og pga. kontaminering fra de andre prøvetagningsglas. Omvendt kendes effekten af overfyldte glas heller ikke, hvor der ved en usikkerhed i koagulationsglassenes vakuum kan ske, at der trækkes mere blod ned i glasset end til den angivne streg. Herved bliver fortyndingsforholdet mindre. Disse prøver kasseres ikke, da man på afdelingerne bruger afmærkningsstregen som et minimum, og fyldningen af glasset stoppes, når vakuummet fra prøvetagningsrøret udlignes. Når blodprøver til koagulationsanalyser tages på Klinisk Biokemisk Afdeling, Hospitalsenheden Vest (KBA HEV), og det ikke er muligt at fylde glassene korrekt, noteres det på blodprøvetagningsblanket (PTB), så bioanalytikeren på næste runde er opmærksom og forhåbentlig kan tage en ny brugbar prøve. For patienter, som får taget deres blodprøver ude i lægepraksis, er situationen en anden. Når prøverne modtages på KBA HEV vil glas, med utilstrækkeligt prøvemateriale, blive kasseret og patienten er derfor nødt til at møde op til en ny blodprøvetagning. I begge tilfælde er det generende for patienten, da de skal stikkes igen og svartiden vil blive forlænget. Det vil altså være en fordel for både patienter, rekvirent og bioanalytikere, at forkert fyldte glas vil kunne bruges. På KBA HEV, anvendes der som hovedregel kanyler til venepunktur, men af og til kan det være nødvendigt at bruge sommerfuglenål for eksempel hvis det vurderes at patienten er svær at stikke. Da glas til koagulationsanalyser, skal tages som det første i rækken, er man her nødt til at bruge et spildglas, da luften i slangen kan have indflydelse på fortyndingsfaktoren(4). På andre KBA er anvendes udelukkende sommerfulgenåle til blodprøvetagning og de har derfor et større forbrug af spildglas. På baggrund af projektet Effect of primary tube underfilling and hemolysis on PT, APTT, Antithrombin and D-Dimer assays; Implementing the pre-analytical sample integrity checks of the Sysmex CS-2100i System har man bl.a. undersøgt betydningen for analyseresultaterne, når koagulationsglas ikke bliver fyldt korrekt. Ved, kontrolleret, at fylde glas forkert ned til 50 % -

5 Side 4 af 46 har de analyseret prøverne for fire almindelige koagulationsfaktorer. Deres resultater viser at man ned til 70 % fyldningsgrad, opnåede resultater der ikke afveg i sådan en grad, at det havde klinisk betydning for patienten(5). Det er interessante resultater, da det kan betyde at man ikke nødvendigvis skal kassere alle forkert fyldte glas, samt at man muligvis ikke er nødt til at anvende et spildglas, når man anvender sommerfuglenåle til blodprøvetagning til koagulationsanalyser. Vi vil med vores projekt genskabe dele af det hollandske forsøg, for at undersøge hvor lidt glassene kan være fyldt og samtidig vil give analyseresultater uden det har klinisk betydning. Det kan give nye retningslinjer til afdelingens bioanalytikere, for analysering af patientprøver på Sysmex cs2100i, fra Siemens uden at det har kliniske betydning for patienten. Problemformulering: Hvad er konsekvensen af ukorrekt fyldningsgrad af glas på koagulationsanalyserne, koagulationvævsfaktorinduceret KF II, VII, X (INR), Aktiveret Partiel Thromboplastintid (APTT), Fibrinogen (koagulations faktor I), Antithrombin (AT), Fibrin (D-Dimer) og hvilken klinisk betydning har det? Målformulering: Vi vil: Undersøge betydningen af fyldningsgraden af koagulationsglassene for de fem koagulationsanalyser: Koagulation-vævsfaktorinduceret KF II, VII, X (INR) Aktiveret Partiel Thromboplastintid(APTT) Fibrinogen(Koagulations faktor I) Antithrombin(AT) Fibrin D-Dimer Dette gøres ved at fylde 6 koagulationsglas henholdsvis 70 %, 80 %, 90 %, 2 x 100 % og 105 % fra hver af de 20 forsøgspersoner (10 raske personer og 10 patienter), som analyseres for alle fem koagulationsanalyser. For hver af de fem analyser udregnes en middelværdi for alle fyldningsgraderne. På middelværdierne vil vi se, om der er en signifikant forskel. Dette vil vi afbilde i grafer og beregne med relevante statiske metoder, alt efter hvad resultaterne viser.

6 Side 5 af 46 Undersøge om der er en forskel i analyseresultaterne i forhold til hvilken rækkefølge vi skal tage vores fem koagulationsglas, fordi det kan tænkes at koagulationen er mere fremskreden i de sidste glas. Dette gøres ved at lave et pilotforsøg, hvor der tages fem koagulationsglas, med korrekt fyldt volumen, på tre forsøgspersoner. Disse analyseres for INR og APTT. Resultaterne vil vi grafisk afbilde og der laves en variansanalyse. Undersøge hvor stor en procentdel dødvolumen af slangen, på sommerfuglenålen er, i forhold til om brugen af spildglas kan undgås. Teori: Prøvetagning: Til prøvetagning til koagulationsanalyser anvendes der veneblod, der udtages i BD Vacutainer rør af typen sodium citrate tube(natrium Citrat rør(ncr)). Det der adskiller NCR fra andre typer rør er at der i denne type er antikoagulans en væske der udgør 10% af rørets total volumen(2), i modsætning til andre rørtyper hvor antikoagulanset er coatet på indersiden af røret. Under normale omstændigheder skal antikoagulationsvæsken og veneblodet sammenblandes i forholdet 1:9, dette forhold skal overholdes. Et NCR har en minimum fyldningsmarkering. Grunden til at blandingsforholdet skal overholdes er, at antikoagulationsvæsken, hvis blandet med for lidt blod, vil fortynde veneblodet og derfor kunne give et resultat, der afviger ved enten at give et større eller mindre analyseresultat. Iteorien vil en fortynding af veneblodet Som de fleste andre rørtyper indeholder NCR vakuum, som skal trække veneblod fra venen gennem kanyler og slange på sommerfuglen og ud i røret. Som antikoagulans anvendes der citrat(2), der når det kommer i kontakt med veneblod vil binde sig til positivt ladede ioner, deriblandt calcium ioner. Dette vil medføre at der ikke vil være frie calcium ioner i blodprøven og koagulationen vil blive standset. Grunden til at manglen på calcium ioner har en hæmmende virkning på koagulationen er at calcium ioner indgår som co-faktor for flere af koagulationsfaktorerne(6). Det sker dog at et NCR ikke fyldes korrekt, dette kan der være forskellige årsager til: Patienten kan være svær at stikke, veneblodet kan løbe så langsomt at det vil tage alt forlang tid til at fylde røret op til minimumsstregen, eller NCR et kan være så gammelt at vakuummet ikke længer er kraftigt nok til at fylde røret op til minimumsstregen. Der er endnu ikke foretaget et tilstrækkeligt antal undersøgelser til at man med sikkerhed kan sige, hvilken effekt det har på koagulationsanalyserne, hvis NCR et ikke er fyldt op til minimumsstregen eller modsat hvis NCR et er overfyldt. Dertil er der ikke nogen retningslinjer for, hvor langt ned i forhold til minimumsstregen man kan gå i fyldningsgrad, før man får et fejlagtigt analyseresultat. Og endelig om en afvigelse i fyldningsgraden har samme indflydelse på alle analyserne.

7 Side 6 af 46 Der er dog fortaget projekt undersøgelser, der har resulteret i enkelte artikler som vil blive brugt som inspiration til designet af dette projekt. Det projekt som er blevet brugt som inspirationskilde til dette projekt, er et hollandsk projekt med titlen Effect of primary tube underfilling and hemolysis on PT, APTT, Antithrombin and D-dimer assays; Implementing the pre-analytical sample integrity checks of the Sysmex CS-2100i System (5). Dette projekt vil afvige fra det hollandske projekt på følgende måder: For det første er fibrinogenanalysen ikke medtaget i det hollandske projekt, men indgår i dette. Derudover går de fyldningsgrader der bliver anvendt i det hollandske projekt ned til 50%, mens der i dette kun gås ned til 70%. Grunden til at der i dette projekt ikke anvendes 50% og 60% er, at det på baggrund af de hollandske resultater kunne det ses, at man ville få for afvigende resultater(5). Koagulationskaskaden: Koagulationskaskaden består af tre dele: Intern aktiveringsvej Ekstern aktiveringsvej Fælles aktiveringsvej Den interne aktiveringsvej starter med at blodet kommer i kontakt med beskadiget vævsoverflade. Dette bevirker, at faktor XII bliver aktiveret til XIIa. XIIa vil aktivere faktor XI til XIa. XIa vil aktivere Faktor IX til IXa. IXa vil danne et kompleks med VIIIa. Dette kompleks vil, under tilstedeværelsen af Ca 2+ og fosfolipider, aktivere Faktor X til Xa, og dermed er koagulationskaskaden gået over fra den interne aktiveringsvej til den fælles aktiveringssvej(8). Den eksterne aktiveringsvej foregå ved at der opstår vævsskade, vævsskaden vil blotlægge vævet under endotelcellerne. Blodet vil dermed komme i kontakt med vævets vævsfaktorer(tf III). TF III vil aktivere Faktor VII til VIIa. VIIa vil danne et kompleks med TF III der, under tilstedeværelsen af Ca 2+, aktiverer Faktor IX og X til IXa og Xa og dermed er koagulationskaskaden gået over fra den eksterne aktiveringsvej til den fælles aktiveringsvej(6). Den fælles aktiveringsvej starter med at Xa vil omdanne prothrombin til thrombin. Thrombin vil aktivere faktor V og VIII, samt faktor XI. Faktorerne VIIIa og IXa vil danne et kompleks på thrombocytternes overflade som øger aktiveringen af faktor X til Xa, som vil gå sammen med Va og danne prothombinase som yderligere vil øge omdannelsen af prothrombin til thrombin. Thrombin vil aktivere XI til XIa. XIa vil få IXa til at dannes på thrombocytternes overflade. Den høje koncentration af thrombin vil aktivere yderligere thrombocytter, faktor V og VIII, og få fibrinogen til at blive omdannet til fibrin og faktor XIII, så fibrin krydsbindes og der dannes et stabilt koagel(6,8). Når et koagel ikke længere er nødvendigt, når vævsskaden er blevet udbedret, vil koaglet blive opløst ved en proces der kaldes fibrinolyse. Fibrinolysen starter med at enzymet Plasminogen bliver

8 Side 7 af 46 omdannet, af enten af urokinase(upa) eller af vævstype plasminogen aktivatoren(tpa), til plasmin. Plasmin vil nedbryde fibrinogen, krydsbundet fibrin og fibrin til fibrin degradation products (FDP). FDP vil have en hæmmende virkning på koagulationskaskaden. Særligt interessant er nedbrydningen af krydsbundet fibrin, da Fibrin d-dimer her opstår som et nedbrydningssprodukt(8). Analyserne: Fældes for alle analyserne er at de bliver fortaget på en sysmex CS-2100i, alle analyserne fortages i kuvetter og analyse reaktionen bliver detekteret ved hjælp af multi-bølgelængde lysdetektion(9). Detektor: Som detektor i sysmex CS-2100i anvendes der en multi-bølgelænge lysdetektor. Denne lysdetektor består af en lyskilde(halogenpære), et filter, optiske fiber og lysdioder. Filteret filetere lyset op i fem bølgelængder, 340 nm, 405 nm, 575 nm, 660 nm og 800 nm, som gennem optiske fibre føres til detektor brønden hvor lyset gennem lyser prøve kuvetten inden det rammer lysdioden(9). Figur 2. skematisk illustration af CS-2100i s detektor. Illustrationen er hentet fra CS-2100i brugsvejledningen. Se bilag 2 Sysmexs analysemetoder(9): Sysmex CS-2100 har tre metoder at analysere koagulationsanalyser på: Koagulations metode Kromogen metode Immunanalyse metode Koagulationsmetode Koagulationsmetoden foregå ved at måle på spredningen af lys i prøvematerialet. Metoden udføres ved at definere lys intensitetsniveauet, efter at koagulations reagenset er tilsat til prøvematerialet,

9 Side 8 af 46 som 0% og definere lys intensitetsniveauet når koagulationen er færdig som 100%. Koagulationen startes og den tid det tager for lys intensitetsniveauet at falde til en forud bestemt detentionsprocent(i Fg 1 neden for der det sat til 50%) defineres som koagulationstiden(9). Figur: 1 illustration af procentdetetktionsmetoden. Illustrationen er hentet fra CS-2100i brugsvejledningen. Se bilag 2 Koagulationsmetoden anvendes til tre koagulations analyser: INR APTT Fibrinogen Koagulation-vævsfaktorinduceret KF II, VII, X (INR) Denne analyse bruges til at måle hastigheden af den eksterne aktiveringsvej af koagulationskaskaden. Analysen foretages ved at komme blodplasma i en kuvette som man tilsætter vævsfaktorer og fosfolipider, og ved at tilsætte calcium ioner igangsættes koagulationen. Ved at måle tiden fra man tilsætter calcium til koaglet opstår, kan man måle, hvor lang tid det tager for den eksterne koagulationskaskade at danne et koagel(10). I teorien vil en fortynding af veneblod give en forhøjet INR, da fortynding vil resultere i en forlænget koagulationstid. Til måling af vævsfaktorinduceret koagulation anvender man International Normalized Ratio (INR). Grunden til at man anvender INR og ikke bare tid i sekunder er, at hvis resultatet kommer i sekunder, kan det være vanskeligt at vurdere resultatet. Reaktion sker normalt med en hastighed på Ca sekunder, dette korte tidsinterval gør det vanskeligt at vurdere om en prøve der har en forkortet eller forlænget på grund af patologisk tilstand eller skyldes analyse usikkerhed(6). INR beregnes på følgende måde: INR = ( Koagulations tid, prøve Koagulations tid, standard )ISI (6)

10 Side 9 af 46 Analysen bruges til at kontrol af antikoagulationsbehandling, kontrol før operative indgreb og bedømmelse af leverfunktion ved mistanke om nedsat koncentration af K-vitamin-afhængige koagulationsfaktorer. Analysen anvendes i to versioner, KFTT(Koagulationsfaktor Terapeutisk Test) og KFNT(Koagulationsfaktor Normal Test)(6). Fælles for de to INR typer er, at prøvematerialet skal centrifugeres hurtigst muligt efter venepunktur. Prøvematerialets holdbarhed afhænger af, om prøven er en KFTT eller KFNT. For KFTT prøver er holdbarheden 3 døgn ved 20 o C og 1 måned ved -20 o C. For KFNT prøver er holdbarheden 2 timer ved 20 o C og 3 døgn ved -20 o C.(6 s.308) Referenceintervallet for INR analysen (KFTT) er: 0,70-1,30(6) Referenceintervallet for INR analysen (KFNT) er: 2,0-4,5(6) Aktiveret Partiel Thromboplastintid(APTT): Hvor INR anvendes til at vurdere den eksterne koagulationskaskade, så anvendes APTT til at vurdere den interne koagulationskaskade.(6) Analysen foretages ved at blande citratplasma op med reagens indeholdende aktiverende stoffer, fx Kisel- eller kaolin partikler samt fosfolipid. Herefter inkuberes prøven ved 37 o C i et fastlagt tidsinterval. Derefter tilsættes der calcium ioner som starter koagulationskaskaden, og tiden måles. I modsætning til INR så gives analysesvaret i tid(sekunder) og ikke i en ratio(11; 6). I teorien vil en fortynding af veneblod give en forlænget APTT, da fortynding vil resultere i en forlænget koagulationstid. APTT analysen anvendes til monitorering af patienter der er i heparinbehandling, diagnosticering og monitoring af en lang række sygdomme, så som: Hæmofili (nedarvet eller erhvervet), mangel på faktor XII og faktor XI, leversvigt, K-vitaminmangel, nedsat fibinogen og behandling med K- vitamin-antagonister.(6) Prøvematerialet er holdbart i op til en time som fuldblod, som blodplasma er prøvematerialet holdbart i op til, 2-4 timer, ved 20 o C. Ved -20 o C er blodplasma holdbart i op til 1 måned.(6 s.53) Referenceintervallet for APTT analysen er: sekunder for voksne og børn(6)

11 Side 10 af 46 Fibrinogen (Koagulations faktor I) Fibrinogen er et glykoprotein, hvis funktion er at blive omdannet til fibrin som anvendes til at danne et stabilt koagel ved et område hvor der er opstået vævsskade. Dette gøres ved at de enkelte fibrintråde krydsbinder sig til både de aktiverede thrombocytter og til andre fibrin tråde, derved skabe et net af tråde der sammenbinder og fastholder de aktiverede thrombocytter(6). Analysen foretages ved at man i en kuvette tilsætter citrat plasma. Thrombin, med en kendt enzym aktivitet, tilsættes. Ved at måle tiden det tager for plasmaet at danne et koagel kan man beregne mængden af fibrinogen(12). I teorien vil en lav fyldningsgrad resultere i en lav fibrinogen koncentration, da den lave fyldningsgrad vil medføre at prøven bliver blandet op med mere antikoagulans end tiltænkt, og analyseapparatet vil dermed afpipetere en fortyndet prøve. Fibrinogenanalysen anvendes ved blødning uden en kendt årsag, monitoring af reumatoid arthritis, prognosticering af småcellet lungecancer, mistanke om fibrinolyse og som opfølgende analyse ved en høj Sedimentationsreaktion uden klar årsag(6). Prøvematerialet er holdbart op til 4 timer som fuldblod. Som blodplasma er prøvematerialet holdbart i op til et døgn, ved 20 o C. Ved -20 o C er blodplasma er holdbart i op til en måned. (6 s.215) Referenceintervallet for Fibrinogen analysen er: 5-10 μmol/l for voksne og børn over 1 år(6 s.215) Kromogen metode Kromogen metoden udføres ved at få et enzym til at omdanne et kromogent substrat til farvestof som det er muligt at måle fotometrisk. I de tilfælde hvor der skal måles på et enzym i plasma tilsættes der en kendt mængde substrat. Ved at måle på absorbans over tid er det muligt at beregne en koncentration af enzymet. Hvis der skal måles et enzym hæmmende stof i plasma, tilsættes der en kendt mængde aktivt enzym og ved efterfølgende at til en kendt mængde kromogent substrat, er det muligt, ud fra faldet i enzymaktivitet, at beregne mængden af enzym hæmmende stof i prøven(9). Kromogen metoden anvendes til koagulations analysen: Antitrombin Antithrombin(AT) Antithrombin er et glykoprotein hvis formål er at hæmme koagulationen, dette er nødvendigt for at forhindre at blodet koagulerer i årerne. De faktorer som antithrombin virker hæmmende på er: II, VII og X, dertil virker antithrombin hæmmende på IXa, XIa og XIIa. Antithrombin virker ved at binde sig kovalent til de koagulationsfaktorer der er af serinprotease typen(6 s.98). Antithrombinanalysen foretages ved at tilsætte citratplasma til en kuvette. Kuvette tilsættes heparin, som øger antithrombinens effektivitet. Herefter tilsættes der Xa, som vil blive inaktiveret af antithrombinen, der på grund af heparinens aktivitetsøgende effekt, vil blive brugt op. Derefter

12 Side 11 af 46 tilsættes der et kromogent substrat der vil blive spaltet af det tilbageværende aktive Xa. Ved at måle absorbansen over tid er det muligt at beregne, hvor meget Xa der er blevet inaktiveret, og dermed kan man beregne sig til hvor meget antithrombin der var i prøven(13). Resultatet gives i k(iu)/l(6 s.98) I teorien vil en lav fyldningsgrad resultere i en lav antithrombin koncentration, da den lave fyldningsgrad vil medføre at prøven bliver blandet op med mere antikoagulans end tiltænkt, og analyseapparatet vil dermed afpipetere en fortyndet prøve. Antithrombinanalysen anvendes til diagnosticering af venøse tromboser, diagnosticering af dissemineret intravaskulær koagulation og til diagnosticering og monitoring af leversygdom og nefrotisk syndrom(6). Prøvematerialet er holdbart i 4 timer ved 20 o C, og i 2 måneder ved -20 o C.(6 s.98) Referenceintervallet for Antithrombinanalysen er: 0,80-1,20 k(iu)/l(6 s.98) Immunoanalyse Immunoanalysen udføres ved at tilsætte partikler, der er coatet med antistof, til prøvematerialet. Hvis der er epitoper som antistoffet har affinitet til, vil der opstå en agglutination. Dette vil medføre en stigende turbiditet. Ved at måle på prøvematerialets turbiditet over tid er det muligt at beregne en koncentration i prøvematerialet(9). Immunoanalyse metoden anvendes til koagulations analysen: Fibrin D-Dimer. Fibrin d-dimer Fibrin d-dimer er et specifikt nedbrydningsprodukt der opstår, når krydsbundet fibrin nedbrydes. Da fibrin D-dimer er et nedbrydningsprodukt vil tilstedeværelsen af Fibrin d-dimer afsløre en igangværende fibrinolyse(6; 7). Fibrin D-dimer analysen foretages ved brug af antistoffer. Man anvender monoklonalt antistof, der er kovalent coated på polysyrenpartikler. Da D-dimer har en dobbeltsymetrisk struktur, er der ikke brug for et sekundært antistof. Hvis der er d-dimer i citratplasmaet, vil en positiv reaktion ses som en stigning i turbiditet(uklarhed) som vil kunne detekteres som en stigende absorbans i analysekuvetten(14). I teorien vil en lavere fyldningsgrad ikke have den store indflydelse på analyseresultaterne for d- dimer. Dette skyldes at immunoanalyser har en meget høj sensitivitet og kan danne en agglutination, selvom prøvematerialet er fortyndet. Da fibrin d-dimer forekommer i meget små mængder, er det muligt, når rådata omregnes til relativ værdi i procent, at man vil få stor forskel mellem de enkelte fyldningsgrader. Analysen bruges til diagnosticering af lungeemboli og/eller dyb venetrombose(6 s.212). Prøvematerialet kan holde sig i en time, ved 20 o C, som fuldblodsprøve. Efter at have været centrifugeret vil prøvematerialet kunne holde sig i 8 timer ved 20 o C som ren plasma. Plasmaet vil kunne holde sig i tre døgn ved -20 o C.(6 s.212) Referenceintervallet for Fibrin D-dimer er > 0,5 mg/l(6)

13 Side 12 af 46 Materialer og metoder: Materialer: Apparatur: sysmex CS-2100i Billedet er taget med iphone, taget på KBA Holstebro Natrium Citrat rør, med 0,3 ml 3,2% natrium citrat Billedet er taget med iphone, taget på KBA Holstebro Sommerfuglenåle med særskilt adapter af typen: Blodprøvesæt u/sikk. surflo MNSV21NQ 30 cm. Eppendorf Centrifuge 5810 R Billedet er taget med iphone, taget på KBA Holstebro

14 Side 13 af 46 Pean Billedet er fundet på Google med søgeordet Pean Analysevægt Analysereagenser: INR(10,15): MediRox Owrens PT, MediRox Owren Buffer, 25 mm CaCl 2 APTT(11,15): Tcoag s TriniCLOT TM aptt HS, 25 mm CaCl2 Fibrinogen(12,15): SIEMENS Dade trombinreagens, OVB buffer Antithrombin(13,15): SIEMENS INNOVANCE Antithrombin reagens, Antithrombin substrat, Antithrombin buffer. Fibrin D-dimer(14,15): SIEMENS INNOVANCE D-dimer reagens, D-dimer buffer.

15 Side 14 af 46 Metoder: Pilotprojekt Pilotprojektet går ud på at tage fem veneblodprøver, taget på normal venepunktursprocedure, i kort rækkefølge fra tre forsøgs personer. Pilotprojektet går ud på at undersøge om rækkefølgen har indvirkning på analyseresultatet. De anvendte analyser er: INR og APTT Til at bevise en varians anvender man F-test. F-testen sammenligner de enkelte stikprøvers Standard afvigelse(sd) med det formål at afgøre, om variansen i stikprøverne er tilfældig eller systematisk(16). Resultatet af f-testen sammenlignes med en kritisk værdi(fkrit). Er f-test < fkrit, er variansen tilfældig og der kan ikke påvises statistisk signifikant varians. Er f-test > fkrit, er variansen systematisk, og der kan påvises statistisk signifikant varians(16). Præcision For at få Sysmex CS-2100i analytiske præcision er det blevet besluttet at fortage en tredobbelt bestemmelse af APTT, på samme prøve. For at kunne bestemme analyseapparatets analytiske præcision er det blevet besluttet at beregne en CV %. CV % bruges til at udregne den tilfældige målefejl for en given analyse. Til udregning af sysmex s CV %, blev det besluttet at anvende et NCR som blev analysere tre gange for APTT, CV % blev beregnet ud fra formlen(17): CV% = ( ) 100 Middelværdi SD Projektet Antal forsøgsdeltagere: Det er blevet besluttet at anvende to grupper forsøgspersoner, en gruppe bestående af 10 raske personer og 10 syge personer. De 10 raske forsøgspersoner blev fundet mellem frivillige fra KBA Holstebros personale. Formålet med at anvende en rask forsøgspersongruppe er at få resultater der med stor sandsynlighed ville ligge indenfor analysernes referenceinterval De 10 syge forsøgspersoner blev fundet mellem frivillige blandt ambulante patienter der skulle have fortaget en, eller flere, af de fem koagulationsanalyser. Formålet med at anvende en syg forsøgspersongruppe er at få resultater som måske ville ligge udenfor analysernes referenceinterval. Alle forsøgspersonerne skal give et informeret samtykke, i modsat fald vil prøvesættet ikke blive taget. Se Bilag 5 for Deltagerinformation om deltagelse i et videnskabeligt forsøg, skriftlig Forsøgspersonerne i projektet var alle anonyme, men da der var en risiko for at en eller flere af forsøgspersonerne ville få et analyseresultat der lå udenfor referenceintervallet, var det nødvendigt at kunne kontakte pågældende person. Da analyseresultaterne alle var markeret med projektets eget

16 Side 15 af 46 nummersystem, var det nødvendigt at registrere forsøgspersonens CPR-nr, for at kunne finde frem til pågældende. Til at tage denne kontakt, og til at vurdere om der skulle reageres på analyseresultater der ligger udenfor referenceinterval, var der tilknyttet en læge til projektet. Forsøgspersonernes CPR-numre er ikke medtaget i denne rapport, da der er tale om fortrolige oplysninger. Fyldningsgrad: Til projektet er det blevet besluttet at gøre brug af fyldningsgraderne 70%, 80%, 90, 100% og 105%. For at kunne fylde rørene i disse nøjagtige mål, blev der afsat en markering på røret med sort tus. Disse streger blev afsat på rørene efter en skabelon af de enkelte fyldningsgrader. Disse skabeloner blev lavet ved at fylde to rør med en nøje afmålt mængde dem. vand, da vand og blod har samme volumen, afpipetteret med en Finn s pipette. Mængden af dem. vand blev beregnet således: 2,7 ml(det antal ml som vakuummet i røret kan opsuge) x fyldningsgraden. Eksempel: 70%. 2,7mL x 0,70 = 1,89 ml Mærkning af Prøverør: For at kunne bevare overblikket over prøverørene, samtidigt med at holde forsøgs deltagerne anonyme, er det blevet besluttet at nummerere prøverørene efter et selvopfundet nummersystem. Nummersystemet består af tolv cifre, startende,(fra højre mod venstre) med fyldningsgraden, efterfulgt af forsøgspersonens nummer(ikke CPR nummer), derefter et 1 eller et 2, og til sidst et 9 ciffer. 1 eller 2 cifret afgør om prøven stammer fra en af de raske eller syge forsøgspersoner. eksempel: de tre bagerste cifre fortæller at prøven har fyldningsgraden 100%, 04 fortæller at prøven er taget fra forsøgsperson nummer fire, 1 tallet fortæller at forsøgspersonen tilhører gruppen af raske forsøgspersoner. De efterfølgende 5 nuller er udfyld, da nummereringen skulle være på tolv cifre. 9 cifret markerer at prøverøret, og dertil hørende analysesvar på sysmex, tilhører projektet og ikke er en del af afdelingens almindelige prøverør. Prøve sæt: Det er blevet besluttet, at til hver enkelt forsøgsperson laves der et sæt bestående af: 1. 70% rør, 1. 80% rør, 1. 90% rør, % og %. Alle prøverør vil få fortaget alle 5 analyser.

17 Side 16 af 46 Prøverækkefølge: For at randomisere projektet mest muligt, er det blevet besluttet at et prøvesæt bliver taget i tilfældig rækkefølge. Blodprøvetagning: Dette projekt anvender normal venepunktur, med sommerfuglenål, hvor man, efter at have gjort brug af spildrør for at tømme slangen for luft, bruger en pean til at klemme sammen om slangen, når man har fyldt røret til den fyldningsgrad man har bestemt. Ved at lukke slangen på denne måde vil prøverne blive taget i et lukket system, og man vil kun skulle fortage én venepunktur, også selvom man skulle blive nødt til at tage enkelte af prøvesættets rør om på grund af fejlfyldninger. Dertil vil blodet der bliver holdt tilbage i slangen, mens de enkelte rør tages af og på slangen, blive udsat for en mere ensartet koagulationsproces, i modsætning til blodet der bliver fordelt med sprøjte. Ved prøvetagningen er det blevet besluttet at tage blodprøverne ved almindelig venepunkturprocedure med den forskel, at mens en bioanalytiker fortager venepunkturen, står en anden bioanalytiker med en pean klar til at klemme sammen om sommerfugl slangen. Idéen er at den første bioanalytiker skal holde prøverøret lodret, og i det øjeblik blodoverfladen rører ved den markerede streg, skal den første bioanalytiker sige til, og den anden bioanalytiker klemmer sammen om slangen og blodstrømmen stopper længe nok til at den første bioanalytiker fjerner det første prøverør, giver det videre til den anden bioanalytiker, og sætte det næste rør på. Imens sørger den anden bioanalytiker for at prøven bliver blandet godt op med antikoagulans. Da påfyldningen af blod foregår på øjemål, er der til prøvetagningen medtaget ekstra prøverør, for det tilfælde at det bliver nødvendigt at kassere prøverør. Prøvepræparering: Da tidsrammen for koagulationsanalyser er omkring 4 timer, blev det besluttet at et prøvesæt maximalt måtte vente 30 min fra prøvetagning til centrifugering. Centrifugering foregår ved 2200 rpm i 10 min. Analysering: Prøverørene sætte på et rack, og analyserne bestilles manuelt på sysmex CS-2100i. Resultaterne bliver printet ud som print screen og manuelt skrevet ind i et resultatskema på et excel ark. Til at kvalitetskontrollere de resultater der analyseres på CS-2100i, anvendes apparatets egne kvalitetskontroller. Falder kvalitetskontrollens værdi uden for den øvre eller nedre acceptgrænse, vil der ikke blive fortaget nogen analyser, før en acceptabel værdi er opnået. Som kontrol anvendes der to typer kontrolmateriale: NKP og OKP NKP er det kontrolprøvemateriale som anvendes på CS-2100i til analysernes normalområder, dvs. NKP giver resultater der ligger indenfor det interval, som man kan forvente hos en rask person.

18 Side 17 af 46 OKP er til gengæld det kontrolprøvemateriale som anvendes på CS-2100i til analysernes afvigende værdier, dvs. OKP giver resultater der er afviger fra normalværdierne. Analyserne INR, APTT og Fibrin D-dimer, afviger i OKP ved at være højere end normalværdierne. og Antithrombin og Fibrinogen afviger ved at være lavere end normalværdierne. Databehandling: Til behandling og vurdering af projektdata anvendes der fire typer Diagrammer: Almindeligt stregdiagram startende fra 70 % fyldningsgrad og fortsættende i numerisk rækkefølge til 105 % fyldningsgrad. Dette anvendes til at fortage en indledende vurdering af resultaterne. Diagrammet indeholder resultaterne fra alle 20 prøvesæt, hvilket kan gøre det vanskeligt at skelne graferne fra de enkelte prøvesæt. Til de tre andre diagrammer anvendes Relativ analysesvar(%) i stedet for rådata, relativ analysesvar beregnes som(1): Analyse svar Relativ analysesvar = ( Udgangsværdi ) 100 Som udgangsværdi anvendes middel værdierne af 100% fyldningsgraderne. Analyse Middelværdi diagrammet vil vise middelværdierne af de relative analysesvar fra alle tyve prøvesæt, startende med fyldningsgrad 105%, gående videre med 100%, 90% og 80%, for at ende med 70%(1). Til at vurdere om middelværdierne afviger signifikant fra 100 % anvendes der en øvre og en nedre grænse beregnet ud fra de enkelte analysers Bias% max (18) værdi. Dertil er de enkelte punkter i grafen markeret med fejllinjer(1). Fejllinjerne vil vise en ± % værdi, som vil blive beregnet ud fra et 90 % -konfidensinterval for hvert gennemsnit(1). Den fremkommende værdi vil blive vurderet i forhold til den øvre og nedre grænse. Ligger fejllinjerne indenfor den øvre og nedre grænse, vurderes middelværdien til at være anvendelig. Ligger fejllinjerne delvist indenfor den øvre og nedre grænse, vurderes middelværdien til hverken at være anvendelig eller uanvendelig, men betragtes som et tvivlstilfælde(1). Ligger fejllinjerne; og middelværdi punktet, udenfor den øvre og nedre grænse vurderes middelværdien til at være uanvendelig. 90 % -konfidensintervallet beregnes som(1) n = 20 90% konfidens = relative anlaysesvar middelværdi ± 1,65 2 CV% ana se bilag 6. E-dok KOA CV% ana Analyse Tilladte totalfejl(tf) diagrammet viser alle punkterne fra de tyve prøvesæt, startende med 105%, gående videre med 100%, 90% og 80%, for at ende med 70% Til at vurdere om punkterne afviger signifikant fra fyldningsgrad 100 % anvendes der en øvre og en nedre grænse beregnet ud n

19 Side 18 af 46 fra de enkelte analysers Tilladte totalfejls max værdi. Den tilladte totalfejls max værdi udregnes efter følgende formel(1): Tilladte totalfejl = 1,65 CV% max + Bias% max I tilfælde af, at en eller flere af en fyldningsgrads punkter falder udenfor grænserne, vil den pågældende fyldningsgrad blive betragtet som uegnet. I tilfælde af, at en fyldningsgrads punkter alle falder indenfor grænserne, betragtes pågældende fyldningsgrad som egnet(1). Dødvolumen projekt Dette projekt har til formål at undersøge, hvilken fyldningsgrad et NCR vil få, hvis venepunkturen udføres uden spildrør. Projektet vil blive udført ved at tage 3 sæt rør. Sættene vil bestå af to rør. Rørene vil blive fyldt med vand ved brug af sommerfuglenåle, en til hvert sæt. Det første rør vil blive fyldt med vand og luft fra sommerfugleslangen. Det andet rør vil blive fyldt med vand. Rørene afvejes på en analysevægt. Rørenes vægt trækkes fra hinanden. Den beregnede difference omregnes fra gram til ml. Differencen divideres med NRC s volumen(2,7 ml) og ganges med 100. Fyldningsgraden findes ved at trække den beregnede % fra 100 % Sand værdi: Til at fungere som sandværdi til vurdering af resultaterne, vil der blive gjort brug af prøvesættenes 100% fyldningsgrad. Denne middelværdi fås ved at tage to rør til 100% fyldning. Disse rør vil begge blive dobbelt bestemt, og ud fra de fire resultater vil der blive beregnet en middelværdi. Søgningsprotokol: Bemærk at der i denne søgningsprotokol kun er medtaget de søgninger der gav et resultat, for de søgninger der ikke gav noget resultat se bilag 7 søgningsprotokol Artikel: The Effects of Inaccurate Blood-sampel Volume on Prothrombin Time(PT) and Activated Partial Thrombopalstin Time(APTT) Fundet på Wep of Science ved brug af søgeordene: inaccurate blood sample volume Artikel nr. 4 Artikel: Minimum Citrate Tube Fill Volume for Routine Coagulation Testing Fundet på Web of Science ved brug af søgeordene: Citrate tubes, kategori Hematology Artikel nr. 2

20 INR Ratio Sekunder Sigurd Kolstrup. Side 19 af 46 Artikel: Validation of the Minimal Citrate Tube Fill Volume for Routine Coagulation Tests on ACL TOP 500 CTS (R) Fundet på Wep of Science ved brug af søgeordene: Citrate tubes, kategori Hematology Artikel nr. 7 Resultater: Rådata: For rådata se bilag 8 databehandling ark Rådata Pilot projekt: For beregninger se bilag 8 databehandling ark Pilotprojekt 31,0 30,5 30,0 29,5 29,0 28,5 28,0 27,5 27,0 26,5 26,0 APTT Rør 1 Rør 2 Rør 3 Rør 4 Rør 5 Prøverør APTT FP 1 APTT FP 2 APTT FP 3 Graferne illustrerer APTT resultaterne i pilotprojektet 1,06 1,04 1,02 1,00 0,98 0,96 0,94 0,92 0,90 INR Rør 1 Rør 2 Rør 3 Rør 4 Rør 5 Prøve rør INR FP 1 INR FP 2 INR FP 3 Graferne illustrerer INR resultaterne i pilotprojektet

21 Side 20 af 46 F-test: Beregnet f-værdi: 0,6674 F-krit værdi: 2,8661 Ingen statistisk varians påvist Præcisionsprojekt For beregninger se Bilag 8 databehandling ark Præcisions projekt INR (enhed) APTT (sek) D-Dimer (mg/l) Fibrinogen (μmol/l) Antithrombin (int.enhed/l) 1,08 26,4 0,37 8,35 1,09 1,07 26,6 0,37 8,22 1,05 1,07 26,6 0,36 8,22 1,09 1, , , , , Middel 0, , , , , SD 0, , , , , CV%

22 INR ratio Sigurd Kolstrup. Side 21 af 46 Projektet: For beregning af og resultater for 100% middelværdi se Bilag 8 databehandling ark 100% Middel INR: For beregning af data, se Bilag 8 databehandling, ark Grafer og ark INR 4 3,5 3 2,5 INR 2 1,5 1 0,5 0 70% 75% 80% 85% 90% 95% 100% 105% 110% Fyldningsgrad Grafenerne illustrerer INR resultaterne i projektet

23 Relativ værdi ift. 100% Sigurd Kolstrup. Side 22 af INR Middelværdi % 100% 90% 80% 70% Fyldnings grader Punkterne illustrerer INR Middel resultaterne i projektet. De sorte stiplede linjer markerer den øvre og nedre max Bias grænse som Westgard data basen angiver. De blå linjer markerer den øvre og nedre max Bias grænse som KBA NKP Bias max værdi angiver. De røde stiplede linjer markerer den øvre og nedre max Bias grænse som KBA OKP Bias max værdi angiver. Fejllinjerne angiver analyseusikkerheden beregnet ud fra KBA OKP CV% max værdi (se bilag 6 for CV% max værdierne og se i metodeafsnittet for analyseusikkerhedsformlen) Bias grænsen beregnes som 100% ± Bias% max (18)

24 Relativ værdi ift. 100% Sigurd Kolstrup. Side 23 af INR Tilladte totalfejl % % 100% 90% 80% 70% Fyldninsgrad Punkterne illustrerer de enkelte INR resultaters relative afvigelse fra 100% fyldningsgrad i %. De sorte stiplede linjer markerer den øvre og nedre max tilladte totalfejlsgrænse beregnet ud fra de værdier som Westgard data basen angiver. De blå linjer markerer den øvre og nedre max tilladte totalfejlsgrænse som KBA NKP Bias% max og CV% max værdier angiver. De røde stiplede linjer markerer den øvre og nedre max tilladte totalfejlsgrænse som KBA OKP Bias% max og CV% max værdi angiver.

25 Relativ værdi ift. 100 % Sekunder Sigurd Kolstrup. Side 24 af 46 APTT For beregning af data, se Bilag 2 databehandling, ark Grafer og ark APTT 60 APTT % 75% 80% 85% 90% 95% 100% 105% 110% Fyldningsgrad Graferne illustrerer INR resultaterne i projektet 106 APTT Middelværdi % 100% 90% 80% 70% Fyldningsgrad Punkterne illustrerer APTT Middel resultaterne i projektet. De sorte stiplede linjer markerer den øvre og nedre max Bias grænse som Westgard data basen angiver. De blå linjer markerer den øvre og nedre max Bias grænse som KBA Bias max værdi angiver.

26 Relativ værdi ift.100% Sigurd Kolstrup. Side 25 af 46 Fejllinjerne angiver analyseusikkerheden beregnet ud fra KBA OKP CV% max værdi (se bilag 6 for CV% max værdierne og se i metodeafsnittet for analyseusikkerhedsformlen) Bias grænsen beregnes som 100% ± Bias% max (18) 115 APTT Tillade totalfejl % % 100% 90% 80% 70% Fyldningsgrad Punkterne illustrerer de enkelte APTT resultaters relative afvigelse fra 100% fyldningsgrad i %. De sorte stiplede linjer markerer den øvre og nedre max tilladte totalfejlsgrænse beregnet ud fra de værdier som Westgard data basen angiver. De blå linjer markerer den øvre og nedre max tilladte totalfejlsgrænse som KBA NKP Bias% max og CV% max værdier angiver. De røde stiplede linjer markerer den øvre og nedre max tilladte totalfejlsgrænse som KBA OKP Bias% max og CV% max værdi angiver.

27 Relativ værdi ift. 100% Febrin D-Dimer mg/l Sigurd Kolstrup. Side 26 af 46 Fibrin D-dimer For beregning af data, se Bilag 2 databehandling, ark Grafer og ark Fibrin D-dimer 1,4 Fibrin D-Dimer 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 70% 80% 90% 100% 105% Fyldningsgrad Graferne illustrerer Fibrin D-dimer resultaterne i projektet Fibrin D-Dimer Middelværdi 105% 100% 90% 80% 70% Fyldningsgrad Punkterne illustrerer Fibrin D-dimer Middel resultaterne i projektet. De sorte stiplede linjer markerer den øvre og nedre max Bias grænse, som Westgard data basen angiver. De blå linjer markerer den øvre og nedre max Bias grænse, som KBA NKP Bias max værdi angiver. De røde stiplede linjer markerer den øvre og nedre max Bias grænse, som KBA OKP Bias max værdi angiver.

28 Relativ værdi ift. 100% Sigurd Kolstrup. Side 27 af 46 Fejllinjerne angiver analyseusikkerheden beregnet ud fra KBA OKP CV% max værdi (se bilag 6 for CV% max værdierne og se i metodeafsnittet for analyseusikkerhedsformlen) Bias grænsen beregnes som 100% ± Bias% max (18) Fibrin D-Dimer Tilladte totalfejl % % 100% 90% 80% 70% Fyldningsgrad Punkterne illustrerer de enkelte Fibrin D-dimer resultaters relative afvigelse fra 100% fyldningsgrad i %. De sorte stiplede linjer markerer den øvre og nedre max tilladte totalfejlsgrænse beregnet ud fra de værdier, som Westgard data basen angiver. De blå linjer markerer den øvre og nedre max tilladte totalfejlsgrænse, som KBA NKP Bias% max og CV% max værdier angiver. De røde stiplede linjer markerer den øvre og nedre max tilladte totalfejlsgrænse, som KBA OKP Bias% max og CV% max værdi angiver.

29 Relativ værdi ift. 100 % Fibrin μmol/l Sigurd Kolstrup. Side 28 af 46 Fibrinogen: For beregning af data, se Bilag 2 databehandling, ark Grafer og ark Fibrinogen Fibrinogen % 75% 80% 85% 90% 95% 100% 105% 110% Fyldningsgrad Graferne illustrerer Fibrinogen resultaterne i projektet Fibrinogen Middelværdi 105% 100% 90% 80% 70% Fyldningsgrad Punkterne illustrerer Fibrinogen Middel resultaterne i projektet. De sorte stiplede linjer markerer den øvre og nedre max Bias grænse, som Westgard data basen angiver. De blå linjer markerer den øvre og nedre max Bias grænse, som KBA Bias max værdi angiver. Fejllinjerne angiver analyseusikkerheden beregnet ud fra KBA CV% max værdi (se bilag 6 for CV% max værdierne og se i metodeafsnittet for analyseusikkerhedsformlen) Bias grænsen beregnes som 100% ± Bias% max (18)

30 Relativ værdi ift. 100 % Sigurd Kolstrup. Side 29 af Fibrinogen Tilladte totalfejl % % 100% 90% 80% 70% Fyldningsgrad Punkterne illustrerer de enkelte Fibrinogen resultaters relative afvigelse fra 100% fyldningsgrad i %. De sorte stiplede linjer markerer den øvre og nedre max tilladte totalfejlsgrænse beregnet ud fra de værdier, som Westgard data basen angiver. De blå linjer markerer den øvre og nedre max tilladte totalfejlsgrænse, som KBA NKP Bias% max og CV% max værdier angiver.

31 Relativ værdi ift. 100%( AT k(ui)/l Sigurd Kolstrup. Side 30 af 46 Antithrombin: For beregning af data, se Bilag 2 databehandling, ark Grafer og ark Antithrombin Antithrombin 1,18 1,12 1,06 1 0,94 0,88 0,82 0,76 0,7 70% 75% 80% 85% 90% 95% 100% 105% 110% Fyldningsgrad Graferne illustrerer Antithrombin resultaterne i projektet Antithrombin Middelværdi % 100% 90% 80% 70% Fyldningsgrad Punkterne illustrerer Antithrombin Middel resultaterne i projektet. De sorte stiplede linjer markerer den øvre og nedre max Bias grænse, som Westgard data basen angiver. De blå linjer markerer den øvre og nedre max Bias grænse, som KBA Bias max værdi angiver.

32 Relativ værdi Ift 100% Sigurd Kolstrup. Side 31 af 46 Fejllinjerne angiver analyseusikkerheden beregnet ud fra KBA OKP CV% max værdi(se bilag 6 for CV% max værdierne og se i metodeafsnittet for analyseusikkerhedsformlen) Bias grænsen beregnes som 100% ± Bias% max (18) Antithrombin Tiladte totalfejl % 105% 100% 90% 80% 70% Fyldningsgrad Punkterne illustrerer de enkelte Antithrombin resultaters relative afvigelse fra 100% fyldningsgrad i %. De sorte stiplede linjer markerer den øvre og nedre max tilladte totalfejlsgrænse beregnet ud fra de værdier, som Westgard data basen angiver. De blå linjer markerer den øvre og nedre max tilladte totalfejlsgrænse, som KBA NKP Bias% max og CV% max værdier angiver. De røde stiplede linjer markerer den øvre og nedre max tilladte totalfejlsgrænse som KBA OKP Bias% max og CV% max værdi angiver. Dødvolumen projekt For beregning af data, se Bilag X databehandling, ark Dødvolumen Resultat: 84,77 % 85 % Dødvolumen af sommerfugl beregnet til at være de samme som 85% fyldningsgrad

33 Side 32 af 46 Diskussion: I diskussionen vil peer review artiklerne blive nævnt med et nummer. Hvilken artikel nummeret referer til kan ses i reference listen Diskussion af metode Som det er nævnt i teori afsnittet og i artikel 1(5), er der til prøvetagningen og fordelingen i prøverørene i det hollandske projekt anvendt en sprøjte, i modsætning til den metode der er blevet anvendt i dette projekt, pean metoden. Der hvor dette projekt afviger mest fra det hollandske, er måden prøverørene fyldes på. I det hollandske projekt blev der beregnet hvor meget der skulle fyldes i de enkelte rør, og så blev blodprøven taget med en sommerfuglenål hvor der i den anden ende var en sprøjte monteret. Herefter blev blodet overført til rørene ved hjælp af sprøjten(7). Sprøjte - fremgangsmetoden havde den ulempe, at mens blodet er i sprøjten, begynder blodet at koagulere. Dertil har sprøjten, i forhold til sommerfugleslangen, en stor overflade som kan speede koagulationsprocessen yderligere op. Da der skal sprøjtes et meget bestemt antal ml i de enkelte rør, vil påfyldningen af de enkelte rør sandsynligvis blive en tidskrævende proces. Dette medfører, at når man kommer til det sidste rør, vil det blod der er tilbage i sprøjten sandsynligvis være længere fremme i koagulationsprocessen og sandsynligvis give et afvigende resultat. Et yderligere problem med denne fremgangsmetode er, at blodet enten skal overføres i et åbent system, eller sprøjten skal udstyres med kanyle. Det åbne sysstem giver en fare for uheld der vil medføre en mulig kontaminering med blod, som det er procedure at betragte som smittefarligt. Muligheden med en monteret kanyle på sprøjten giver en fare for stikskader hos prøvetageren. Hvis man har forregnet sig, mens man fylder sprøjten, kan man risikere at skulle fortage en ny venepunktur på patienten eller kassere prøvesættet. Diskussion af Materiale og metoder Oprindeligt var det blevet besluttet at den fyldningsgrad der skulle udgøre den overfyldte fyldningsgrad, skulle være på 110 %. Men under pilotprojektet blev det opdaget at vakuummet i NCR erne ikke var tilstrækkeligt til at kunne opsuge denne mængde, man kunne have piftet røret og have fyldt op til 110% mærket, men denne løsning ville have givet flere problemer end den ville have løst. Det blev derfor besluttet at overfyldningen blev sat til fyldning, indtil vakuummet ikke kunne opsuge mere. Denne metode er også den som anvendes når der i praksis skal en blodprøve med et NCR. Da rørene skulle have en % markering for at kunne passe ind i nummersystemet, blev overfyldningen sat til 105%. Dette tal blev valgt på baggrund af at prøveoverfladen ved nærmere eftersyn så ud til at befinde sig præcist mellem 100 % mærket og 110 % mærket. Man kan spørge sig selv, hvorfor NCR producenten har fremstillet NCR er der har et vakuum, der vil opsuge mere end de 2,7 ml som er angivet på NCR et. Grunden hertil er, efter min mening, at vakuummet i et NCR vil over tid blive svagere og producenten har derfor fremstillet NCR vakuummet stærkere for at forlænge NCR s holdbarhed og minimere faren for underfyldning på

34 Side 33 af 46 grund af et for svagt vakuum. Dette kan medføre, at det er muligt at få et underfyldt NCR, hvis man anvender NCR er over sidste brugsdato, og derfor er det ikke tilrådeligt at anvende forældede NCR. Til projektet blev det besluttet at anvende to grupper forsøgspersoner der tilsammen udgjorde 20 forsøgspersoner. Dette antal er ikke særlig stort, og det vil give en stor usikkerhed for analyserne. Grunden til at der ikke er anvendt flere forsøgspersoner kan siges med et ord: Økonomi. Til et bachelorprojekt er der afsat et buget på 5000 kr., og en beregning af omkostningerne for et projekt der analyserer samtlige fem analyser, viste at der maximalt var råd til tyve prøvesæt. Projektets resultater ville med sikkerhed have været forbundet med en betydeligt mindre usikkerhed, hvis forsøgspersonspopulationen havde været større, men det har der ganske enkelt ikke været råd til. Da det blev besluttet at anvende 100% som den sande værdi, som resultaterne i projektet skulle vurderes ud fra, stod det klart at det var nødvendigt at sikre 100 % fyldningsgraden mod analyseusikkerhed. Hvis resultaterne fra projektet blev vurderet ud fra en usikker 100 % fyldning ville der kunne stilles spørgsmålstegn ved anvendeligheden. For at mindske usikkerheden blev det besluttet at sudtage to 100% fyldningsgradsrør, som hver især ville blive dobbeltbestemt. Grunden til at anvende dobbeltbestemmelse var, at hvis det ene analyseresultat gav et afvigende resultat, højere eller lavere, ville dette kunne ses på det andet analyseresultat. Dette ville afsløre usikkerhed der skyldtes analytisk fejl, men ikke fejl der skyldtes prøvematerialet. Grunden til at der anvendes to gange dobbeltbestemmelse er, at dette vil kunne afsløre usikkerhed der skyldes fejl ved prøvematerialet. Dette vil kunne ses ved, at resultaterne fra den ene dobbeltbestemmelse afviger fra den anden, ved enten at være højere eller lavere. Før det var muligt at begynde indsamling af prøvesæt, var det nødvendigt at undersøge om rækkefølgen af prøverør havde indflydelse på analyseresultaterne. Derfor startede projektet med et pilotprojekt der skulle afgøre denne problemstilling. Det blev besluttet at udføre pilotprojektet ved at anvende tre forsøgspersoner som alle leverede fem helt fyldte prøverør. Ved at afbillede resultaterne i et stregdiagram samt udføre en variansanalyse(f-test) ville det være muligt at afgøre om prøverækkefølgen havde nogen indflydelse på analyseresultaterne. Det blev besluttet kun at anvende analyserne INR og APTT til pilotprojektet, vi kunne have valgt at fortage alle fem analyser, men dette ville have givet en større mængde data, have taget mere tid og have været betydeligt mere bekosteligt. Da der analyseres på samme prøvesæt ville sandsynligheden for at resultaterne på de analyser der blive fravalgt ville have givet et lignende varians mellem prøverørene være stor. Diskussion af Resultatdelen: Som man kan se i de to stregdiagrammer i resultatafsnittets pilotprojektdel, ses der en del afvigelse mellem de enkelte resultater i de tre prøve sæt, dog er der ikke nogen tydelig tendens i de tre grafer. Havde de tre grafer haft en fælles tendens, ville dette have været et stærkt indicium for at der var en varians til stede. Dog er indicier ikke til strækkeligt til at kunne bevise en mulig varians. Resultatet af f-testen i pilotprojektet er under f krit, og der kan derfor ikke påvises statistisk signifikant varians. Dette betyder at prøverækkefølgen ikke har indflydelse på analyseresultaterne.