Elucigene CF-EU2v1 Brugervejledning

Transkript

1 Elucigene CF-EU2v1 Brugervejledning Katalogkode: CF2EUB2 50 test CF2EUBX 10 test Til in vitrodiagnostisk brug Fremstillet af Elucigene Diagnostics. Elucigene Diagnostics Greenheys House Pencroft Way Manchester Science Park Manchester M15 6JJ For salgsafdeling, kundeservice og teknisk support: T: +44 (0) F: +44 (0) E: E: Elucigene Diagnostics is the trading name of Delta Diagnostics (UK) Limited., a company registered in England and Wales, registration number CF2EUBYDA 002 Sep-2014 Side 1 af 24

2 Elucigene CF-EU2v1 Tilsigtet anvendelse Til simultan in vitro kvalitativ detektion af nedenstående humane CFTR-genmutationer (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator) i DNA udtaget fra fuldblod (EDTA-konserveret) og tørrede blodpletter: Traditionel I henhold til HGVS retningslinjerne* cdna name Protein name CFTRdele2,3 c _ del (c _ del21080) E60X c.178g>t p.glu60x P67L c.200c>t p.pro67leu G85E c.254g>a p.gly85glu 394delTT c.262_263del (c.262_263deltt) p.leu88ilefsx22 444delA c.313del (c.313dela) p.ile105serfsx2 R117C c.349c>t p.arg117cys R117H c.350g>a p.arg117his Y122X c.366t>a p.tyr122x 621+1G>T c.489+1g>t 711+1G>T c.579+1g>t L206W c.617t>g p.leu206trp 1078delT c.948del(c.948delt) p.phe316leufsx12 R334W c.1000c>t p.arg334trp R347P c.1040g>c p.arg347pro R347H c.1040g>a p.arg347his A455E c.1364c>a p.ala455glu I507del c.1519_1521del (c.1519_1521delatc) p.ile507del F508del c.1521_1523del (c.1521_1523delctt) p.phe508del 1677delTA c.1545_1546del (c.1545_1546delta) p.tyr515x V520F c.1558g>t p.val 520Phe G>A c g>a G542X c.1624g>t p.gly542x S549R(T>G) c.1647t>g p.ser549arg S549N c.1646g>a p.ser549asn G551D c.1652g>a p.gly551asp R553X c.1657c>t p.arg553x R560T c.1679g>c p.arg560thr kbA>G c a>g G>A c g>a 2143delT c.2012del (c.2012delt) p.leu671x 2184delA c.2052del (c.2052dela) p.lys684asnfsx delG c.2215del (c.2215delg) p.val739tyrfsx16 W846X c.2538g>a p.trp846x G>A c g>a Q890X c.2668c>t p.gln890x G>A c g>a A>G c A>G CF2EUBYDA 002 Sep-2014 Side 2 af 24

3 Traditionel I henhold til HGVS retningslinjerne* cdna name Protein name R1066C c.3196c>t p.arg1066cys Y1092X(C>A) c.3276c>a p.tyr1092x M1101K c.3302t>a p.met1101lys D1152H c.3454g>c p.asp1152his R1158X c.3472c>t p.arg1158x R1162X c.3484c>t p.arg1162x 3659delC c.3528del (c.3528delc) p.lys1177serfsx kbC>T c c>t S1251N c.3752g>a p.ser1251asn 3905insT c.3773dup (c.3773dupt) p.leu1258phefsx7 W1282X c.3846g>a p.trp1282x N1303K c.3909c>g p.asn1303lys * with reference to Mutation Nomenclature in Practice: Findings and Recommendations from the Cystic Fibrosis External Quality Assessment Scheme. Berwouts S, Morris M, Girodon G, Schwarz M, Stuhrmann M and Dequeker E. Human Mutation, Vol.00, No. 0, 1-7 (2011) CF-EU2v1 kan skelne mellem en person, der er heterozygot og homozygot for alle ovenstående mutationer og varianter, med undtagelsen af S549R(T>G) se afsnittet om krydsreaktivitet i dette dokument. Resume og forklaring Cystisk fibrose (CF) er den mest almindelige livsbegrænsende (autosomal recessiv) sygdom, i den hvide race. Sygdommen optræder ved 1 ud af 3200 levende fødsler i den hvide race (1). I den hvide race er den heterozygote hyppighed ca. 1:25. Cystisk fibrose påvirker epitelceller i flere organer, hvilket resulterer i en kompleks multisystemsygdom, der inkluderer exokrin pankreas, tarmene, luftvejene, mandlige genetalia, det hepatobiliære system og exokrine svedkirtler. Sygdommen manifesterer sig forskelligt afhængigt af sværhedsgraden af CFTR-mutationerne (2), genetiske modifikatorer (3) og miljømæssige faktorer (4). Det kan rangere fra tidlig død i barndommen grundet progredierende obstruktiv lungesygdom med bronchiectasia, til pankreasinsufficiens med gradvis progredierende obstruktiv lungesygdom i de unge år og øget hyppighed af hospitalsindlæggelser for lungesygdom i den tidlige voksenalder, til recidiverende sinusitis og bronkitis eller mandlig infertilitet i den tidlige voksenalder. Almindeligvis stilles diagnosen cystisk fibrose hos personer med en eller flere karakteristiske symptomer på CF samt evidens for en fejl i CFTR-funktionen, baseret på en af følgende: Tilstedeværelsen af to sygdomsforårsagende mutationer i CFTR- genet eller to unormale kvantitative pilocarpin iontoforese svedkloridværdier (>60 meq/l) eller transepithelial NPD-målinger (Nasal Potential Difference), der er karakteristiske for CF. Detektionsraten for CFTR-mutationer varierer, alt afhængig af testmetoden og etnisk baggrund. Hos visse symptomatiske personer vil kun én eller ingen sygdomsforårsagende mutation kunne detekteres. Hos nogle bærere kan den sygdomsforårsagende mutation ikke detekteres. CF2EUBYDA 002 Sep-2014 Side 3 af 24

4 CFTR-relaterede lidelser er nedarvet på en autosomal recessiv måde. Søskende af en proband med cystisk fibrose har 25 % chance for at blive afficeret, 50 % chance for at være asymptomatiske bærere, og 25 % chance for at være ikke-afficerede og ikke bærere. Molekylærgenetisk testning for den/de sygdomsforårsagende mutation(er) i CFTR-genet bruges til detektion af en bærer i populations screenings programmer. Det er muligt at teste alle graviditeter med øget risiko for CFTR-relateret sygdom, hvis de sygdomsforårsagende mutationer i familien er kendt. Der er siden opdagelsen af CFTR-genet i 1989 (5) blevet beskrevet mere end 1700 mutationer og varianter i genet (6). Mange af disse mutationer er private, dvs. de kun er beskrevet hos en patient og/eller familie. Rutinetestning for alle de mulige mutationer er hverken mulig eller omkostningseffektiv, og er derfor begrænset til testning for de mest almindelige mutationer. CF-EU2v1 er et cystisk fibrose-testkit, der er udviklet specifikt med henblik på de mest almindeligt forekommende mutationer hos populationer af europæisk afstamning. Analysen identificerer i alt 50 mutationer og analyserer også intron 9 polyt-området med nøjagtig måling af den tilstødende TG-gentagelse. Det polymorfe thymidinområde ved overgangen mellem intron 9 og exon 10 påvirker transkriptionen. Antallet af thymidinrester (5T, 7T eller 9T) påvirker splejsningseffektiviteten af exon 10, hvis 5T-allelet er tilstede, vil en del af exon 10-transkripterne ikke være tilstede, hvilket vil resultere i et ikke-fungerende protein og forskellige CF-symptomer. Det er rapporteret at antallet af TG-gentagelser 5' til polytymidinområdet også kan påvirke splejsning af exon 10 (7). Findes de på det samme allel som 5T-varianten vil et længere antal TG-gentagelser være ensbetydende med at en højere andel af CFTR-transkripterne vil mangle exon 10. Antallet af TG-gentagelser kan påvises med CF-EU2v1 ved at bestemme størrelsen af 5T-amplikonspidser. Funktionsprincip Den metode, der anvendes med Elucigene CF-EU2v1-kittet, anvender fluorescerende ARMS (Amplification Refractory Mutation System) allelspecifik amplifikationsteknologi, som detekterer punktmutationer, indsættelser og deletioner i DNA (8). Princippet bag ARMS er at oligonukleotider med en 3 rest, der ikke passer sammen, ikke vil fungere som PCR-primere (Polymerase Chain Reaction) under specifikke forhold. Valget af passende oligonukleotider tillader forstærkning og detektering af specifikke mutante eller normale DNA-sekvenser. Amplificerede sekvenser (amplikoner) separeres med kapillærelektroforese ved hjælp af en genetisk analysator fra Applied Biosystems (Genetic Analyzer). Analysesoftware gør det muligt at identificere og mærke amplikoner i henhold til deres størrelse og farve. Elucigene CF-EU2v1 er en meget multipleks analyse, der består af to (A og B) PCRreaktioner. Halvtreds mutante sekvenser i CFTR-genet påvises i A-blandingen og visualiseres som blå amplikonspidser. Tilsvarende ikke-muterede normale (vildtype) sekvenser påvises i B-blandingen og visualiseres som grønne amplikonspidser. A- blandingen påviser også en normal sekvens for den hyppigst observerede mutation, der forårsager cystisk fibrose hos hvide populationer, kaldet F508del og visualiseres som en grøn amplikonspids. Desuden påvises gentagne polyt-sekvenser i A-blandingen og visualiseres som sorte amplikonspidser. Interne amplifikationskontrolmarkører (ikkecystisk fibrose) inkluderes i både A- og B-blandingerne for at overvåge effektiviteten af prøveamplifikationen og visualiseres som røde amplikonspidser. CF2EUBYDA 002 Sep-2014 Side 4 af 24

5 Advarsler og forholdsregler 1. DNA-kontrollen, der følger med dette sæt, er af human oprindelse og er blevet testet uafhængigt med en PCR-baseret analyse og fandtes at være negativ for Hepatitis B virus (HBV), Hepatitis C virus (HCV) og Human immundefekt virus 1 (HIV1). 2. Vær forsigtig ved håndtering af materiale af human oprindelse. Alle prøver bør anses som potentielt smittefarlige. Ingen testmetode kan give fuld sikkerhed for, at HBV, HCV, HIV 1 eller andre smitstoffer ikke er til stede. 3. Håndtering af prøver og testkomponenter, deres brug, opbevaring og bortskaffelse skal ske i overensstemmelse med nationale bestemmelser og lovgivning vedrørende biologisk risikomateriale. 4. I overensstemmelse med aktuel god laboratoriepraksis bør laboratorier behandle deres egne interne kvalitetsprøver af kendt genotype i hver analyse, så procedurens validitet kan vurderes. 5. Hvis æsken med kittet er beskadiget, kan indholdet være beskadiget. Anvend ikke kittet, og kontakt kundeservice. CF2EUBYDA 002 Sep-2014 Side 5 af 24

6 Symboler anvendt på etiketter Symbolerne anvendt på alle etiketter og emballage er i overensstemmelse med den harmoniserede standard ISO15223 Producent Antal test Se brugsanvisningen X Opbevares under den angivne temperatur Anvend før den angivne dato Katalogkode Lot- eller batchnummer Medicinsk udstyr til in vitro diagnostik CF2EUBYDA 002 Sep-2014 Side 6 af 24

7 Materialer der følger med Reagenserne skal opbevares i et område uden kontaminerende DNA eller PCR. Alle reagenser leveres klar til brug. Uåbnede og åbnede reagenser skal opbevares ved -20 C. Åbnede reagenser kan opbevares i op til 3 måneder. Der leveres tilstrækkeligt materiale til 50 (10) test: 2 x 120µl (50µl) hætteglas CF-EU2v1 A-primerblanding, indeholdende primere til forstærkning af følgende mutante alleler R347H, R347P, G>A, G>A, 711+1G>T, R334W, I507del, F508del, kbC>T, 1677delTA, 1078delT, V520F, L206W, W1282X, R560T, 2347delG, Q890X, R553X, G551D, S549N, M1101K, G542X, 3905insT, Y1092X(C>A), S1251N, 444delA, kbA>G, G>A, R117H, R117C, N1303K, Y122X, 394delTT, G85E, R1066C, G>A, W846X, 2184delA, D1152H, CFTRdele2,3, P67L, 2143delT, E60X, 3659delC, A>G, 621+1G>T, A455E, R1162X og R1158X. Denne blanding indeholder også vildtype primere til detektion af normale F508del-alleler, primere til detektion af polythymidinvarianter, IVS8-5T, IVS8-7T, IVS8-9T og primere til identifikation af 2 hypervariable short tandem repeat STR-markører (450043). 2 x 120µl (50µl) hætteglas CF-EU2v1 B-primerblanding, der indeholder vildtype primere til forstærkning af de normale alleler i de mutanter, der forstærkes af A- primerblandingen med undtagelse af F508del, det normale allel, som forstærkes af primere inkluderet i A-primerblandingen. Denne blanding indeholder også primere til identifikation af 2 hypervariable STR-markører (450044). 2 x 400µl (75 l) hætteglas PCR-masterblanding, der indeholder HotStart Taq DNApolymerase og deoxynukleotidtrifosfater i buffer (450045). 1 x 50 µl hætteglas DNA-kontrol på 6 ng/µl, normal for mutationer detekteret med Elucigene CF-EU2v1 (404489) Nødvendige materialer, der ikke medfølger Laboratorieutensilier handsker, mikrofuge-prøveglas med skruelåg, 0,2 ml PCRhætteglas eller mikrotiterplader anbefalet af producenten af den anvendte termiske variator, pipettespidser. Forberedelse af DNA QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen GmbH, kat. nr /51306) eller tilsvarende. Kapillærelektroforese GeneScan 600 LIZ størrelsesstandard (ABI kat. nr ), GeneScan 600v2 LIZ størrelsesstandard (ABI kat. nr ), Multi-capillary DS-33 (farvestofsæt G5) matrixstandard (ABI kat. nr ), POP-7 polymer (ABI kat. nr ), 10x genetisk analysator buffer (ABI kat. nr ) og Hi-Di-formamid (ABI kat. nr ). Bemærk: Sørg for, at alle anvendte materialer ikke har overskredet producentens udløbsdato. Påkrævet udstyr Laboratorieudstyr præcisionspipetter (2 sæt: 1 til håndtering før amplifikation og 1 til håndtering efter amplifikation), beskyttelsestøj, vortex-mixer, mikrofuge, centrifuge til mikrotiterplade med 96 brønde. PCR-amplifikation Termisk variator, der rummer mikrotiterplader med 96 brønde eller 0,2 ml hætteglas med en temperaturnøjagtighed på mindst +/-1 C mellem 33 C og 100 C og statisk temperaturensartethed på +/-1 C. CF2EUBYDA 002 Sep-2014 Side 7 af 24

8 Bemærk: Den termiske variator skal vedligeholdes regelmæssigt i overensstemmelse med producentens anvisninger og kalibreres for at sikre nøjagtig PCR-variation og optimal funktion. Elucigene CF-EU2v1-analysen blev udviklet på termiske variatorer fra Applied Biosystems Andre mærker og modeler bør testes fuldt ud og evalueres for optimal funktion af brugeren inden rapportering af resultater med CF-EU2v1. Kapillærelektroforese ABI 3130/3500 genetisk analysator (med GeneMapper fragmentanalysesoftware), 36 cm eller 50 cm (ABI3500) kapillærarray, 96-brønds optiske plader, 96-brønds septas, 96-brønds kassetter. Bemærk: Udstyr til kapillærelektroforese skal vedligeholdes regelmæssigt i overensstemmelse med producentens anvisninger og kalibreres for at sikre optimal funktion. Prøvetagning og opbevaring Det er evalueret, at fuldblodsprøver (EDTA) og tørrede blodpletter er forenelige med denne test. Prøveudtagningsudstyr har til tider vist sig at være skadeligt for integriteten af visse analytter, og kan derfor interferere med nogle metode-teknologier (9). Det anbefales, at hver bruger sikrer, at det valgte udstyr anvendes i overensstemmelse med producentens anvisninger, og at prøvetagningsudstyret er foreneligt med denne test. Blodprøver skal opbevares ved -20 C inden forberedelse af DNA. Undgå gentagen nedfrysning og optøning. Forberedelse af DNA fra fuldblodsprøver (EDTA) Der opnås konsistent resultater med DNA udtaget med QIAamp 96 DNA Blood Kit (eller QIAamp DNA Mini Kit med proteinase K) i henhold til den protokol, der er beskrevet i QIAamp-håndbogen, hvor der startes med 200 µl flydende fuldblod og eluerende i 200 µl vand til molekylærbiologi. Forberedelse af DNA fra tørrede blodpletter Der opnås konsistent resultater med DNA udtaget med QIAamp DNA Mini Kit i henhold til den protokol, der er beskrevet i QIAamp-håndbogen, men startende med 2 x 3 mm skiver fra en tørret blodplet og eluerende i 100 µl vand til molekylærbiologi. Det anbefales, at alternative metoder til udtagning af DNA og prøvetyper nøje evalueres med Elucigene CF-EU2v1-testen inden resultaterne anvendes til diagnostik. Vigtige overvejelser DNA-mængde Under optimale PCR-forhold og ved brug af de anbefalede prøveinjektionsindstillinger (se bemærkning i afsnittet Kapillærelektroforese) givet i kørselsmodulerne for kapillærkolonnen opnås der rutinemæssigt acceptable resultater fra DNA udtaget ved hjælp af ovenstående metoder ved koncentrationer på mellem 1,5 ng/µl og 25 ng/µl. Kvantificeringen af DNA er meget vigtig, og koncentrationen af hver DNA-prøve, der skal testes, bør måles for at sikre optimale resultater. Teknikker, som f.eks. PicoGreen fluorescens eller uuv-absorbans er acceptable. På grund af variation i DNAkvantificeringsteknikker bør brugeren overveje følgende vejledning: Meget store mængder DNA vil øge sandsynligheden for, at baggrundsspidser mærkes af analysesoftwaren. Følgende trin kan tages for at reducere sandsynligheden for, at baggrundsspidser mærkes. Fortynd DNA-prøven og forstærk igen Reducer injektionstiden se afsnittet Kapillærelektroforese Forøg minimumstærkslen for spidsamplitude se Elucigene CF-EU2v1 vejledning til analysesoftware CF2EUBYDA 002 Sep-2014 Side 8 af 24

9 Meget små mængder DNA vil øge sandsynligheden for, at diagnostiske spidser er svage og ikke mærket af analysesoftwaren. Følgende trin kan tages for at forøge signalet. Forøg injektionstiden til 36 sekunder (anbefales stærkt for udtagninger af blodpletter) se afsnittet Kapillærelektroforese Udtag prøven fra blodpletten igen og eluer i reduceret vandvolumen (50 µl) Forøg antallet af blodpletter til udtagning til 4 x 3 mm skiver Vigtige overvejelser DNA-kvalitet CF-EU2v1 er en meget multipleks analyse og kræver effektiv PCR-amplifikation for at fungere optimalt. DNA-kvaliteten kan afgøre PCR-processens effektivitet. Hæmmere, der udtages samtidigt med DNA-prøven, kan resultere i en suboptimal amplifikation, der fører til svage og dårligt afbalancerede spidser. Elucigene Diagnostics har valideret brugen af QIAamp 96 DNA Blood Kit og QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN GmbH) med CF-EU2v1 kittet. Andre DNA-udtagningskits eller metoder bør valideres og optimeres til brug med CF-EU2v1. Bemærk: Se Elucigene CF-EU2v1 fejlfindingsvejledningen for yderligere oplysninger. Testprotokol Kontrol af PCR-kontaminering PCR-processen genererer et stort antal forstærkede produkter (amplikoner) og udgør en høj risiko for kontaminering, hvilket kan medføre falske resultater. Kontaminering kan opstå fra to kilder: Krydskontaminering kontaminering af prøven med ikke-forstærket materiale fra miljøet eller andre prøver, som indeholder målsekvensen. Kontaminering af slutproduktet kontaminering af prøven med amplikoner fra tidligere PCR-processer, der fører til amplifikation af både mål- og kontaminantamplikoner. Laboratorier, der udfører PCR, bør være opmærksom på disse kontamineringskilder og have procedurer på plads, som væsentligt reducerer risikoen for kontaminering. Metoder til at kontrollere kontaminering er veldokumenterede (10) og inkluderer laboratoriernes fysiske design, arbejdsgang, prøvehåndteringsprocedurer og kemiske og enzymatiske tilgange. Veldefinerede og gode laboratorieprocedurer er essentielle for at kontrollere PCR-kontaminering og skal implementeres inden testning af kliniske prøver. Amplifikationsprocedure Bemærk: For at minimere risikoen for kontaminering, skal trin 3-5 udføres i et område, hvor der ikke er noget PCR-produkt tilstede og helst i et laminært flowsystem. 1. Programmér den termiske variator til en éttrinscyklus, som aktiverer HotStart Taq ved 94 C i 20 minutter, forbundet til et amplifikationscyklusprogram på 1 minut ved 94 C (denaturering), 2 minutter ved 58 C (hærdning) og 1 minut ved 72 C (udvidelse) i 30 cyklusser. Dette bør forbindes med en 20-minutters tidsforsinkelsesfil ved 72 C (udvidelse) i den endelige cyklus. 2. Der skal inkluderes en negativ kontrol i hver PCR-kørsel. 3. Tø hætteglassene med Primer Mix og PCR Master Mix og centrifuger kort for at samle indholdet på bunden af hætteglassene. Bland forsigtigt ved at hvirvle og kort centrifugere hætteglassene igen. CF2EUBYDA 002 Sep-2014 Side 9 af 24

10 Forbered tilstrækkelig Reaction Mix til det antal prøver og kontroller, der skal testes (Tabel 1). Bemærk: Brug ikke forskellige blandinger eller komponenter fra forskellige lots af CF-EU2v1-kittet. Enzymaktiveri ng Cyklusprogram Endelig udvidelse 94 C 94 C 20 min. 1 min. 72 C 72 C 58 C 1 min. 20 min. Bemærk: PCR-masterblandingen er viskøs og det skal sikres, at de korrekte voluminer håndteres. Det anbefales, at PCRmasterblandingen tilføjes de tidligere dispenserede primerblandinger for at sikre, at al væske dispenseres fra pipetten og ind i primerblandingen. Omgivelsestemperatur 2 min. 30 cyklusser Tabel 1: Sammensætning af reaktionsblanding Antal prøver, der skal testes Primer-blanding (μl) 4, ,5 225 PCR-masterblanding (μl) 7, ,5 375 I alt (μl) Pipettér 10 μl af hver reaktionsblanding ned i bunden af de korrekt mærkede 0,2 ml PCR-hætteglas eller plader. 5. Tilsæt med nye pipettespidser 2,5 μl test-dna-prøve til hver af hætteglassene og sæt låg på. Der må ikke tilføjes DNA til hætteglasset til negativ kontrol. Tilsæt i stedet 2,5 µl sterilt deioniseret vand. 6. Centrifugér PCR-hætteglassene kort for at samle indholdet på bunden af hætteglassene. 7. Sæt hætteglassene godt fast i PCR-maskinens varmeblok. Start 94 C éttrinscyklussen efterfulgt af amplifikationscyklusprogrammet. 8. Når amplifikationscyklusprogrammet er fuldført, kan prøverne opbevares ved stuetemperatur natten over eller ved 2-8 C i op til 7 dage i mørke inden analyse med kapillærelektroforese. CF2EUBYDA 002 Sep-2014 Side 10 af 24

11 Kapillærelektroforese Det anbefales, at hver bruger sikrer, at det valgte kapillærelektroforeseudstyr anvendes i overensstemmelse med producentens anvisninger, og at udstyret er foreneligt med denne test. I denne sammenhæng er de vigtigste parametre polymeren og det kapillærarray. Der kan opnås optimale resultater ved brug af følgende kapillærelektroforeseforhold: 1. Kombinér 6,8 μl GS600v2 LIZ størrelsesstandard med 250 μl Hi-Di formamid og bland godt (tilstrækkelig blanding til 16 brønde). Pipettér 15 μl blanding i hver brønd på en 96-brønds PRC-plade. 2. Tilsæt 3 µl PCR-produkt fra hver af A- og B-blandingsamplifikationerne til separate brønde indeholdende den allerede pipetterede størrelsesstandard/formamidblanding (fra trin 1) i pladen. 3. Denaturér PCR-produktet, der blev pipetteret i PCR-pladen på en termisk variator ved brug af følgende parametre: 94 C i 3 minutter forbundet med 4 C i 30 sekunder. 4. Centrifugér pladen kort for at samle indholdet på bunden af hætteglassene og for at fjerne eventuelle bobler i brøndene. Sæt den straks i den genetiske analysator. Bemærk: Prøveinjektionsindstillingerne kan ændres, så de passer til den mængde amplikon, der dannes under PCR, hvilket kan variere afhængig af den mængde af genomisk DNA, der blev tilsat. Der kan anvendes mindre amplikon til den kolonne, der skal analyseres, ved enten at reducere injektionens tid eller spænding. Omvendt kan der anvendes mere amplikon til den kolonne, der skal analyseres, ved enten at øge injektionens tid eller spænding. Tidligere forstærkede prøver kan injiceres igen flere gange med henblik på gentagen analyse se Elucigene CF-EU2v1 fejlfindingsvejledning for yderligere oplysninger. CF2EUBYDA 002 Sep-2014 Side 11 af 24

12 ABI 3130-instrumenter: Der skal oprettes et CF-EU2-kørselsmodul og en protokol, som herefter kan bruges til hver CF-EU2-kørsel. Opret CF-EU2-kørselsmodulet i Module Manager (modulstyringen) i 3130 dataindsamlingssoftwaren. Sørg for at følgende er valgt: Type: Regular (Almindelig) Template (Skabelon): FragmentAnalysis36_POP7 Indlæs indstillingerne fra nedenstående tabel: 36 cm kapillærmodul # Parameternavn Værdi Område 1 Oven Temperature (Ovntemperatur) 60 først C 2 Poly_Fill_Vol. (poly-fyldmængde) trin 3 Current Stability (Aktuel stabilitet) 5,0 først ua 4 PreRun_Voltage 15, kv (prækørselsspænding) 5 Pre_Run_Time (prækørselstid) s 6 Injection_Voltage (injektion_spænding) 3, kv 7 Injection_Time (injektionstid) 12,0** s 8 Voltage_Number_Of_Steps nk (spænding antal trin) 9 Voltage_Step_Interval s (spændingstrininterval) 10 Data_Delay_Time (dataforsinkelsestid) s 11 Run_Voltage (kørselsspænding) 15, kv 12 Run_Time (kørselstid) s ** Forøg injektionstiden til 36 sekunder for analyse af DNA udtaget fra blodpletter. Bemærk: Den nødvendige kørselstid vil variere afhængig af den omgivende temperatur på det sted, hvor den genetiske analysator er installeret. Der henvises til brugervejledningen for Applied Biosystems 3130 genetiske analysator for yderligere oplysninger om oprettelse af kørselsmoduler. Opret CF-EU2-protokollen i Protocol Manager (protokolmanager), og sørg for at følgende er valgt: Type: Regular (Almindelig) Run Module (Kørselsmodul): CF-EU2 (se kørselsmodul ovenfor) Dye Set (Farvestofsæt): G5 Opret et prøveark ved hjælp af Plate Manager (pladestyring), for at køre prøverne, og sørg for at den korrekte protokol for CF-EU2v1 er valgt for instrumentprotokollen (se ovenfor). Bemærk: Der henvises til brugervejledningen for Applied Biosystems 3130 genetisk analysator for yderligere oplysninger om opstilling, betjening og fejlfinding af instrumentet. CF2EUBYDA 002 Sep-2014 Side 12 af 24

13 ABI 3500-instrumenter: Der skal oprettes en CF-EU2 Instrument Protocol (Instrumentprotokol), som herefter kan bruges til hver CF-EU2v1-kørsel. Opret CF-EU2 Instrument Protocol (Instrumentprotokol) via 3500 Instrument Protocols Library (instrumentprotokolbiblioteket). Sørg for at følgende er valgt: Run Module (Kørselsmodul): FragmentAnalysis50_POP7 Indlæs de indstillinger, der er angivet i billedet nedenfor: ** ** Forøg injektionstiden til 36 sekunder for analyse af DNA udtaget fra blodpletter Opret en prøveplade for at køre prøverne ved at klikke på Create Plate from Template (opret plade fra skabelon) på Dashboard (instrumentbrættet), og sørg for at den korrekte instrumentprotokol er blevet tildelt CF-EU2v1 (se ovenfor). Opstilling af prøveark for GeneMarker: GeneMarker softwaren muliggør direkte sammenligning af A- og B-data fra samme person. For at muliggøre dette, er det vigtigt at navngivningen af fsa-filen (rå uddatafil) er konsekvent på tværs af alle prøver og blandinger. Prøvearket skal indeholde det unikke prøvenavn for hver prøve, der skal testes, efterfulgt af enten _A eller _B, afhængig af hvilken blanding der testes. Hvis Plate ID (plade-id) skal inkluderes i fsa-navnet, skal det samme format bruges hver gang, f.eks. CFEU2 DDMMÅÅÅÅ. På 3130 bør parametrene Results Destination (resultatdestination) indstilles sådan, at prøvens navn inkluderes i fsa-filens navn, f.eks. CFEU2 DDMMÅÅÅÅ_1234,5_A_A01. CF2EUBYDA 002 Sep-2014 Side 13 af 24

14 På 3500 bør filnavnkonventionen indstilles sådan, at prøvens navn inkluderes i fsa-filens navn, f.eks. CFEU2 DDMMÅÅÅÅ_1234,5_A_A01. Fortolkning af resultater PCR-fragmenterne vil under dataindsamlingen blive observeret som enten blå (mutante) eller grønne (vildtype) spidser på rådataelektroferogrammet. En person har to kopier af CFTR-genet. Hvis disse kopier har samme sekvens på et vilkårligt sted, beskrives en person som homozygot på dette sted. Hvis kopierne er forskellige i sekvens på et vilkårligt sted, beskrives en person som heterozygot på dette sted. Når dataindsamlingen er færdig, bør CF-EU2v1 PCR-fragmenterne størrelsesbestemmes i forhold til GS600v2 LIZ-størrelsesstandarden ved hjælp af fragmentanalysesoftware. CF2EUBYDA 002 Sep-2014 Side 14 af 24

15 Der findes i dokumentet Elucigene CF-EU2v1 vejledning til analysesoftware yderligere detaljerede retningslinjer omkring softwareindstillinger, analyse og fortolkning. Vejledning til analysesoftwareprocedurer for GeneMapper og GeneMarker softwaren kan findes på Elucigene Diagnostics hjemmeside: Resultaterne fra A-blandingen (mutant) bestemmer, hvorvidt en person er bærer af en mutation, og dette vises med en blå spids. Mutantblandingen indeholder også primere til det normale F508del-allel, og derfor kan denne blanding bestemme hvorvidt en person er normal for F508del (kun grøn spids), homozygot for F508del (kun blå spids) eller heterozygot for F508del (blå og grøn spids). Hvis der observeres nogen anden mutation, kan resultaterne fra B- blandingen (vildtype) analyseres for at bestemme homozygot eller heterozygot status. Tilstedeværelsen af en grøn spids for det specifikke allel i vildtypeblandingen indikerer, at personen er heterozygot. Hvis den grønne spids mangler, indikerer det, at personen er homozygot for denne specifikke mutation. Der er inkluderet hypervariable STR-markører (røde) i begge blandinger. Dette muliggør en sammenligning af den forstærkede prøve med mutantblandingen og den forstærkede prøve med vildtypeblandingen for at reducere muligheden for, at der er taget fejl af prøverne. En forskellig STR-profil i hver af de to blandinger indikerer, at det ikke er de rigtige prøver. Mangel på disse STR-markører indikerer en fejlslagen prøve. Tilstedeværelsen af STR-markørerne ved meget lave rfu'er indikerer en svag prøve, som bør analyseres med forsigtighed. Bemærk: Se fejlfindingsvejledningen for yderligere oplysninger. CF2EUBYDA 002 Sep-2014 Side 15 af 24

16 Detekterede markører Nedenstående tabel opsummerer de markører, der detekteres med CF- EU2v1-blandingen. Markørerne er angivet i henhold til størrelsesområdet for det observerede PCR-produkt. Markør (Spids nr. ) Detekterede markører Markør 01 R347H R347P G>A G>A G>T R334W I507del F508del KbC>T delTA delT V520F L206W W1282X R560T delG Q890X R553X G551D S549R(T>G)* S549N M1101K G542X insT Y1092X(C>A) S1251N delA kbA>G G>A R117H R117C N1303K Y122X delTT G85E R1066C G>A W846X delA D1152H CFTRdel2, P67L delT E60X delC A>G G>T Produkt bp størrelsesområde (3130/POP7 data) CF2EUBYDA 002 Sep-2014 Side 16 af 24

17 Markør nr. Markør Produkt bp størrelsesområde (3130/POP7 data) 48 A455E R1162X R1158X T** IVS8-5T T IVS8-7T T IVS8-9T *S549R(T>G) Spids 20 findes kun i A-blandingen. ** 5T-allelstørrelser Produkt bp Markør Størrelses område (3130/POP7 data) 5T (9) T (10) T (11) T (12) T (13) BEMÆRK: Markørstørrelserne kan variere afhængig af det anvendte instrument og polymer. Eksempler på fortolkning I507del Det er grundet placeringen af I507del-deletionen i CFTR-genet muligt at detektere tilstedeværelsen af denne markør gennem et 3 bp skift i størrelsen af F508del-spidsen, samt som en I507del mutant specifik spids. Der hvor der er et enkelt I507del mutant allel tilstede, vil I507del mutantens spids kunne ses som en blå spids ved ca. 159 bp. Der observeres en vildtypespids for F508 som værende tilstede, men på omkring halvdelen af den spidshøjde, der almindeligvis er forbundet med en homozygot vildtype genotype. Dette ses som en grøn spids ved omkring 167 bp. Der vil derudover kunne ses yderligere en grøn spids ved omkring 164 bp. I507del heterozygot prøve CF2EUBYDA 002 Sep-2014 Side 17 af 24

18 En I507del/F508del-prøve vil give en skiftet grøn F508del WT-spids ved ca. 164 bp (3 bp mindre end normalt), en blå F508del M spids ved 166 bp og en blå I507del M spids ved omkring 159 bp. En I507del/I507del-prøve vil give en blå spids ved ca. 159 bp og en enkel grøn spids ved ca. 164 bp (3 bp mindre end den normale F508-spids, der observeres, når I507del ikke er tilstede). F508del Tilstedeværelsen af en F508del-mutation forhindrer I507del WT-primeren i at virke. En person, der er homozygot for F508del, vil derfor ikke have nogen I507del WT-spids i WTblandingen (se nedenfor). En mindre høj I507del WT-spids og 2 spidser med et mellemrum på 3 bp ved position 10 og 12 i WT-blandingen (se nedenfor) vil kunne ses i B-blandingens resultater fra en person, som er heterozygot for F508del. Indsættelser og deletioner På grund af CF-EU2v1-kittets design vil tilstedeværelsen af indsættelser eller deletioner mellem to modsatte primere resultere i størrelsesændringer af al det amplikon, der produceres mellem disse to primere. Ud over de 50 mutationer, der detekteres af CF-EU2v1-kittet, kan alle indsættelser og deletioner i de forstærkede målsekvenser detekteres med ændringen i den forventede amplikonstørrelse i vildtype (B)- blandingen. Disse er blevet opsat i tabelform og kan findes i et separat dokument på Elucigene Diagnostics hjemmeside: Eksempler på indsættelser og deletioner detekteret af kittet og den indvirkning, de har på B-blandingsprofilen vises herunder: F508del/1677delTA Der observeres to spidser med et mellemrum på 1 bp ved position 12 (V520F WT) i B- blandingens resultater fra en person, der er heterozygot for F508del/1677delTAmutationerne. CF2EUBYDA 002 Sep-2014 Side 18 af 24

19 V520F Der observeres en mindre høj vildtype spids ved position 10 (1677delTA WT) i B- blandingens resultater fra en person, der er heterozygot for V520F-mutationen, da dette forhindrer 1677delTA WT-primeren i at virke. Spids 10 og 12 vil forsvinde i resultaterne fra en person, der er homozygot for V520F-mutationen. 394delTT Der observeres to spidser med et mellemrum på 2 bp ved position 35 (G85E WT), 42 (P67L WT) og 44 (E60X WT) i B-blandingens resultater fra en person, der er heterozygot for 394delTT-mutationen. Spids 34 vil forsvinde og spids 35, 42 og 44 vil være den forventede højde, men skiftet 2 bp mindre end den forventede størrelse i resultaterne fra en person, der er homozygot for 394delTT-mutationen. F508del/CFTRdele2,3 Der observeres reducerede spidshøjder ved position 34 (394delTT), 35 (G85E WT), 41 (CFTRdele2,3 WT), 42 (P67L WT) og 44 (E60X WT) i B-blandingens resultater fra en person, der er heterozygot for CFTRdele2,3-mutationen. Spids 34, 35, 41, 42 og 44 vil forsvinde i resultaterne fra en person, der er homozygot for CFTRdele2,3-mutationen. CF2EUBYDA 002 Sep-2014 Side 19 af 24

20 444delA Der observeres to spidser med et mellemrum på 1 bp ved position 30 (R117H WT), 31 (R117C WT), 33 (Y122X WT) og 47 (621+1 WT) i B-blandingens resultater fra en person, der er heterozygot for 444delA-mutationen. Spids 27 vil forsvinde og spids 30, 31, 33 og 47 vil være den forventede højde, men skiftet 1 bp mindre end den forventede størrelse i resultaterne fra en person, der er homozygot for 444delA-mutationen. 2347delG Der observeres to spidser med et mellemrum på 1 bp ved position 39 (2184delA WT) og 43 (2143delT WT) i B-blandingens resultater fra en person, der er heterozygot for 2347delG-mutationen. Spids 16 vil forsvinde og spids 39 og 43 vil være den forventede højde, men skiftet 1 bp mindre end den forventede størrelse i resultaterne fra en person, der er homozygot for 2347delG-mutationen. 3905insT Der observeres to spidser med et mellemrum på 1 bp ved position 26 (S1251N WT) i B- blandingens resultater fra en person, der er heterozygot for 3905insT-mutationen. Spids 24 vil forsvinde, og spids 26 vil være den forventede højde, men skiftet 1 bp større end den forventede størrelse i resultaterne fra en person, der er homozygot for 3905insTmutationen. CF2EUBYDA 002 Sep-2014 Side 20 af 24

21 R1158X Der observeres en reduceret spidshøjde ved position 49 (R1162X WT) i B-blandingens resultater fra en person, der er heterozygot for R1158X-mutationen. Spids 49 vil forsvinde i resultaterne fra en person, der er homozygot for R1158X-mutationen. Polymorfisme rs (delat) i intron 22 Der observeres to spidser med et mellemrum på 2 bp ved position 45 (3659delC WT), 49 (R1162X WT) og 50 (R1158X WT) i B-blandingens resultater fra en person, der er heterozygot for polymorfismen rs (deletion af AT) i intron 22. Spids 45, 49 og 50 vil være den forventede højde, men skiftet 2 bp mindre end den forventede størrelse i resultaterne fra en person, der er homozygot for polymorfismen rs Andre observationer V520F Polymorfisme 1584G>A i exon 12 Det er konstateret, at 1584G>A-polymorfismen interfererer med amplifikation af V520F mutant og vildtype sekvensen. Reduceret spidshøjde ved position 12 (V520F) vil kunne observeres i B-blandingen i en person, som er heterozygot for 1584G>A-polymorfismen. Spids 12 vil forsvinde fra B-blandingen i en person, som er homozygot for 1584G>Apolymorfismen. En person, som er heterozygot for F508del-mutationen og også heterozygot for 1584G>A-mutationen vil kun have en spids 12 i B-blandingen, snarere end de forventede to spidser ved position 12, der normalt ses i en F508del-heterozygot se nedenstående eksempel. Spids 12 vil forsvinde fra A-blandingen i en person, som er heterozygot for V520F-blandingen og 1584G>A-polymorfismen på det samme allel. Et sådant resultat er ikke blevet observeret til dato og er sandsynligvis en sjælden kombination. CF2EUBYDA 002 Sep-2014 Side 21 af 24

22 Krydsreaktivitet Det blev i så vid udstrækning som mulig under udviklingen af testen tilstræbt at undgå interferens med testfunktionen som følge af tilstedeværelsen af andre rapporterede polymorfismer og mutationer i CFTR-genet. Den sjældne mutation R1283M er blevet vurderet for krydsreaktivitet, og den blev ikke detekteret af Elucigene CF-EU2v1-kittet. Følgende polymorfismer blev heller ikke detekteret af testen: 1655T/G (F508C), 1651A/G. Vurderingen af kendte mutationer og polymorfismer i CFTR-genet har understreget følgende virkning på resultaterne med Elucigene CF-EU2v1-kittet: 1. G551D mutant primer i A-blandingen vil også detektere S549RT>G-mutationen. Analysesoftwaren vil give den betegnelsen spids 20. Der vil ikke findes en tilsvarende vildtype spids i B-blandingen delA mutant primeren i A-blandingen vil krydsreagere med 2183AA>G-mutantens DNA-sekvens og resultere i en mutant spids ved position 2184delA delT mutant primeren i A-blandingen vil krydsreagere med F316L-mutantens DNA-sekvens og resultere i en mutant spids ved position 1078delT. 4. R347P mutant primeren i A-blandingen vil krydsreagere med R347H-mutantens DNAsekvens og resultere i en mindre høj mutant spids ved position R347P sammenlignet med en sand R347P-spids. 5. Tilstedeværelsen af F508C (1655T>G) polymorfismen vil resultere i en reduktion af højden af I507del-spidsen i CF-EU2v1 B-blandingen. 6. Tilstedeværelsen af R117H vil resultere i en reduktion af højden af R117C-spidsen i CF-EU2v1 B-blandingen. I en prøve, der er homozygot for R117H, vil R117C-spidsen mangle. 7. Tilstedeværelsen af G85E vil resultere i en reduktion af højden af 394delTT-spidsen i CF-EU2v1 B-blandingen. I en prøve, der er homozygot for G85E, vil 394delTT-spidsen mangle. 8. Der kan sommetider observeres en meget lille artefaktspids i position I507del i resultaterne fra en F508del heterozygot og især en F508del homozygot prøve. 9. Nedenstående mutationer, som ikke er blevet kontrolleret for eventuel krydsreaktivitet, grundet den manglende tilgængelighed af relevante prøver, kan interferere med testfunktionen: R117P, R117L, A>G, 621+2T>C, 621+2T>G, R553G, R553Q, R347L, I506T, I506S, I506V og den sjældne kombination af I507del med polymorfismen 1651A/G. Funktionskarakteristika Der blev blindtestet ethundredogti DNA-prøver udtaget fra flydende fuldblod (EDTA) ved brug af Elucigene CF-EU2v1. Fem prøver slog fejl efter PCR som følge af lav DNAkoncentration (mindre end 1,5 ng/μl). Blandt de resultater, der kunne tolkes, var 96 normale, 5 var heterozygote for F508del, 1 var heterozygot for G>A, 1 var heterozygot for G551D, 1 var heterozygot for 621+1G>T, 1 var heterozygot for G542X og 1 var en sammensat heterozygot for G542X/F508del. Der blev blindtestet enoghalvfems DNA-prøver udtaget fra tørrede blodpletter ved brug af Elucigene CF-EU2v1. Fem prøver blev ikke forstærket. Af de prøver, som blev forstærket, opfyldte 20 ikke analysekriterierne for fortolkning efter en injektion på 12 sekunder på en 3500 genetisk analysator. Alle mislykkede prøver korrelerede med lav DNA-koncentration (mindre end 1,5 ng/μl). De 20 mislykkede prøver blev injiceret igen i 36 sekunder på 3500 genetisk analysator og analyseret. 7 prøver opfyldte ikke analysekriterierne for fortolkning. Af de 79 prøver, som gav resultater, der kunne tolkes, var 38 normale, 5 var heterozygote for F508del, 3 var heterozygote for G551D, 3 var heterozygote for W1282X, 2 var heterozygote for D1152H og 2 var heterozygote for G542X. Fire sammensatte heterozygoter, G>A/F508del, R117H/F508del, R1162X/F508del og R553X/F508del, blev også bestemt. Desuden blev følgende CF2EUBYDA 002 Sep-2014 Side 22 af 24

23 heterozygote prøver hver observeret en enkel gang: E60X, G85E, 394delTT, Y122X, 621+1G>T, 1078delT, R334W, R347P, A455E, I507del, G>A, R553X, kbA>G, G>A, 2184delA, W846X, A>G, Y1092X, 3659delC, kbC>T, S1251N og N1303K. Seksogfyrre DNA-prøver, der repræsenterede alle 50 mutationer detekteret af CF-EU2v1- kittet, blev forstærket fem forskellige gange. Alle prøverne gav de forventede resultater uden nogen falsk negative eller falsk positive resultater, hvilket var ensbetydende med 100 % klinisk specificitet og sensitivitet. Fejlfinding Denne brugsanvisning leveres for at sikre optimal analysefunktion. Brugere må ikke afvige fra de oplyste procedurer. Enhver afvigelse kan resultere i suboptimal funktion med data af dårlig kvalitet som resultat. En fejlfindingsvejledning fås på anmodning fra Elucigene Diagnostics, og den giver eksempler på og løsninger af nogle af de mest almindelige observationer med Elucigene CF-EU2v1, f.eks.: Ingen diagnostiske eller STR-spidser Svage diagnostiske eller STR-spidser For stort gennembrud/baggrundsspidser Umærkede spidser Svage FAM (mutante) spidser Ubalanceret A-blandingsprofil Ubalanceret B-blandingsprofil Delte spidser i B-blandingsprofil Kontakt venligst vores tekniske supportgruppe for at rekvirere en kopi af Elucigene CF-EU2v1 fejlfindingsvejledningen: T: +44 (0) F: +44 (0) E: enquiries@elucigene.com E: techsupport@elucigene.com Procedurens begrænsninger 1. De opnåede resultater fra dette eller enhver anden diagnostisk test bør kun anvendes og fortolkes i henhold til det samlede kliniske billede.elucigene Diagnostics er ikke ansvarlig for de kliniske beslutninger, der træffes. 2. Den manglende tilstedeværelse af mutationer, som dette kit detekterer, er ikke en garanti for at der ikke findes andre mutationer i CFTR-genet. Der kan findes andre mutationer, som ikke detekteres af dette kit. 3. Mutationer varierer i hyppighed i forskellige populationer. Data om hyppigheden af mutationer i forskellige populationer kan rekvireres hos The Cystic Fibrosis Genetic Analysis Consortium (6). Brugeren af dette kit skal lægge vægt på disse punkter, når resultaterne rapporteres til den diagnosticerende kliniker/den genetiske rådgiver. Ansvarsfraskrivelse Resultater fra dette og andre diagnostiske analyser skal fortolkes sammen med de laboratorie- og kliniske data, der er tilgængelige for klinikeren. Disse Elucigene reagenser leveres til in vitro diagnostik. Der findes yderligere oplysninger om datafortolkning i Elucigene CF-EU2v1 - vejledning til analysesoftwareprocedurer: CF2EUBYDA 002 Sep-2014 Side 23 af 24

24 Referencer 1. Rosenstein BJ, Cutting GR. The diagnosis of cystic fibrosis: a consensus statement. Cystic Fibrosis Foundation Consensus Panel. J Pediatr. 1998;132: De Braekeleer M, Allard C, Leblanc JP, Simard F, Aubin G. Genotype-phenotype correlation in cystic fibrosis patients compound heterozygous for the A455E mutation. Hum Genet. 1997;101: Drumm ML, Konstan MW, Schluchter MD, Handler A, Pace R, Zou F, Zariwala M, Fargo D, Xu A, Dunn JM, Darrah RJ, Dorfman R, Sandford AJ, Corey M, Zielenski J, Durie P, Goddard K, Yankaskas JR, Wright FA, Knowles MR. Genetic modifiers of lung disease in cystic fibrosis. N Engl J Med. 2005;353: Goss CH, Newsom SA, Schildcrout JS, Sheppard L, Kaufman JD. Effect of ambient air pollution on pulmonary exacerbations and lung function in cystic fibrosis. Am J Respir Crit Care Med. 2004;169: Kerem B, Rommens JM, Buchanan JA, Markiewicz D, Cox TK, Chakravarti A, Buchwald M, and Tsui LC. Identification of the Cystic Fibrosis Gene: Genetic Analysis. Science 1989; 245 (4922): Cystic Fibrosis Mutation Database, 7. Joshua D. Groman et al. Variation in a Repeat Sequence Determines Whether a Common Variant of the Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Gene Is Pathogenic or Benign. Am J Hum Genet. 2004; 74(1): Newton CR et al. Analysis of any point mutation in DNA. The Amplification Refractory Mutation System (ARMS). Nucleic Acid Res 17: (1989). 9. Satsangi J et al. Effect of heparin on polymerase chain reaction. Lancet 343: (1994). 10. PCR Primer: A Laboratory Manual, 2 nd edition. ColdSpring Harbour Laboratory Press: Section 1 ELUCIGENE is a trademark of Delta Diagnostics (UK) Ltd. ARMS er et varemærke tilhørende AstraZeneca UK Ltd. QIAAMP er et varemærke tilhørende Qiagen GmbH. PICOGREEN er et varemærke tilhørende Molecular Probes Inc. GENEMARKER er et varemærke tilhørende SoftGenetics Corporation. GENEMAPPER, NED, VIC, PET, POP-7, LIZ og HI-DI er varemærker tilhørende Life Technologies Corporation. MEDDELELSE TIL KØBEREN: BEGRÆNSET LICENS Polynukleotider mærket med farvestoffet VIC, NED og PET og/eller deres brug, kan være beskyttet af et eller flere patenter tilhørende Life Technologies Corp. Købsprisen af dette produkt inkluderer begrænsede, ikke-overdragelige rettigheder under visse krav i visse patenter tilhørende Life Technologies Corp. om kun at bruge denne mængde produkt og kun til køberens aktiviteter til detektion af mål inden for human diagnostik. Der gives ingen andre rettigheder. Yderligere oplysninger om købslicens med hensyn til de ovenfor anførte farvestoffer, kan rekvireres hos Director of Licensing, outlicensing@lifetech.com. Copyright 2014 Delta Diagnostics (UK) Ltd. CF2EUBYDA 002 Sep-2014 Side 24 af 24