I ER/PR pharmdx Kit (Link), kode SK310, er reagensernes volumen specielt tilpasset til anvendelse med Dako Automated Link Platforms.

Transkript

1 Dako ER/PR pharmdx Kit (Lik) Kode SK aalyser til brug med Automated Lik Platforms Tilsigtet avedelse Til i vitro diagostisk brug. Dako ER/PR pharmdx Kit er e semikvatitativ immuohistokemisk (IHC) aalyse til at idetificere estrogereceptor- (ER) og progesteroreceptor- (PR) udtrykig i ormalt og eoplastisk væv, som er formalifikseret og paraffiidstøbt til histologisk evaluerig. Dako ER/PR pharmdx detekterer specifikt ER-alfa-proteiet så vel som PR-proteiet, som fides i kerere i celler, der udtrykker hhv. ER og PR. ER/PR pharmdx er idiceret som hjælp ved idetifikatio af patieter, der ka tilbydes behadlig med atihormoer eller aromatasehæmmere, samt som hjælp ved progoser og behadlig af brystkræft. I ER/PR pharmdx Kit (Lik), kode SK310, er reageseres volume specielt tilpasset til avedelse med Dako Automated Lik Platforms. Resumé og forklarig Tidligere forsøg has vist at ER/PR-status blev korreleret til ubehadlede resultater (dvs. progostisk for højtdifferetieret ivasiv brystkræft) og især korreleret til respos på atihormobehadlig, f.eks. tamoxife. Ma fadt, at estrogeer hovedsageligt er kocetreret i estrogemålorgaer hos dyr og i brystkræft hos meesker, og det er godt dokumeteret, at estroges mitogeetiske effekter medieres af ER. 1 Udersøgelser af de biologiske mekaismer i brystkræftes vækst har vist at vækstrate afhæger af tilstedeværelse af estroge eller progestero eller begge i de fleste typer brystkræft. Derfor ases estroge- og progesteroreceptorstatus i brysttumorer som gyldige progostiske og prædiktive faktorer for behadlig af patieter med atihormoel terapi. 1-5 Dako ER/PR pharmdx-aalyse er udviklet til at give et stadardiseret aalysesystem, som aveder et kliisk valideret poitsystem til bestemmelse af ER/PR-status avedeligt i behadlig af patieter med brystkræft. 5-9 Procedures pricipper ER/PR pharmdx-sættet ideholder de reageser, der er ødvedige for at udføre e totris IHC-farvigsprocedure af formalifikserede, paraffiidstøbte præparater. Efter ikubatio med det primære mookloale atistof mod humae ER- eller PR-proteier eller det egative kotrolreages, aveder de validerede protokol et klar-til-brug visualiserigsreages baseret på dextratekologi. Dette reages består af både sekudære gede-ati-mus immuglobulimolekyler og peberrodsperoxidasemolekyler, der er budet til e fælles dextrapolymerbase, hvorfor der ikke er behov for sekvetiel påførig af lik-atistof og peroxidase-kojugeret atistof. De ezymatiske koverterig af det efterfølgede tilføjede kromoge resulterer i daelse af et syligt reaktiosprodukt ved atigestedet. Prøve ka derefter blive kotrastfarvet og forsyet med dækglas. Resultatere fortolkes ved hjælp af et lysmikroskop. Kotrolglas, der ideholder formalifikserede, paraffiidstøbte humae cellelijer medfølger med heblik på kvalitetskotrol af sættets reageseffektivitet. ER/PR pharmdx Kit (Lik), kode SK310, avedes til automatiseret farvig ved at bruge Dako Automated Lik Platforms. Medfølgede materialer ER/PR pharmdx Kit (Lik) (kode SK310) De aførte materialer rækker til 50 aalyser (50 objektglas ikuberet med primært atistof mod ER-protei, 50 objektglas ikuberet med primært atistof mod PR-protei, og 50 objektglas ikuberet med de tilsvarede egative kotrolreages) og 20 ER/PR pharmdx-objektglas til kotrol. Atallet af aalyser er baseret på avedelse af 200 µl reages pr. objektglas udtage Epitope Retrieval Solutio ad Wash Buffer. Sættet ideholder materialer til maksimalt 10 idividuelle farviger. Mægde Beskrivelse 1 x 1 l ER/PR pharmdx Epitope Retrieval Solutio (10x) Citratbuffer med et atimikrobielt stof. 1 x 35 ml ER/PR pharmdx Peroxidase-Blockig Reaget Opløsig med 0,5% hydrogeperoxid, vaskemiddel, ezymhæmmer og præserverigsmiddel, ph2 ( ) P04072DK_01/SK310/ s. 1/11

2 Mægde Beskrivelse 1 x 12 ml ER/PR pharmdx ER Atibody Cocktail Mookloalt mus-ati-humae atistoffer mod huma ER, klo 1D5 og klo ER (IgG 1 og IgG 2a) i vævskultur-superatat i e Tris-HCl-buffer med stabiliserede protei og 0,015 mol/l atriumazid. 1 x 12 ml ER/PR pharmdx PR Atibody Mookloalt mus-ati-huma atistof mod PR, klo PgR 1294 (IgG 1) i vævskultursuperatat i e Tris-HCl-buffer med stabiliserede protei og 0,015 mol/l atriumazid. 1 x 12 ml ER/PR pharmdx Negative Cotrol Reaget Mookloalt mus IgG 1 og mus IgG 2a atistoffer i vævskultur-superatat i e Tris-HClbuffer med stabiliserede protei og 0,015 mol/l atriumazid. 1 x 35 ml ER/PR pharmdx Visualizatio Reaget Dextrapolymer kojugeret med peberrodsperoxidase og affiitetsisoleret gedeatimus-immuglobulier. Leveres i Tris/HCl-buffer med stabiliserede protei og et atimikrobielt stof. 2 x 50 ml ER/PR pharmdx DAB+ Substrate Buffer Substratbufferopløsig, ph 7,5 med <0,1% hydrogeperoxid, stabilisatorer, forstærkere og et atimikrobielt stof. 1 x 2 ml ER/PR pharmdx DAB+ Chromoge 5% 3,3'-diamiobeziditetrahydrochlorid kromogeopløsig. 10 x flasker User-Fillable Reaget Bottle, 12 ml capacity 2 x 1 ml Wash Buffer (10x) Flaskere skal bruges til opbladig og ideholder DAB+-substratkromogeopløsig (se også afsittet reagesklargørig) Tris-HCl buffer med et vaskemiddel og et atimikrobielt stof. ( ) P04072DK_01/SK310/ s. 2/11

3 Mægde Beskrivelse 4 x 5 objektglas ER/PR pharmdx Cotrol Slides Hvert objektglas ideholder sit af to pelleterede, formalifikserede, paraffiidstøbte cellelijer, som repræseterer et moderat iveau med ER- eller PR-proteiudtrykig (afhægig af primært atistof påført objektglasset) og e egative cellelije. Cellelije A: CAMA-1, positiv for ER- og PR-protei. Cellelije B: HT-29, egativ for ER- og PR-protei. BEMÆRK: Alle reageser er formuleret specielt til brug med dee test. Hvis aalyse skal fugere som agivet, må disse ikke udskiftes med adre. Nødvedige materialer, der ikke medfølger Kotrastfarve: Hematoxyli, alkohol eller vadbaseret, såsom Hematoxyli for Automated Lik Platforms (kode SK308) Dækglas Destilleret eller deioiseret vad (vad af reageskvalitet) Tørreov, der ka holde e temperatur på C Ethaol, absolut og 95% Lysmikroskop (4x 40x objektivforstørrelse) Moterigsmedium, såsom Dako Faramout (kode S3025) eller Dako Glycergel (kode C0563) Positive og egative vævsprøver til brug som proceskotroller (se afsittet Kvalitetskotrol) Korrekt kalibreret trykkoger, der ka holde e temperatur på 125 C eller 121 C Objektglas, SuperFrost Plus, ladede objektglas eller Dako Silaized Slides (kode S3003) (se afsittet Klargørig af præparater) Farvigsglas eller -bade Stopur Xyle, tolue, eller xyle-erstatiger ER/PR pharmdx Kit (Lik), kode SK310, er formuleret til brug med Dako Automated Lik Platforms. Der hevises til de passede brugervejledig Dako Automated Lik Platformagåede yderligere oplysiger. Sikkerhedsforastaltiger 1. Til professioelle brugere. 2. Produktet ideholder atriumazid (NaN 3), et kemikalie, der er yderst giftigt i re form. Selvom produktets kocetratio ikke er klassificeret som farligt, ka NaN 3 reagere med bly- og kobberrør og dae meget eksplosive ophobiger af metalazider. Efter bortskaffelse skylles med rigelige mægder vad for at hidre ophobig af azider i afløb. 3. Som ved alle produkter, der er udledt af biologisk materiale, gælder det, at præparater og reageser skal hådteres på e korrekt måde Adre ikubatiostider, -temperaturer eller -metoder ed de agive ka give fejlagtige resultater. 5. Reagesere er optimalt fortydede. Yderligere fortydig ka medføre tab af atigefarvig. 6. Udlad at udskifte primære atistoffer eller egative kotrolreageser med primære atistoffer og egative kotrolreageser fra adre produktiospartier (partiummeret fremgår af flaskeres etiket) eller med reageser fra adre produceter. 7. Som hovedregel må persoer uder 18 år ikke arbejde med dette produkt. Brugere skal være grudigt istrueret i arbejdets procedurer, farlige egeskaber ved produktet og de ødvedige sikkerhedsforastaltiger. Læs sikkerhedsdatabladet for at få yderligere iformatio. 8. Brug eget persoligt beskyttelsesudstyr for at udgå kotakt med øje og hud Ubrugt opløsig skal bortskaffes i hehold til lokal og atioal lovgivig. 10. Sikkerhedsdatablade til professioelle brugere ka rekvireres. Fare ER/PR pharmdx Peroxidase-Blockig Reaget: < 0.1% 3(2H)-Isothiazoloe, 5-chloro-2-methyl-, mixt. with 2-methyl-3(2H)- isothiazoloe H314 Forårsager svære forbrædiger af hude og øjeskader. H317 Ka forårsage allergisk hudreaktio. P280 Brug egede beskyttelseshadsker. Bær beskyttelse til øje og asigt. Brug særligt arbejdstøj. P261 Udgå idådig af damp. P264 Vask hæder grudigt efter brug. P272 Tilsmudset arbejdstøj bør ikke fjeres fra arbejdspladse. ( ) P04072DK_01/SK310/ s. 3/11

4 P304 + P340 + P310 P301 + P310 + P330 + P331 P303 + P361 + P353 + P363 + P310 P302 + P352 P333 + P313 P305 + P351 + P338 + P310 P405 P501 VED INDÅNDING: Flyt persoe til et sted med frisk luft og sørg for, at vedkommede hviler i e stillig, som letter vejrtrækige. Rig omgåede til e GIFTINFORMATION eller e læge. I TILFÆLDE AF INDTAGELSE: Rig omgåede til e GIFTINFORMATION eller e læge. Skyl mude. Fremkald IKKE opkastig. VED KONTAKT MED HUDEN (eller håret): Alt tilsmudset tøj tages straks af. Skyl/brus hude med vad. Tilsmudset tøj skal vaskes, før det ka avedes ige. Rig omgåede til e GIFTINFORMATION eller e læge. VED KONTAKT MED HUDEN: Vask med rigeligt vad/ Ved hudirritatio eller udslet: Søg lægehjælp. VED KONTAKT MED ØJNENE: Skyl forsigtigt med vad i flere miutter. Fjer evetuelle kotaktliser, hvis dette ka gøres let. Fortsæt skylig. Rig omgåede til e GIFTINFORMATION eller e læge. Opbevares uder lås. Idholdet og beholdere bortskaffes i hehold til alle lokale, regioale, atioale og iteratioale regler. Fare DAB+ Chromoge: 1-5% bipheyl-3,3',4,4'-tetrayltetraammoium tetrachloride H350 Ka fremkalde kræft. H341 Mistækt for at forårsage geetiske defekter. P201 Idhet særlige avisiger før brug. P202 Aved ikke produktet, før alle advarsler er læst og forstået. P281 Aved de påkrævede persolige væremidler. P308 + P313 VED ekspoerig eller mistake om ekspoerig: Søg lægehjælp. P405 Opbevares uder lås. P501 Idholdet og beholdere bortskaffes i hehold til alle lokale, regioale, atioale og iteratioale regler. Advarsel Wash Buffer (10X): 5-10% Natriumchlorid, 5-10% 2-Amio-2-(hydroxymethyl)propae-1,3-diol hydrochloride H319 Forårsager alvorlig øjeirritatio. P280 Bær øje- eller asigtsbeskyttelse. P264 Vask hæder grudigt efter brug. P305 + P351 + P338 VED KONTAKT MED ØJNENE: Skyl forsigtigt med vad i flere miutter. Fjer evetuelle kotaktliser, hvis dette ka gøres let. Fortsæt skylig. P337 + P313 Ved vedvarede øjeirritatio: Søg lægehjælp. Opbevarig Opbevar ER/PR pharmdx sættet på 2 8 C. Kotrolobjektglas skal ligeledes opbevares ved 2 8 C. Sættet må ikke avedes efter udløbsdatoe påtrykt udvedig på æske. Der er ige sylige teg på, at produktet er ustabilt. Derfor skal der udføres positive og egative kotroller samtidig med patietpræparater. Hvis reagesere opbevares uder adre betigelser ed de, der er agivet på idlægssedle, skal brugere verificere disse betigelser. 11 Klargørig af præparatet Vævspræparater skal behadles korrekt, så vævet bevares til IHC-farvig. Der skal avedes stadardmetoder til vævsbehadlig af alle præparater. 12 Paraffiidstøbte sit Formalifikserede og paraffiidstøbte vævsprøver ka bruges. Vævspræparater skal skæres i blokke med e tykkelse på 3 eller 4 mm og fikseres i timer. Vævee skal derefter dehydreres og reses i e række alkoholer og xyle, efterfulgt af imprægerig med smeltet paraffi. Paraffitemperature må ikke overstige 60 C. Korrekt fikserede og idstøbte vævsblokke, der udtrykker ER eller PR, vil holde sig uedeligt ide udskærig og moterig på objektglas, hvis de opbevares køligt (15 25 C) 12,13 Vævsparaffiblokke skal skæres i e tykkelse på 3 5 µm. Vævssittee skal moteres på SuperFrost Plus, Dako Silaized Slides (kode S3003), eller ladede objektglas og abriges i tørrestativer. Objektglasstativere skal bakes godt imod et absorberede klæde for at fjere vad, der er faget uder paraffie og på glassee, hvorefter de tørres ved stuetemperatur i e time. Stativet med objektglas abriges derefter i e ikubator ved C i e time. Når glassee tage s ud af ikubatore, skal de opbevares ved stuetemperatur, idtil de er afkølet, og paraffie er hærdet. For at bevare atigeicitete, skal vævssit, som er moteret på objektglas, farves ide 2 måeder efter udskærige, hvis de opbevares ved stuetemperatur (20 25 C). Se Dako Educatio Guide: Immuohistochemical Staiig Methods 14 eller referece 15 og 16 vedrørede yderligere oplysiger om klargørig af prøver. Avedelse af dee aalyse på afkalkede væv er ikke godkedt og frarådes. Objektglas, der er påkrævet til ER/PR-evaluerig og verificerig af tilstedeværelse af tumorer, skal klargøres samtidigt. Der kræves midst 4 objektglas. Ét objektglas til verificerig af tilstedeværelse at tumorer, ét objektglas til evaluerig af ER-protei, ét objektglas til evaluerig af PR-protei, og ét objektglas til egativ kotrolreages. Klargørig af reages Følgede reageser skal klargøres forud for farvig: ( ) P04072DK_01/SK310/ s. 4/11

5 Epitope Retrieval Solutio Klargør e tilstrækkelig mægde Epitope Retrieval Solutio ved at fortyde Epitope Retrieval Solutio (10x) 1:10 med destilleret eller deioiseret vad (vad af reageskvalitet) til de plalagte farvigsprocedure. Ubrugte, fortydede opløsiger ka avedes i e uge opbevaret ved stuetemperatur eller i e måed opbevaret ved 2 8 C. Bortskaf Epitope Retrieval Solutio efter brug. Wash Buffer Klargør e tilstrækkelig mægde vaskebuffer ved at fortyde Wash Buffer (10x) 1:10 med destilleret eller deioiseret vad (vad af reageskvalitet) til vasketriee Ubrugt, fortydet buffer ka avedes i e uge opbevaret ved stuetemperatur og i e måed opbevaret ved 2 8 C. Bortskaf buffere, hvis de er uklar. DAB+ Substrate-Chromoge Solutio DAB+-substrat-kromogeopløsige klargøres i flasker, der fyldes af brugere, ved at tilsætte 1 dråbe kromoge til 1 ml DAB+-substratbuffer, som blades. De klargjorte DAB+-substrat-kromogeopløsig er stabil i ca. 5 dage opbevaret ved 2 8 C. Dee opløsig skal blades grudigt ide brug. E evetuel udfældig i opløsige påvirker ikke farvigskvalitete. BEMÆRK: Farve på DAB+-kromogeet i flaske ka variere fra klar til lys lavedelbru. Dette påvirker ikke produktets effektivitet. Fortyd i hehold til oveståede retigslijer. Hvis der tilsættes for meget DAB+-kromoge til DAB+-substratbuffere, vil det medføre e forrigelse af det positive sigal. De bruger-fyldte flaske med bladet DAB+-substrat-kromogeopløsig skal defieres i Dako Automated Lik Platform før brug. Der hevises til de passede brugervejledig Dako Automated Lik Platformagåede yderligere oplysiger. Farvigsprocedure Bemærkiger til procedure Brugere skal læse dee vejledig grudigt og gøre sig fortrolig med alle kompoeter og istrumeterig ide brug (se Forholdsregler). Alle reageser skal tilpasses stuetemperatur (20 25 C) ide immufarvige. Desude skal alle ikub eriger foregå ved stuetemperatur. Vævssittee må ikke tørre ud uder farvigsprocedure. Udtørrede vævssit ka vise e øget uspecifik farvig. Alle de ødvedige tri og ikubatiostider for farvig er forprogrammeret i software til Dako Lik. Se brugervejledige til Dako Automated Lik Platform for yderligere detaljerede oplysiger om programmerigsprotokol og idførig af objektglas og reageser. Afparaffierig og rehydrerig Forud for farvig skal objektglassee med væv afparaffieres for at fjere idstøbigsmediet, og derefter skal de rehydreres. Udgå ufuldstædig fjerelse af paraffi. Resterede idstøbigsmedium vil medføre øget uspecifik farvig. Dee procedure skal udføres ved stuetemperatur (20 25 C). TRIN 1. TRIN 2. TRIN 3. TRIN 4. Abrig objektglassee i et xylebad, og ikubér i 5 (±1) miutter. Udskift badet, og getag é gag. Bak overskydede væske af, og abrig objektglassee i absolut ethaol i 3 (±1) miutter. Udskift badet, og getag é gag. Bak overskydede væske af, og abrig objektglassee i 95% ethaol i 3 (±1) miutter. Udskift badet, og getag é gag. Bak overskydede væske af, og abrig objektglassee i vad af reageskvalitet i midst 30 sekuder. Begyd farvigsprocedure med Epitope Retrieval. Xyle- og alkoholopløsiger skal udskiftes e gag om uge eller efter maks. 200 objektglas. Tolue- eller xyle-erstatiger, så som Histoclear ka avedes i stedet for xyle. Epitop-gefidig Trykkoger (foretrukket metode: 5 miutter ved 125 C, afkølig til 90 C; alterativ metode: 10 miutter ved 121 C, afkølig til 85 C) Det er meget vigtigt at bevare kosistese i epitop-gefidigsprotokolle for at sikre reproducerbarhed af farvigsresultater. Trykkogere, der bruges, skal kalibreres korrekt og skal kue opå og holde 125 C (eller 121 C), og hver trykkogig skal omfatte de samme totale væskevolume (Epitope Retrieval Solutio og vad i trykkogere) såvel som det samme totale atal objektglas. De optimale protokol er følgede: TRIN 1. For hver kørsel tilsæt de samme mægde reageskvalitetsvad til trykkogere (500 ml eller følg producetes avisiger). TRIN 2. Fyld hver af de to varmebestadige plastikfarvebeholdere, som ka rumme et 24-stk. objektglasstativ med 250 ml klargjort Epitope Retrieval Solutio (se Klargørig af reageser). TRIN 3. Nedsæk de afparaffierede sit, der har stuetemperatur, i Epitope Retrieval Solutio i farvigsbeholdere. BEMÆRK: Af hesy til kosistese, skal der abriges 48 objektglas i trykkogere uder hver trykkogig, hvor der avedes tomme objektglas, hvis der er færre ed 48 objektglas med prøvepræparater til behadlig. Hvis der er 24 eller færre objektglas til behadlig, ka de æste farvebeholder fyldes med 250 ml vad for at spare på Epitope Retrieval Solutio. TRIN 4. Abrig de to farvigsbeholdere i trykkogere, og skru låget godt fast. TRIN 5. Foretrukket metode: Idstil trykkogere til opvarmig til 125 C, og ikuber objektglassee ved 125 C i 5 mitter. Lad trykkogere afkøle til 90 C (ca. 30 miutter) ude at udlige trykket, før de åbes. Alterativ metode: Idstil trykkogere til opvarmig til 121 C, og ikuber objektglassee ved 121 C i 10 mitter. Lad trykkogere afkøle til 85 C (ca. 30 miutter) ude at udlige trykket, før de åbes. TRIN 6. Sørg for, at trykket er udliget, før trykkogere åbes. Fjer farvigsbeholdere, dekatér Epitope Retrieval Solutio, og skyl sittee i Wash Buffer eller reageskvalitetsvad. TRIN 7. Sittee abriges i Wash Buffer i 5 (±1) miutter efter epitop-gefidig og ide farvig. BEMÆRK: Epitope Retrieval Solutio er ku bereget til egagsbrug. Må ikke gebruges. ( ) P04072DK_01/SK310/ s. 5/11

6 Automatiseret Lik-platformprotokol Efter epitop-gefidig, skal objektglassee abriges på istrumetets stativer og idføres på Dako Automated Lik Platform. Istrumetet vil udføre farvigsprocedure ved at påføre det korrekte reages, overvåge ikubatiostide og skylle objektglassee mellem de forskellige reageser. Reagesikubatiostidere er forprogrammeret i software til Dako Lik. Der hevises til de passede brugervejledig Dako Automated Lik Platformagåede yderligere oplysiger. Kotrastfarvig (vejledig til hæmatoxyli) Kotrastfarvig med hematoxyli udføres på de automatiserede Lik-platform ved at vælge ER/PR pharmdx-protokolle, som ideholder dette tri. Alterativt, kotrastfarvig ka udføres mauelt efter objektglassee er fjeret fra Automated Lik Platform. Det farvede slutprodukt fra farvigsreaktioe er uopløseligt i alkohol og vad. Hæmatoxyli, ete alkohol- eller vadbaseret, såsom Hematoxyli for Automated Lik Platforms (kode SK308), ka avedes. Regressive kotrastfarvestoffer må ikke bruges. BEMÆRK: Stærk kotrastfarvig ka maskere e svag ER- eller PR-udtrykig. Vejledig til mauel kotrastfarvig med hematoxyli: TRIN 1. Nedsæk objektglassee i et hæmatoxyli-bad. Der ikuberes i 1 5 miutter, afhægig af styrke af de avedte hæmatoxyli. TRIN 2. Skyl forsigtigt i et bad med vad af reageskvalitet. Sørg for at al resterede hæmatoxyli er fjeret. Moterig Det abefales at avede et ikke-vadbaseret, permaet moterigsmedium. Moterigsmedium, såsom Dako Faramout Moutig Medium, Ready-to-use (kode S3025) eller Dako Glycergel Moutig Medium (kode C0563) ka også bruges. Glycergel gøres flydede ved opvarmig til ca. 40(±5) C ide brug. BEMÆRK: Objektglassee ka aflæses år som helst. Farve ka dog falme e smule, hvis objektglassee forsyes med dækglas med et vadigt moterigsmedium og udsættes for kraftigt lys. Dette ka miimeres ved at objektglassee opbevares mørkt ved stuetemperatur (20 25 C). Kvalitetskotrol Afvigelser fra de abefalede procedurer for vævsfikserig, behadlig og idstøbig på brugeres laboratorium ka medføre, at resultatere varierer betydeligt, hvilket gør det ødvedigt at geemføre regelmæssige kotroller på laboratoriet udover kotrolobjektglassee, der er leveret af Dako. I USA hevises til retigslijere for kvalitetskotrol fra College of America Pathologists (CAP) Certificatio Program for Immuohistochemistry. Se også CLSI Quality Assurace for Immuocytochemistry Approved Guidelie, 15 og referece agåede yderligere oplysiger. ER/PR pharmdx -kotrolobjektglas (medfølger) Hvert af de medfølgede kotrolobjektglas ideholder to pelleterede, formalifikserede, paraffiidstøbte humae cellelijer; ét, der farves med ER- og PR-atistoffer og ét, der ikke farves. Two objektglas skal farves i hver farvigsprocedure; et, der farves med ati- ER.atistofcocktaile og ét med ati-pr-atistoffet. Evaluerige af de af Dako-leverede kotrolobjektglas med cellelijer agiver farvigskørsles validitet. De må ikke avedes som e hjælp til fortolkige af patietresultatere. Positivt kotrolvæv Kotrollere skal være friske biopsi-/kirurgiske præparater, der fikseres, behadles og idstøbes så hurtigt som muligt på samme måde som patietprøve (-prøvere). Positivt kotrolvæv bruges som idikatio for korrekt klargjorte væv og korrekte farvigstekikker. Der skal foretages é positiv vævskotrol for hvert sæt af testbetigelser i hver farvigskørsel. Edocervix abefales som et kotrolvæv, der ideholder både ER- og PR-udtrykkede celler. Vævee, der bruges i de positive vævskotroller, skal give e svag positiv farvig, så små foradriger i det primære atistofs sesitivitet ka detekteres. Kotrolobjektglassee, der leveres samme med dette system, eller præparater, der behadles aderledes ed patietprøve (-prøvere), validerer ku reageseffektivitet og verificerer ikke vævees klargørig. Kedte positive vævskotroller må ku avedes til overvågig af, om de behadlede væv og testreageser fugerer korrekt IKKE som e hjælp til formulerige af e specifik diagose for patietprøvere. Hvis de positive vævskotroller ikke udviser e passede, positiv farvig, skal resultatere fra de aalyserede præparater betragtes som ugyldige. Negativt kotrolvæv Brug egativt kotrolvæv (som vides at være ER- og PR-egativt), der fikseres, behadles og idstøbes på e måde, som svarer til patietprøve (-prøvere), i hver farvigskørsel for at verificere specificitete af det primære atistof og for at idicere utilsigtet krydsreaktivitet mod celler/cellekompoeter. De mage forskellige celletyper, der fides i de fleste vævssit, ideholder itere, egative kotrolsteder (dette skal kotrolleres af brugere). Hvis det egative kotrolvæv udviser specifik farvig, skal resultatere fra patietpræparatere betragtes som ugyldige, og teste skal getages. Uspecifik egativt kotrolreages Brug det medfølgede egative kotrolreages i stedet for det primære atistof samme med et sit af hvert patietpræparat med heblik på at evaluere uspecifik farvig og gøre e bedre fortolkig mulig af specifik farvig på atigestedet. Ikubatiosperiode for det egative kotrolreages skal svare til de, der gælder for det primære atistof. ( ) P04072DK_01/SK310/ s. 6/11

7 Verificerig af aalyse Eftersom produktet har været geemgået af FDA (USA), behøver laboratoriere ku at udføre e reproducerbarhedsudersøgelse af e række af itere væv med kedte IHC-effektivitetskarakteristika, der repræseterer kedte positive og egative væv, for at sikre samstemmede resultater ide første avedelse. Se procedurere vedr. kvalitetskotrol, som er beskrevet tidligere i dette afsit af idlægssedle, og kravee til kvalitetskotrol til CAP Certificatio Program for immuohistochemistry og/eller CLSI Quality Assurace for Immuocytochemistry, Approved Guidelie. 15 Disse kvalitetskotrolprocedurer skal getages for hvert yt atistofparti, eller år aalyseparametree ædres. Tumorer med kedte ER- og PR-farvigsitesiteter og egative væv er eget til verificerig af aalyse. Tabel 1: Formålet med daglig kvalitetskotrol Præparat Dako-leverede ER/PR pharmdxkotrolobjektglas. Positiv kotrol (fikseret og behadlet ligesom patietprøve): Væv eller celler med målatige, der skal detekteres (ka fides i patietvæv). De ideelle kotrol er svagt positivt farvede væv af hesy til følsomhede for atistof- eller atigeedbrydig. Negativ kotrol (fikseret og behadlet ligesom patietprøve): Væv eller celler, der forvetes at være egative (ka fides i patietvæv eller positivt kotrolvæv). Specifikt atistof og detektiossystem Kotrollerer udelukkede farvigsprocedure. Evaluerige af de af Dako- leverede kotrolobjektglas med cellelijer agiver farvigskørsles validitet. Kotrollerer alle tri i aalyse. Validerer reageser og procedurer avedt ved ER/PR-farvig. Detektio af utilsigtet atistofkrydsreaktivitet med celler/cellekompoeter. Negativt kotrolreages (Uspecifikt atistof: Mus IgG 1/IgG 2a) og detektiossystem Detektio af uspecifik baggrudsfarvig. Detektio af uspecifik baggrudsfarvig. Patietvæv. Detektio af specifik farvig. Detektio af uspecifik baggrudsfarvig. Fortolkig af farvig E patolog skal evaluere objektglassee ved hjælp af et lysmikroskop. Alle evalueriger skal baseres på præparatets tumorsektio. E objektiv forstørrelse på 10x eller 20x er veleget til evaluerig af de immucytokemiske farvig og scorig. Aved itakte celler til fortolkig af farvigsresultatere; ekrotiske eller degeererede celler farves ofte uspecifikt. 15 ER/PR pharmdx farver cellekerer ved avedelse af ati-er og ati-pr. Immufarvigsmøsteret i brystkræft er ormalt heteroget. Grade baseres på udersøgelse af alle tumorceller på objektglasset. E delfarvigsgrad (proportio score = PS) tildeles, som repræseterer et estimeret atal af positivt farvede celler (se figur 1). E itesitetsfarvigsgrad (itesity score = IS) tildeles, som repræseterer e estimeret GENNEMSNITLIG farvigsitesitet af positive celler. E samlet farvigsgrad (total score = TS) udreges fra summe af PS og IS (i området fra 0, 2 8). Et positivt resultat for både ER og PR defieres som TS 3, hvilket er valideret i adskillige omfattede kliiske forsøg. 5-8 Positive og egative cellelijer medfølger i hvert ER/PR pharmdx til validerig af farvigskørsler, hver gag aalyse udføres. Hesigtsmæssig farvig af kotrolcellelijere viser, at ER/PR pharmdx-aalyse fugerer korrekt. Hvis de positive kotrolcellelijes farvigsitesitet er for lav eller for høj, ka et fejlagtigt egativt eller fejlagtigt positivt resultat opås, og aalyse skal getages. Referecebilleder ka ses i ER/PR pharmdx -fortolkigsguide. E farvigskørsel kvalificeres, år cellefarvigsitesitete af cellelijekotrolglassee opfylder edeståede kriterier: Tabel 2: Acceptkriterier for positive cellelijekotroller ER-kotrol cellelijegrad PR-kotrol cellelijegrad Itesitetsgrad (baseret på 0 3 skale) Negative cellelijekotroller må ikke udvise ukleær farvig. ( ) P04072DK_01/SK310/ s. 7/11

8 Figur 1: Allred Retigslijer for farvigsgrad ER/PR pharmdx Farvigsvejledig ( Allred Score ) modificeret og brugt med tilladelse fra D.C. Allred, M.D. 6 Tabel 3: Beskrivelse af farvigsgrad Delfarvigsgrad PS-observatio (PS) (del af tumorceller med positiv ukleær farvig) Itesitetsfarvigsgrad (IS) (geemsitlig itesitet for alle positive tumorceller) IS-observatio 0 Ige 0 Ige 1 >0 til 1/100 1 Svag 2 >1/100 til 1/10 2 Mellem 3 >1/10 til 1/3 3 Kraftig 4 >1/3 til 2/3 5 >2/3 til 1 Tabel 4: Farvigsvejleig Total farvigsgrad (TS) Fortolkig (summe af delfarvigsgrad og itesitetsfarvigsgrad) 0, 2 Negativ 3 Positiv Der hevises til Dako ER/PR pharmdx -fortolkigsguide agåede detaljerede retigslijer for farvigsevaluerig. Begræsiger Geerelle begræsiger 1. IHC er e diagostisk proces i flere tri, der kræver specialuddaelse i udvælgelse af passede reageser, i udvælgelse af væv, fikserig og behadlig, i klargørig af IHC-objektglas; samt i fortolkig af farvigsresultatere. 2. Vævsfarvig afhæger af hådterige og behadlige af vævsprøvere ide farvige. Ukorrekt fikserig, edfrysig, optøig, vask, tørrig, opvarmig, skærig eller kotamierig med adre vævsprøver eller væsker ka medføre artefakter, atistof-trappig eller falsk egative resultater. Uoveresstemmede resultater ka skyldes forskelle i fikserigs- og idstøbigsmetoder eller uregelmæssigheder i selve vævet. 3. For meget eller ufuldstædig kotrastfarvig ka påvirke e korrekt fortolkig af resultatere. 4. De kliiske fortolkig af e evetuel positiv farvig eller magel på samme skal sammeholdes med morfologiske og histologiske udersøgelser med korrekte kotroller. Evaluerigere skal foretages i relatio til patietes kliiske forhistorie og adre diagostiske aalyser af e kvalificeret perso. Farvige skal udføres på et certificeret laboratorium uder overvågig af e patolog, som er asvarlig for geemgage af de farvede objektglas og sikrig af, at de positive og egative kotroller er tilstrækkelige. 5. Vævsprøver fra persoer, som er ificerede med hepatitis B-virus, og som ideholder hepatitis B-overfladeatige (HBsAg), ka udvise uspecifik farvig med peberrodsperoxidase. 20 ( ) P04072DK_01/SK310/ s. 8/11

9 6. Reageser ka udvise uvetede reaktioer i vævstyper, der ikke tidligere blev testet. Mulighede for uvetede reaktioer selv i testede vævsgrupper ka ikke fuldstædig elimieres på grud af de biologiske variabilitet, der er forbudet med atige-ekspressio i eoplasmer eller adet patologisk væv. 19 Kotakt Dakos tekiske serviceafdelig med dokumeterede uvetede reaktioer. 7. Falsk positive resultater ka forekomme på grud af ikke-immuologisk bidig af proteier eller substratreaktiosprodukter. De ka også skyldes pseudoperoxidaseaktivitet (erytrocytter) og edoge-peroxidaseaktivitet (cytochrom C) Reagesere og vejledige i dette system er udviklet til optimal ydelse. Yderligere fortydig af reageser eller ædrig af ikuberigstidere eller temperaturere ka give fejlagtige eller uoveresstemmede resultater. Produktspecifikke begræsiger 1. Falsk egative resultater ka skyldes edbrydig i e periode af atigeet i vævee. Præparatere skal farves ide 2 måeder efter, at vævee er moteret på objektglas, år de opbevares ved stuetemperatur For at opå optimale og reproducerbare resultater, kræver ER- og PR-proteiere epitop-gefidig, år vævee rutiemæssigt fikseres (eutral bufferet formali) og paraffiidstøbes. 3. Udskift ikke med reageser fra adre lotumre i dette produkt eller fra adre produceter. De eeste udtagelse er vaskebuffere, som ka erstattes med Dako Wash Buffer, kode S Farvede kotrolcellelijer skal avedes udelukkede til validerig af farvigskørsle og ikke til bedømmelse af farvigsreaktioe i vævssit. 5. Avedelse af Dako ER/PR pharmdx på væv med adre fiksativer ed formali er ikke valideret. Produktegeskaber Specificitet Klo 1D5 og klo ER blev fremstillet i BALB/c mus ved hjælp af rekombiat estrogereceptor (RER), et protei med molekylmasse på 67 kd. 21 Epitop-mappig af de to atistoffer i dee ER-cocktail agiver e bidig til amiosyresekves i N-termiale for klo R (regio A) og e bidig til amiosyresekves for klo 1D5 (regio B). Klo PgR 1294 blev holdt over for formalifikseret, rekombiat, fuldlægde A-form af huma PR. 22 Atistoffet gekeder specifikt A- og B- formere af receptore ved Wester-blottig af reset, rekombiat receptor, ormalt edometrium og cellelysater af T-47D cellelije, som vides at ideholde e høj PR-kocetratio. Der blev ikke observeret krydsreaktivitet med adrogereceptor, ER- eller glukokortikoidreceptor. Udersøgelser med epitop-mappig har påvist, at atistoffer bides til e epitop, der fides mellem aa 165 og 534 i N-termial-trasaktiverigsdomæet. 22 Kokordasudersøgelse E pilotudersøgelse på et sæt med 20 væv blev udført til at sammelige forskellige aalyseprocedurer og atistoffer med Allredprocedure. Aalyseprocedure og atistoffere, der frembragte de aalyseresultater, som lå tættest ved Allred-procedure, blev udvalgt til yderligere afprøvig. 9 Validitete af aalyseprocedure og udvælgelse/fortydig af atistof blev afprøvet på et sæt præparater samlet i serier af væv. Afprøvige bestod af farvig og evaluerig af præparatere med Allred-procedure som referece sammeliget med farvigsprocedure fortolket ved hjælp af Allred-metode for farvigsgrad. Fordelige af farvigsresultatere til positiv/egativ bestemmelse fides i tabel 5 og 6 for hhv. ER og PR. Kokordas med Allred-metode for positiv/egativ hormoreceptorresultat var 99% for hver receptor. 9 Tabel 5: 2x2 tabel over Dakos ER-testresultater sammeliget med Allred-procedures ER-testresultater Tabel 6: 2x2 tabel over Dakos PR-testresultater sammeliget med Allred-procedures PR-testresultater Allred-procedures ER-testresultat Allred-procedures PR-testresultat Dakos ER-testresultat Positiv Negativ I alt Positiv Negativ I alt Dakos PR-testresultat Positiv Negativ I alt Positiv Negativ I alt Positiv esartethed = 158/160 = 0,9875 Negativ esartethed = 52/52 = 1,0 Kokordas var 210/212=0,9906. Kappa-statistikke blev udreget som 0,9748, med e 95% Cl på 0,9402-1,0095. Positiv esartethed = 128/130 = 0,9846 Negativ esartethed = 74/74 = 1,0 Kokordas var 202/204=0,9902. Kappa-statistikke blev udreget som 0,9789, med e 95% Cl på 0,9498-1,0080. ( ) P04072DK_01/SK310/ s. 9/11

10 Reproducerbarhed Reproducerbarhedsudersøgelse blev udført, der omfattede "Itra-ru" (idefor farvigskørsel) og "Iter-ru" (mellem laborater og dage). Farvigsitesitete forblev ide for e itesitetsgrad på 0,5 for hvert væv i de farvigskørsler, der blev udført. Immureaktivitet E oversigt over ER/PR pharmdx-immureaktivitete på det abefalede udvalg af ormalt væv vises i tabel 7. Alt væv blev formalifikseret og paraffiidstøbt. Tabel 7: Evaluerig af farvig af ormalt væv med Dako ER/PR pharmdx Vævstype (atal aalyser) Farvigsitesitet Vævstype (atal aalyser) Farvigsitesitet Farvet vævselemeter ER PR Farvet vævselemeter ER PR Biyre (3) Ige Ige Parathyreoidea (3) Ige Ige Koglemarv (3) Ige Ige Perifere erver (3) Ige Ige Bryst (3) Duktale epitelceller 3,3,3 3,3,3 Pituitary (3) Pituicytter 0,1,3 1,2,3* Hjere/cerebellum (3) Ige Ige Prostata (3) Stromaceller 1,1,2 0,2,2 Hjere/cerebrum (3) Ige Ige Spytkirtel (3) Ige Ige Livmoderhals (3) Basalepitel 2,3,3 Ige Skeletmuskulatur (3) Ige Ige Stromaceller 1,3,3 2,3,3 Kolo (3) Ige Ige Hud (3) Ige Ige Spiserør (3) Ige Ige Tydtarm (3) Muscularis propria Ige 0,0,2 Hjerte (3) Ige Ige Milt (3) Ige Ige Nyre (3) Ige Ige Mave (3) Ige Ige Lever (3) Ige Ige Testikler (3) Ige Ige Luge (3) Ige Ige Thymus (3) Ige Ige Mesoteliale celler (3) Ige Ige Skjoldbruskkirtel (3) Ige Ige Æggestok (3) Overfladeepitel Stromaceller 0,0,2 Ige 0,3,3 0,3,3 Madel (3) Ige Ige Bugspytkirtel (3) Ø-celler* Ige 1,3,3 Livmoder (3) Edometriekirtler Edometriestroma Myometrium Alle objektglas blev udelukkede bedømt for itesitet på e skala fra 0 3. Nukleær farvig *Nucleær og cytoplasmisk farvig Fejlfidig ( ) P04072DK_01/SK310/ s. 10/11 2,3,3 2,2,3 2,3,3 3,3,3* 3,3,3 3,3,3 Problem Mulig årsag Forslag til afhjælpig 1. Ige farvig af objektglas. 1a. Programmerigsfejl. Reagesere avedes ikke i de korrekte rækkefølge. 2. Svag farvig af objektglas eller af positive cellelijer på kotrolobjektglas. 3. For mege baggrudsfarvig af objektglas. 1a. Kotrollér logførige for objektglassee for at kotrollere om det rigtige program blev valgt. 1b. Natriumazid i vaskebufferbadet. 1b. Brug udleveret vaskebuffer eller Dako Wash Buffer, (kode S3006). 2a. Utilstrækkelige reagesikubatiostider. 2a. Kotrollér logførige for objektglassee for at bekræfte, at ikubatiostidere er korrekte. 2b. Ueget fikserigsmetode avedt. 2b. Sørg for, at der ku avedes godkedte fikserigsvæsker og -metoder. 2c. Utilstrækkelig epitop-gefidig. 2c. Kotrollér, at trykkogere fugerer korrekt, og at epitopgefidigsprocedure blev fulgt korrekt. (Lave temperaturer og/eller forkert tid vil bevirke svag farvig.) 2d. Maglede reaktio med DAB+substrat-kromogeopløsig 2d. Sørg for, at DAB+-substrat-krromogeopløsig blev udarbejdet korrekt. 2e. Nedbrydig af kotrolobjektglas. 2e. Kotrollér udløbsdatoe og opbevarigsbetigelsere, som er trykt på pakkes etiket. 3a. Paraffie er ikke helt fjeret. 3a. Brug friske reseopløsiger, og følg procedure, der er beskrevet i afsittet Afparaffierig og rehydrerig. 3b. Additiver blev avedt ved moterige af væv på objektglas. 3c. Objektglassee er ikke skyllet ordetligt. 3b. Udgå at avede additiver til at hæfte vævssittee på objektglassee. Mage additiver er immureaktive 3c. Kotrollér logførige for objektglassee for at bekræfte, at de blev skyllet ordetligt. 3d. Sittee er tørret ud uder farvige. 3d. Kotrollér, om der blev avedt de rette mægde reages til objektglassee.

11 Problem Mulig årsag Forslag til afhjælpig 3e. Objektglassee er tørret ud uder 3e. Sørg for, at objektglassee holdes våde med buffer uder idførige i Automated Lik-platform. idførig, og ide kørsle igagsættes. 4. Vævet løser sig fra objektglasset. 3f. Uspecifik reagesbidig til vævssittet. 3f. Kotrollér, om præparatet er fikseret korrekt, og/eller om der er ekrose til stede. 4a. Der er brugt forkerte objektglas. 4a. Brug objektglas med salie såsom Dako Silaized Slides (kode S3003) eller opladede objektglas (Fisher SuperFrost Plus). 5. For kraftig specifik farvig. 5a. Ueget fikserigsmetode avedt. 5a. Sørg for, at der ku avedes godkedte fikserigsvæsker og -metoder. 5b. For lage reagesikubatiostider. 5b. Kotrollér logførige for objektglassee for at bekræfte, at ikubatiostidere er korrekte. 5c. Der er avedt e ueget vaskebuffer. 5c. Brug udleveret vaskebuffer eller Dako Wash Buffer, (kode S3006). BEMÆRK: Se afsittet i Fejlfidig i Dako Educatio Guide: Immuohistochemical Staiig Methods 14, Atlas of Immuohistology 19 eller Immuoperoxidase Techiques. A Practical Approach to Tumor Diagosis. 16 Kotakt Dako Techical Support for at rapportere usædvalig farvig. Referecer 1. Elledge RM, Fuqua SAW. Estroge ad progesteroe receptors. I: Harris, et al, editors. Diseases of the Breast. Philadelphia: Lippicott, Williams & Wilkis, p Fitzgibbos PL, Page DL, Weaver D, Thor AD, Allred DC, Clark GM, et al. Progostic factors i breast cacer. College of America Pathologists Cosesus Statemet Arch Pathol Lab Med. 2000;124: Bardou VJ, Arpio G, Elledge RM, Osbore CK, Clark GM. Progesteroe receptor status sigificatly improves outcome predictio over estroge receptor status aloe for adjuvat edocrie therapy i two large breast cacer databases. J Cli Ocol. 2003;21: Rhodes A, Jasai B, Balato AJ, Miller KD. Immuohistochemical demostratio of oestroge ad progesteroe receptors: correlatio of stadards achieved o i house tumours with that achieved o exteral quality assessmet material i over 150 laboratories from 26 coutries. J Cli Pathol. 2000;53: Elledge RM, Gree S, Pugh R, Allred DC, Clark GM, Hill J, et al. Estroge receptor (ER) ad progesteroe receptor (PgR), by ligadbidig assay compared with ER, PgR ad ps2, by immuo-histochemistry i predictig respose to tamoxife i metastatic breast cacer: a Southwest Ocology Group Study. It J Cacer. 2000;89: Allred DC, Harvey JM, Berardo M, Clark GM. Progostic ad predictive factors i breast cacer by immuohistochemical aalysis. Mod Pathol. 1998;11: Harvey JM, Clark GM, Osbore CK, Allred DC. Estroge receptor status by immuohistochemistry is superior to the ligad-bidig assay for predictig respose to adjuvat edocrie therapy i breast cacer. J Cli Ocol. 1999;17: Mohsi SK, Weiss H, Havighurst T, Clark GM, Berardo M, Roah le D, et al. Progesteroe receptor by immuohistochemistry ad cliical outcome i breast cacer: a validatio study. Moder Pathol. 2004;17: Phillips T, Murray G, Wakamiya K, Askaa J, Huag D, Welcher R, Pii K, Allred DC. Developmet of stadard estroge ad progesteroe receptor immuohistochemical assays for selectio of patiets for atihormoal therapy. Appl Immuohistochem Mol Morphol. 2007;15: Cliical ad Laboratory Stadards Istitute (formerly NCCLS). Protectio of laboratory workers from occupatioally acquired ifectios; approved guidelie Third editio. CLSI documet M29-A3 (ISBN ). CLSI, 940 West Valley Road, Suite 1400, Waye, Pesylvaia USA Cliical Laboratory Improvemet Amedmets of 1988: Fial Rule, 57 FR7163, February 28, Sheeha DC, Hrapchak BB. Theory ad practice of histotechology. St. Louis: Mosby; Kiera JA. Histological ad histochemical methods: Theory ad practice. New York: Pergamo Press; Key M (ed). Educatio Guide: Immuohistochemical Staiig Methods. Fourth Editio. Dako Cliical ad Laboratory Stadards Istitute (formerly NCCLS). Quality assurace for immuocytochemistry; Approved guidelie. CLSI documet MM4-A ( ) CLSI, 940 West Valley Road, Suite 1400, Waye, Pesylvaia USA Nadji M, Morales AR. Immuoperoxidase techiques. A practical approach to tumor diagosis. Chicago: Amer Soc Cli Pathol Press Elias JM, Gow AM, Nakamura RM, Wilbur DC, Herma GE, Jaffe ES, et al. Quality cotrol i immuohistochemistry. Report of a workshop sposored by the Biological Stai Commissio. Amer J Cli Pathol. 1989;92: Herma GE, Elfot EA. The tamig of immuohistochemistry: the ew era of quality cotrol. Biotech Histochem. 1991;66: Tubbs RR, Gephardt GN, Petras RE. Specime processig ad quality assurace. I: Atlas of immuohistology. Chicago: Amer Soc Cli Pathol Press; p Omata M, Liew CT, Ashcavai M, Peters RL. Noimmuologic bidig of horseradish peroxidase to hepatitis B surface atige: A possible source of error i immuohistochemistry. Amer J Cli Pathol. 1980;73: Al Saati T, Clames S, Cohe-Kafo E, Faye JC, Prats H, Coidre JM, et al. Productio of moocloal atibodies to huma estroge receptor protei (ER) usig recombiat ER (RER). It J Cacer 1993;55(4): Press M, Spauldig B, Groshe S, Kamisky D, Hagerty M, Sherma L, Christese K, Edwards DP. Compariso of differet atibodies for detectio of progesteroe receptor i breast cacer. Steroids. 2002;67: Udgave 06/15 ( ) P04072DK_01/SK310/ s. 11/11